黃 龍，陳 煜，吳 橋,2，段鐘平

1 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院 a.肝病中心四科；b.肝衰竭與人工肝治療研究北京市重點實驗室， 北京 100069；2 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院 感染中心，北京 100070

藥物性肝損傷(drug-induced liver injury，DILI)是臨床常見的藥物不良反應(yīng)，是藥物研發(fā)失敗和撤市的重要因素，膽汁淤積型和混合肝細(xì)胞/膽汁淤積型損傷構(gòu)成DILI的兩種主要亞型，可能占所有DILI病例的50%[1]，藥物引起的膽汁淤積臨床可表現(xiàn)為瘙癢、乏力、尿色加深和黃疸等[2]。目前，膽汁淤積的臨床治療缺乏有效的藥物，僅有熊去氧膽酸和奧貝膽酸是可用于臨床且公認(rèn)有一定療效的藥物，但其治療效果有限、個體差異大，且對于藥物引起的膽汁淤積的治療效果不理想。因此，開發(fā)新的膽汁淤積型肝損傷治療藥物十分必要，同時中藥在改善藥物引起的膽汁淤積(drug induced cholestatic，DIC)的作用方面受到越來越多的關(guān)注。舒肝寧注射液(Shuganning injection,SGN)是以茵陳提取物、梔子提取物、黃芩苷、板藍(lán)根提取物、靈芝提取物為原料，經(jīng)現(xiàn)代提取、精制而成的中藥注射劑，具有清熱解毒、利濕退黃、益氣扶正、保肝護肝的功效，是臨床上常用的退黃保肝藥物[3]。目前有大量臨床文獻(xiàn)報道其具有保肝和改善肝內(nèi)膽汁淤積的作用，但是其具體的退黃機制尚不明確。

藥物誘發(fā)膽汁淤積的機制是多種多樣的，且存在未知的因素。事實上，除了肝膽轉(zhuǎn)運蛋白[膽汁酸鹽輸出泵(bile salt export pump，BSEP)/多藥耐藥蛋白2(MRP2)]的變化，其他機制例如損壞細(xì)胞骨架、氧化應(yīng)激等因素均可參與膽汁淤積的病理過程[4]。氯丙嗪(CPZ)屬于吩噻嗪類抗精神分裂癥藥物,有研究[5]表明CPZ引起膽汁淤積性肝損傷約占用藥者0.5%～1%，一般在用藥3周內(nèi)出現(xiàn)黃疸，停藥后3個月內(nèi)3/4患者可恢復(fù)。目前有研究[6]證明了CPZ可以抑制法尼醇X受體(FXR)表達(dá)，引起膽汁酸鹽過度生成，同時CPZ是膽鹽輸出泵BSEP的直接抑制劑，可以抑制膽汁酸鹽外排，進(jìn)一步加劇膽汁酸鹽在肝細(xì)胞內(nèi)蓄積。除此之外CPZ引起的氧化應(yīng)激早期可加重膽汁淤積[7]，CPZ所致肝細(xì)胞膽汁淤積的臨床表現(xiàn)、發(fā)病特征，與其他特異質(zhì)肝毒性(ILT)的表現(xiàn)形式一樣，具有不可預(yù)測性、發(fā)生率低等特點[8]。本研究首先建立CPZ致膽汁淤積模型，由于新鮮的人肝細(xì)胞的來源有限，作者使用了表達(dá)1期和2期藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運蛋白的分化人 HepG2細(xì)胞系，并在體外通過對天然獲取的大鼠脫細(xì)胞支架進(jìn)行再細(xì)胞化在體外建立新型3D組織工程(tissue engineering，TE)肝臟，在此基礎(chǔ)之上加入CPZ及膽汁酸鹽混合物(使用時需稀釋1000倍)構(gòu)建DIC模型，分析CPZ治療引起的肝內(nèi)膽汁淤積的特征，探索舒肝寧對CPZ誘導(dǎo)的DIC保護作用。

