李文登，李超群，胡 旺，徐 凱，龐明泉，乜 茹，馮浩杰，張占紅，劉處處，樊海寧

青海大學(xué)附屬醫(yī)院 肝膽胰外科，青海省包蟲病重點實驗室，西寧 810000

多房棘球蚴病(alveolar echinococcosis，AE)又稱泡型包蟲病，是由多房棘球蚴絳蟲(echinococcus multilocularis，Em)的幼蟲通過感染動物傳染給人類的一種人畜共患病，在世界范圍內(nèi)造成嚴(yán)重的健康問題，特別是在資源有限的地區(qū)或國家[1]，目前被世界衛(wèi)生組織列為被忽視的熱帶病[2]。AE主要侵犯肝臟，是一種慢性、破壞性的臨床疾病，其生長特征是Em向鄰近器官和組織進(jìn)行性浸潤性增殖，類似于轉(zhuǎn)移性腫瘤，晚期可轉(zhuǎn)移至身體的其他部位，如不及時治療，病死率極高[2-3]。Em之所以能夠長期寄生在宿主體內(nèi)是其進(jìn)化成一套完整的免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫微環(huán)境，達(dá)到長期寄生的目的。樹突狀細(xì)胞(DC)是體內(nèi)最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞，在寄生蟲感染的免疫應(yīng)答和免疫耐受過程發(fā)揮著重要的作用。前期的研究表明[4-5]感染Em的患者體內(nèi)DC的成熟度降低，抑制抗原信號的遞呈，機(jī)體內(nèi)的初始T淋巴細(xì)胞(naive T cell,Tn)不能分化和增殖，因此達(dá)不到清除病原體的作用，但具體是Em中哪種物質(zhì)影響DC的表型和功能還不明確。本研究通過建立脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞(BMDC)的炎癥模型，檢測不同濃度Em的分泌物抗原(Echinococcus multilocularis secreted antigen，Em-sAg)干預(yù)BMDC后，BMDC表達(dá)的主要組織相容性抗原復(fù)合體Ⅱ(major histocompatibility complex class Ⅱ,MHC-Ⅱ)、共刺激分子CD80、CD86及IL-12p70分泌情況，初步探討Em-sAg對LPS誘導(dǎo)的BMDC的表型和功能的影響，為闡明Em的長期寄生宿主體內(nèi)及其致病機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6～8周齡SPF級健康C57BL/6J雄性小鼠和BALB/C雄性小鼠分別購自北京華阜康生物科技股份有限公司[生產(chǎn)許可證編號：SCXK(京)2019-0008]和斯貝福(北京)生物科技有限公司[生產(chǎn)許可證編號：SCXK(京)2019-0010]，實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)(實驗動物使用許可證分別為110322200101999818和110324210101017771)。

1.2 主要試劑及儀器 小鼠重組粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)購自美國PeproTech公司，RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清(FBS)購自美國BI公司，LPS購自美國Sigma公司。異硫氰酸熒光素 (fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的抗 CD80 抗體(CD80-FITC)、藻紅蛋白 (phycoerythrin，PE )標(biāo)記的抗CD86抗體(CD86-PE)、別藻藍(lán)蛋白(allophycocyanin，APC)標(biāo)記的抗主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ(major histocompatibility complex Ⅱ，MHC-Ⅱ)抗體(MHC-Ⅱ-APC)均購自美國Thermo公司，PerCP-Cy5.5-CD11c購自TONBO公司。IL-12p70 ELISA試劑盒購自欣博盛科技有限公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒購自美國Thermo公司，磷酸鹽緩沖液(PBS)購自塞維爾科技有限公司，青/鏈霉素購自索萊寶科技有限公司。超凈工作臺購自蘇州凈化設(shè)備有限公司，流式細(xì)胞儀購自BD公司，正倒置熒光顯微鏡購自ECHO公司。