1 資料與方法

1.1 試劑 DMEM購自賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司；胎牛血清、胰酶、青鏈霉素購自美國Gibco公司；PCR提取試劑盒TaKaRa RNA PCR Kit(AWV)。SGN由貴州瑞和制藥有限公司提供。蠕動泵購自Master-Flex、0.22 μm濾器(millex-GV)、SDC購自VETEC、一次性靜脈留置針(泰爾茂Hybria Ⅱ B型三通)、CCK8試劑盒購自DOJINDO公司、ROS檢測試劑盒(上海碧云天)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒以及谷胱甘肽(GSH)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST/GOT)測試盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT/GPT)測試盒、乳酸脫氫酶(LDH)測試盒以及AKP測試盒均購自南京建成生物工程研究所。CPZ和波生坦(BOS)購自MCE(MedChemExpress)公司。膽汁酸混合物的組成和相應(yīng)的濃度見表1。

表1 1000×的混合膽汁酸鹽配方表

1.2 實驗動物 雄性Sprague-Dawley大鼠12只(體質(zhì)量180～220 g)來自斯貝福實驗動物中心，實驗前動物正常飼養(yǎng)。實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2019-0010。

1.3 方法

1.3.1 DILI肝臟脫細(xì)胞支架的制備 大鼠提前24 h禁食，提前4 h禁水。大鼠用10%水合氯醛麻醉，消毒后打開腹腔，暴露肝臟及門靜脈，將靜脈留置針從門靜脈進(jìn)針，固定后，開啟蠕動泵，流速20 mL/min～15 mL/min，沖洗約20 min。隨后序貫性泵入2% PLA2酶10 min，預(yù)冷的生理鹽水20 min，緊接著將整個肝臟摘取下來，盡量保證摘取肝臟的完整。隨后將大鼠肝臟支架結(jié)扎、修剪并保留肝中葉，放置于事先裝好DMEM的無菌異形瓶內(nèi)，連接蠕動泵裝置，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中循環(huán)灌流過夜。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)及模型構(gòu)建 將高分化的HepG2細(xì)胞于DMEM培養(yǎng)基(加入10%牛胎血清和5%雙抗)中培養(yǎng)。每個支架以7 mL/min分3次接種，每次1×107個細(xì)胞，共3000萬個HepG2細(xì)胞，所選擇的灌注速率是基于成年大鼠靜止期間肝臟血流速度(85 mL·min-1·kg-1)；再細(xì)胞化完成后開始連續(xù)3 d每天在異形瓶中加入100 mL DMEM以及100 μL配置好的1000×膽汁酸鹽配方對培養(yǎng)基進(jìn)行換液；再細(xì)胞化后的肝臟培養(yǎng)3 d后可進(jìn)行造模，損傷組于第5天加入10 mmol/L CPZ蠕動泵循環(huán)培養(yǎng)24 h后構(gòu)建膽汁淤積性體外模型。損傷保護組于再細(xì)胞化后第4天提前加入SGN進(jìn)行保護，24 h后于再細(xì)胞化后第5天加入CPZ再培養(yǎng)24 h，損傷組和損傷保護組均在加入CPZ藥物24 h后把肝臟取出，換藥前上清和換藥后上清送檢(圖1)。

圖1 制備CPZ所致膽汁淤積型肝損傷及藥物干預(yù)流程

1.3.3 細(xì)胞毒性檢測 CCK8將HepG2細(xì)胞制成40～60個/μL的細(xì)胞懸液，在96孔板中每孔加入100 μL的細(xì)胞懸液。培養(yǎng)24 h，向平面培養(yǎng)板加入不同濃度(103、104、105、106、107、108稀釋液)的SGN，作用24 h后根據(jù)試劑說明書要求，向每孔加入10 μL CCK8溶液，將96孔板放在細(xì)胞孵養(yǎng)箱培養(yǎng)20 min，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度(OD)，并計算細(xì)胞增殖-毒性。

1.3.4 活性氧(ROS)檢測 將下機后的肝臟在圓皿中充分研磨，加入10 mL PBS溶液收集研磨下來的細(xì)胞，放入15 mL離心管中，2000 r/min離心10 min，離心兩次后棄掉上清收集細(xì)胞，加入500 μL PBS和0.5 μL熒光探針DCFH-DA，放入水浴鍋中37 ℃孵育40 min，用PBS溶液洗滌兩次，加入200 μL PBS混勻,用熒光酶標(biāo)儀480 nm激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長測定結(jié)果。計算細(xì)胞中的ROS數(shù)據(jù)。