1.3 Em-sAg的獲取及其濃度測定 將本實驗室保存的蒙古沙鼠(長爪沙鼠)脫臼斷頸處死，浸泡于75%乙醇10 min，無菌超凈臺上逐層解剖皮膚、肌肉組織，分離出腹腔內(nèi)AE病灶組織，用無菌PBS進(jìn)行沖洗2～3次，使用80目的濾網(wǎng)進(jìn)行過濾去除組織碎片，并用0.4% 臺盼藍(lán)染色3 min，倒置相差顯微鏡下觀察原頭節(jié)活性和數(shù)量，并以2000枚原頭節(jié)/只接種于30只小鼠BALB/C小鼠。3個月后將小鼠脫臼猝死，用1 mL的注射器抽取囊泡內(nèi)的液體，用0.22 μm的無菌濾頭進(jìn)行過濾除菌，再用BCA蛋白定量法進(jìn)行濃度測定，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 小鼠BMDC的提取 按照文獻(xiàn)[6]所述，將C57BL/6J小鼠頸椎脫臼法處死，無菌手術(shù)取出所有的股骨和脛骨，超凈臺中用1 mL注射器沿骨髓腔沖出骨髓前體細(xì)胞，并用200目尼龍網(wǎng)進(jìn)行過濾去除組織碎片，用含有1%青鏈霉素、10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，同時加入200 U/mL重組小鼠GM-CSF，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分別于第3天進(jìn)行補(bǔ)液10 mL、第6天和第8天分別半量換液，第10天收集細(xì)胞，即為BMDC。用正倒置熒光顯微鏡觀察 BMDC的形態(tài)變化。

1.5 BMDC的鑒定 用500 μL PBS重懸收集的BMDC，向流式管中加入0.625 μL PerCP-Cy5.5-CD11c抗體，同時設(shè)置不加抗體的空白組，使用BD流式細(xì)胞儀檢測CD11c分子表達(dá)水平。

1.6 分組 收集培養(yǎng)的細(xì)胞，使用不含GM-CSF的10%FBS培養(yǎng)液稀釋至1×106/mL，接種24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分組如下：Control組(加入等體積RPMI1640完全培養(yǎng)基)、陽性對照組，即LPS組(加入濃度為1 μg/mL的LPS)、LPS+3 mg/mL Em-sAg組、LPS+1.5 mg/mL Em-sAg組、LPS+0.75 mg/mL Em-sAg組、LPS+0.375 mg/mL Em-sAg組，作用24 h后，用1 mL PBS洗2次，分別向不同干預(yù)組中的流式管中加入0.625 μL PE-CD86、FITC-CD80、APC-MHC-Ⅱ、PerCP-Cy5.5-CD11c抗體，同時設(shè)置不加抗體的空白組，用BD流式細(xì)胞儀檢測CD11c、CD80、CD86、MHC-Ⅱ分子表達(dá)水平。

1.7 細(xì)胞因子的檢測 收集不同濃度Em-sAg作用BMDC 24 h后的上清液，參考IL-12p70試劑盒說明書，通過酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測上清液中IL-12p70的含量，每個樣本設(shè)立 3個復(fù)孔，通過波長450 nm進(jìn)行檢測，所有檢測重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 原頭節(jié)活性檢測 將無菌提取的原頭節(jié)用0.4% 臺盼藍(lán)進(jìn)行染色3 min，計數(shù)后得出數(shù)量在95%以上，活性良好，可用于動物造模(圖1)。

圖1 原頭節(jié)活性檢測

2.2 Em-sAg的提取 無菌超凈臺中用1 mL的注射器抽取病灶內(nèi)空泡中的液體，即為Em-sAg。

2.3 小鼠BMDC的生長形態(tài)變化特點 從C57BL/6J小鼠骨髓腔內(nèi)收集的細(xì)胞即為骨髓細(xì)胞，呈現(xiàn)單個核細(xì)胞，均勻圓形，細(xì)胞邊界光滑，均勻懸浮于培養(yǎng)基中(圖2a)，培養(yǎng)至第3天，細(xì)胞呈現(xiàn)貼壁生長，體積逐漸增大，細(xì)胞膜表面可見少量毛刺樣突起(圖2b)，第6天時，細(xì)胞由貼壁生長轉(zhuǎn)為半懸浮狀態(tài)生長，體積進(jìn)一步增大，表面毛刺樣突起進(jìn)一步增加(圖2c)，第8～10天時，大部分細(xì)胞表面的可見毛刺樣突起，細(xì)胞由半懸浮狀態(tài)轉(zhuǎn)為完全懸浮狀態(tài)，即為較成熟的DC(圖2d、e)，與相關(guān)文獻(xiàn)[7-8]中報道的未成熟的BMDC相符。

注：a，第0天(×20)；b，第3天(×20)；c，第6天(×20);d，第8天(×20)；e，第10天(×20)。

2.4 BMDC純度鑒定 收集小鼠BMDC，用PerCP-Cy5.5-CD11c進(jìn)行染色，并進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，其CD11c的陽性率在70%以上，且每次純度檢測都在70%以上，說明此方法培養(yǎng)可以得到較純的BMDC，符合實驗要求(圖3)。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)鑒定BMDC的純度

2.5 Em-sAg抑制DC表面分子的表達(dá) DC是體內(nèi)最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞，且在體內(nèi)多為未成熟狀態(tài)的DC，受到外界抗原(如LPS、TNFα等)的刺激后，由未成熟狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒鞝顟B(tài)。為研究Em-sAg對LPS誘導(dǎo)的BMDC成熟度及抗原提呈能力的影響。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度Em-sAg與LPS共培養(yǎng)后，其表面分子MHC-Ⅱ、CD80、CD86的表達(dá)情況。多組間單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，LPS組表面的細(xì)胞分子CD80、CD86、MHC-Ⅱ均顯著增加(P值均<0.05)；與陽性對照組相比，LPS+3 mg/mL Em-sAg組、LPS+1.5 mg/mL Em-sAg組、LPS+0.75 mg/mL Em-sAg組、LPS+0.375 mg/mL Em-sAg組中BMDC的 CD80顯著減少(P值均<0.05)，多組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=34.870，P<0.001)；LPS+3 mg/mL Em-sAg組、LPS+1.5 mg/mL Em-sAg組、LPS+0.75 mg/mL Em-sAg組、LPS+0.375 mg/mL Em-sAg組中BMDC的 CD86、MHC-Ⅱ無明顯減少(P值均>0.05)(圖4)。

2.6 Em-sAg抑制炎癥因子IL-12p70的釋放 為進(jìn)一步評價不同濃度Em-sAg對LPS誘導(dǎo)的BMDC功能的影響，通過ELISA試劑盒檢測Em-sAg聯(lián)合LPS誘導(dǎo)DC后分泌的IL-12的水平。結(jié)果顯示，不同組間的IL-12的水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=73.140，P<0.05)。與Control組相比，LPS組刺激后IL-12p70的表達(dá)量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與陽性對照組相比，LPS+3 mg/mL Em-sAg組、LPS+1.5 mg/mL Em-sAg組、LPS+0.75 mg/mL Em-sAg組、LPS+0.375 mg/mL Em-sAg組均可降低IL-12p70的表達(dá)量(P值均<0.05)，且Em-sAg濃度越高，降低促炎癥因子IL-12p70表達(dá)量越明顯(圖5)。

注：a，流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度的Em-sAg干預(yù)LPS誘導(dǎo)的BMDC的MHC-Ⅱ、CD80、CD86表達(dá)量；b，MHC-Ⅱ、CD80、CD86分子表達(dá)的定量分析。與Control組相比，*P<0.05；與陽性對照組相比，**P<0.05。