1.3.5 GSH測定 將肝臟研磨后，收集研磨后的細(xì)胞，加入10 mL PBS，離心后使用PBS清洗1～2次后再次離心收集沉淀細(xì)胞，再加入0.3～0.5 mL 0.1 mol/L pH值7.4的等滲PBS緩沖液懸浮細(xì)胞，手動研磨破碎細(xì)胞，細(xì)胞充分破碎后取破碎后的細(xì)胞懸液0.1 mL加0.1 mL的試劑盒中的試劑一混勻，3500 r/min，離心10 min，取上清液待測。根據(jù)試劑盒說明書，在96孔板加樣，混勻靜置5 min后用酶標(biāo)儀405 nm處測定各孔吸亮度值，計算細(xì)胞中GSH的含量。

1.3.6 SOD測定 將肝臟研磨后，收集研磨后的細(xì)胞加入10 mL OBS，離心1000 r/min，10 min，棄上清留沉淀細(xì)胞，在細(xì)胞沉淀中加入一定量的緩沖液PBS，用手動玻璃勻漿器冰水浴研磨3～5 min，準(zhǔn)備好樣品后根據(jù)試劑盒說明書，在96孔板中加樣，混勻后，37 ℃孵育20 min，在波長450 nm，酶標(biāo)儀測定吸亮度，計算細(xì)胞中SOD的含量。

1.3.7 AST、ALT、LDH、ALP試劑盒檢測上清 將肝臟下機后異型瓶中的上清液收集，根據(jù)南京建成上清試劑盒的檢測說明書于96孔板中加樣，再根據(jù)說明書中要求的波長條件于酶標(biāo)儀中測定各樣本的OD值，通過計算換算測定出樣品中的數(shù)值。

1.3.8 RT-qPCR及Western Blot檢測 RT-PCR:用Trizol提取總RNA，稀釋后紫外分光光度計，計算RNA濃度，然后用DNase處理。使用TakaRa試劑盒反轉(zhuǎn)錄后在ABI SteOnePlus機器上運行qPCR，所用引物見表2。

表2 PCR引物序列

Western Blot 檢測:收集上述各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，以 BCA 法測定蛋白質(zhì)濃度。通過配膠、上樣、轉(zhuǎn)膜這些過程后，用TBST和奶粉以5%的比例配置10 mL封閉液，搖床40 r/min，常溫在搖床封閉1 h或者在搖床4 ℃進(jìn)行封閉過夜。之后將抗體按照實驗所需濃度配置好，將已經(jīng)封閉好的PVDF膜放入一抗中，將搖床調(diào)到40 r/min，4 ℃搖床孵育過夜。第二天加入10 mL TBST洗膜液，90 r/min，5 min。重復(fù)3次，緊接著將PVDF膜洗完后，將其放入配置好的二抗中，搖床轉(zhuǎn)速40 r/min，在室溫進(jìn)行1 h孵育。再加入10 mL TBST洗膜液，90 r/min，5 min。再次重復(fù)3次。最后按照1∶1的比例將顯影液配好，PVDF膜放在塑封膜上，吸干表面殘存的液體。在PVDF膜上涂上顯影液，然后放入顯影儀中成像。

2 結(jié)果

2.1 DILI模型的建立 再細(xì)胞化后的組織工程肝臟在孵箱中用蠕動泵持續(xù)灌注。正常培養(yǎng)的組織工程肝臟用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，7 d后觀察CPZ損傷組和正常對照組(圖2)。

注：a，CPZ損傷組；b，正常對照組。

2.2 SGN的細(xì)胞毒性和保護作用 用平面96孔板的方法檢測了SGN的細(xì)胞毒性，使用不同濃度的SGN，SGN均無明顯的細(xì)胞毒性(圖3a)，進(jìn)一步在加入CPZ損傷的情況下觀察不同濃度SGN的保護作用，發(fā)現(xiàn)從105倍的稀釋濃度開始其保護作用呈劑量依賴性。說明SGN對細(xì)胞具有良好的保護性，選取保護作用最明顯的103倍稀釋濃度作為實驗用藥物濃度(圖3b)。