注：與Control組相比，*P<0.05；與陽性對照組相比，**P<0.05。

3 討論

-AE是一種人畜共患寄生蟲病，其中Em是該病的致病原。全球估計每年新增感染病例17 400例，危害極其嚴(yán)重[2,9]。Em以犬類為終宿主，以嚙齒動物為中間宿主，人類多因誤入被Em感染的水源或食物而感染[10]。AE具有全球性分布的特點，主要分布于北半球，超過90%的AE的分布于我國西北一帶，包括青海、寧夏、新疆[11]等地，對當(dāng)?shù)氐男竽翗I(yè)和經(jīng)濟(jì)帶來沉重負(fù)擔(dān)[2,12-13]。AE就診時多屬于晚期，錯過最佳的治療時機(jī)，治療方式多以外科手術(shù)和長期口服阿苯達(dá)唑治療為主，效果不理想?，F(xiàn)有報道[14-15]表明，免疫治療在改善寄生蟲病方面的作用越來越明顯，因此研究Em的免疫感染機(jī)制可為新的治療方式提供理論基礎(chǔ)。

DC是連接固有免疫和適應(yīng)性免疫的重要橋梁，被認(rèn)為是最有效的抗原遞呈細(xì)胞。當(dāng)機(jī)體受到外界抗原刺激時(如病毒、細(xì)菌、微生物、寄生蟲等)，未成熟的DC能夠吞噬、加工、分化成熟，將抗原信號呈遞給Tn，誘導(dǎo)其活化和增殖，進(jìn)而發(fā)揮機(jī)體免疫應(yīng)答的效應(yīng)[16]。研究[17-18]證實，細(xì)粒棘球蚴囊液和Em囊液均具有上調(diào)BMDC表面吲哚胺 2，3-雙加氧酶表達(dá)的能力，繼而誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的“失能”,使機(jī)體獲得免疫耐受。為進(jìn)一步探索Em感染宿主免疫耐受方面的機(jī)制研究，本研究選取Em-sAg作為刺激物抗原，通過和LPS誘導(dǎo)的BMDC共同作用探究Em-sAg的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Em-sAg可以抑制LPS誘導(dǎo)的BMDC的抗原遞呈功能，與濃度無關(guān)，并初步探討了共培養(yǎng)后上清中促炎癥因子IL-12在感染過程中可能發(fā)揮的作用。

Tn的活化需要第一信號和第二信號的共同參與，即MHC-Ⅱ分子和共刺激分子(CD80、CD86)，且DC的這些表面分子的表達(dá)量與細(xì)胞的抗原遞呈能力成正比。研究[19-20]表明，細(xì)粒棘球蚴的抗原B可下調(diào)DC表面的 MHC-Ⅱ及CD86、CD80分子，誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的“無能”。本研究也得出相同的結(jié)果，表明不同濃度的Em-sAg均可抑制LPS誘導(dǎo)的BMDC表面分子CD80的表達(dá)，進(jìn)而抑制其抗原提呈能力。

現(xiàn)有研究[21]表明，成熟狀態(tài)的DC產(chǎn)生的IL-12可誘導(dǎo)Tn分化為1型輔助T淋巴細(xì)胞，后者可分泌IFNγ、IL-2等細(xì)胞因子介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，有助于機(jī)體免疫系統(tǒng)對外界抗原的清除。本研究主要檢測Em-sAg對LPS誘導(dǎo)的BMDC(LPS誘導(dǎo)的BMDC即為成熟狀態(tài)的DC)所分泌細(xì)胞因子的變化，結(jié)果顯示不同濃度的Em-sAg均可抑制BMDC所分泌的IL-12p70的表達(dá)，且Em-sAg的濃度越高，抑制分泌IL-12p70的程度就越明顯。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Em-sAg降低LPS誘導(dǎo)的BMDC表面分子CD80表達(dá)，并抑制IL-12p70的分泌。這些研究結(jié)果將為闡明Em持續(xù)感染和致病機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)，并為后續(xù)新藥靶位的發(fā)現(xiàn)和疫苗研制提供理論和實驗依據(jù)。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2019年6月12日經(jīng)由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審批通過，批號：20190531-03，符合實驗室動物管理與使用準(zhǔn)則。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：李文登、樊海寧、胡旺負(fù)責(zé)課題設(shè)計，修改論文；李文登、龐明泉負(fù)責(zé)撰寫論文；龐明泉、徐凱、李超群、劉處處、乜茹、馮浩杰、張占紅參與收集、分析數(shù)據(jù)；樊海寧、徐凱、劉處處負(fù)責(zé)指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。