注：a，不同SGN濃度對細(xì)胞的毒性；b，不同濃度SGN對細(xì)胞的保護作用。S3，SNG稀釋103倍；S4，SGN稀釋104倍；S5，SGN稀釋105倍；S6，SGN稀釋106倍；S7，SGN稀釋107倍，S8，SGN稀釋108倍。與CPZ損傷組比較，*P<0.001，**P<0.000 1。

2.3 SGN對CPZ引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用 ROS結(jié)果顯示，當(dāng)受到藥物損傷時，SGN可以有效的減少細(xì)胞ROS的產(chǎn)生，從而對細(xì)胞產(chǎn)生保護作用。還原性GSH的檢測結(jié)果顯示，當(dāng)細(xì)胞受到藥物損傷時，SGN可以有效的增加細(xì)胞內(nèi)GSH的含量，從而增加細(xì)胞的抗氧化作用。SOD的檢測結(jié)果顯示，當(dāng)細(xì)胞受到藥物損傷時，SGN可有效的增加細(xì)胞內(nèi)SOD的含量，使得細(xì)胞抗氧化能力增加。丙二醛(MDA)結(jié)果顯示，當(dāng)受到藥物損傷時，SGN可以有效減少細(xì)胞內(nèi)過氧化脂質(zhì)的產(chǎn)生(圖4)。以上結(jié)果反映了SGN在氧化應(yīng)激反應(yīng)中的保護作用。

2.4 SGN對CPZ引起的組織工程肝損傷的保護作用 通過HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在SGN的保護作用下，細(xì)胞的損傷明顯減少，細(xì)胞的數(shù)量相對于損傷組有明顯的提高(圖5)。在上清液的各種指標(biāo)的檢測中，發(fā)現(xiàn)AST、ALT、LDH和ALP等反應(yīng)肝損傷程度的指標(biāo)中在加入SGN的保護組中均較損傷組有明顯的下降(圖6)，以上這些數(shù)據(jù)證明了SGN對于DIC型肝損傷模型具有較好的保護作用。

2.5 SGN對CYP7A1和CYP8B1表達(dá)的影響 RT-qPCR 的結(jié)果發(fā)現(xiàn)在加入CPZ后，會引起CYP7A1和CYP8B1這兩種酶類的基因水平升高，而在加入SGN保護后則可以抑制這兩種酶的表達(dá)。Westeren Blot 的結(jié)果也說明了在SGN的保護作用下，CYP7A1/8B1的蛋白表達(dá)水平已發(fā)生降低(圖7)。

2.6 SGN對BSEP和MRP2表達(dá)及FXR和SHP核受體的影響 SGN可以增加BSEP和MRP2兩種轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)，并激活FXR和SHP核受體。由圖8可見，CPZ損傷后，BSEP及MRP2的基因水平表達(dá)明顯降低，而加入了SGN進(jìn)行保護后，BSEP及MRP2的mRNA表達(dá)水平顯著升高。在SGN的保護作用下，F(xiàn)XR和SHP兩種核受體的基因及蛋白表達(dá)水平較CPZ損傷組均顯著增加。

注：與CPZ損傷組比較，*P<0.001,**P<0.000 1。

注：a，正常組；b，CPZ損傷組；c，SGN+CPZ保護組。

注：與CPZ損傷組比較，**P<0.000 1。

注：與CPZ損傷組比較，*P<0.001,**P<0.000 1。

3 討論

DIC是一個重要的臨床問題，會導(dǎo)致藥物撤市及停產(chǎn)，造成重大的經(jīng)濟損失[6]。DIC的臨床前預(yù)測目前主要限于測量該化合物抑制BSEP的潛力。然而，DIC的表現(xiàn)通常是復(fù)雜的，多因素的。因此，需要新的體外測定法，其可在生理學(xué)相關(guān)的肝模型中全面評估化合物的膽汁淤積風(fēng)險，筆者團隊構(gòu)建了3D 組織工程肝膽汁淤積型DILI模型，該模型被證實與藥物性膽汁淤積患者早期的許多臨床表現(xiàn)相似，包括血清生化指標(biāo)ALT、AST、TBil、TBA及膽汁酸鹽譜的變化、白蛋白和尿素氮合成增加。由于模型采用人的肝細(xì)胞，因此種屬差異性小，是一種良好的DIC細(xì)胞模型。

注：與CPZ損傷組比較，*P<0.01,**P<0.000 1。

有越來越多的證據(jù)表明，在膽汁淤積性肝病中，核受體FXR在嚙齒動物和人類的肝臟損傷機制中發(fā)揮了重要作用[9]。FXR在生理性膽汁酸的合成、分泌和運輸中起著重要作用[10]。這些過程的FXR調(diào)節(jié)缺陷可能導(dǎo)致膽汁淤積和隨后的病理變化[11]。FXR通過酶調(diào)節(jié)膽汁酸合成的減少和其攝取。FXR作為膽汁酸代謝的重要調(diào)節(jié)劑，能夠激活另一種核轉(zhuǎn)錄受體SHP，激活后的SHP使CYP7A1和CYP8B1的表達(dá)受到抑制，從而限制膽汁酸合成[12-13]。大量研究聚焦在FXR的激活對肝細(xì)胞中膽酸鹽外排的影響：研究表明[14]肝臟FXR的激活能夠增加膽酸鹽外排型轉(zhuǎn)運體小管膜轉(zhuǎn)運蛋白BSEP和MRP2的表達(dá)，從而使得膽酸鹽外排量增加，達(dá)到降低細(xì)胞內(nèi)膽酸鹽濃度、緩解膽汁淤積的目的。

在目前的研究中，筆者使用了分化的人HepG2和大鼠脫細(xì)胞支架構(gòu)建組織工程肝，分析SGN對肝內(nèi)膽汁淤積的影響，并對其引發(fā)機制進(jìn)行了探討，具體機制見圖9。膽汁酸的穩(wěn)態(tài)取決于肝細(xì)胞和腸細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運蛋白。肝細(xì)胞中的BSEP和MRP2將膽汁酸排入膽管，這步是決定膽汁流量的主要因素[15]。許多研究表明[16-18]，BSEP是FXR的直接靶標(biāo)，但一些發(fā)現(xiàn)表明，共激活子對于BSEP和MRP2基因的激活是必不可少的。其他轉(zhuǎn)運蛋白基因，尤其是有機溶質(zhì)轉(zhuǎn)運體(OSTα/β)，MRP2和多藥耐藥蛋白3(MDR3)也可以通過FXR直接激活。FXR主要通過SHP參與機體膽汁酸代謝調(diào)節(jié)。正常生理狀態(tài)下，肝細(xì)胞膽汁酸的代謝主要通過BSEP、MRP2兩種膽汁酸鹽輸出泵代謝，幫助肝細(xì)胞進(jìn)行膽汁酸的代謝。在此次研究中，當(dāng)用CPZ進(jìn)行藥物損傷時，CPZ組誘導(dǎo)了藥物性膽汁淤積使得BSEP和MRP2這兩種膽鹽輸出泵的內(nèi)化內(nèi)吞，更加加劇了膽汁酸鹽細(xì)胞內(nèi)蓄積。SGN可以通過激活FXR/SHP核受體，增加BSEP和MRP2的表達(dá)，減少了有毒膽汁酸鹽在細(xì)胞內(nèi)堆積，從而保護了細(xì)胞。也可能是SGN在膽汁淤積性DILI模型中發(fā)揮抗膽汁淤積作用的分子機制。

圖9 舒肝寧保護機制的示意圖

綜上所述，本研究表明SGN有明顯的抗膽汁淤積作用，其機制可能為SGN通過激活FXR/SHP核受體，促進(jìn)了外排轉(zhuǎn)運蛋白BSEP和MRP 2的表達(dá)上調(diào)同時抑制了CYP7A1和CYP8B1兩種酶的分泌，最終降低肝內(nèi)膽汁酸的淤積情況，改善了膽汁淤積的嚴(yán)重程度，有望為臨床SGN的治療提供新的思路。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2020年6月5日經(jīng)由北京佑安醫(yī)院實驗動物倫理委員會審批通過，批號:AEEI -2020 -076，符合實驗室動物管理與使用準(zhǔn)則。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻(xiàn)聲明：黃龍負(fù)責(zé)撰寫論文;吳橋負(fù)責(zé)課題設(shè)計，修改論文;陳煜、段鐘平負(fù)責(zé)提供寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。