姚 濤，徐植紅，姚紀友，夏 雨，陸敏強，蘭 天，劉 冰

1 廣東藥科大學 藥學院，廣州 510006；2 華南理工大學附屬第二醫(yī)院/廣州市第一人民醫(yī)院 肝膽二科，廣州 510180

盡管手術、放/化療、免疫治療和靶向治療部分提高了肝細胞癌(HCC)的臨床療效，但HCC仍是全球癌癥相關死亡的第四大原因[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織[2]預測,到2030年將有超過100萬患者死于HCC。HCC形成的具體發(fā)病機制目前尚不清楚[3]。近年來研究[4]證明巨噬細胞在腫瘤的惡性生長中發(fā)揮重要作用，巨噬細胞功能異常調(diào)節(jié)與HCC有關，M2型巨噬細胞對包括HCC在內(nèi)的多種惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有促進作用[5]。最近研究[6]表明，腫瘤免疫微環(huán)境中的M2型巨噬細胞促進了HCC的侵襲轉(zhuǎn)移。但現(xiàn)有研究多集中于巨噬細胞如何調(diào)控腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，而對腫瘤細胞馴化巨噬細胞的機制尚未明確，阻礙了靶向巨噬細胞抗腫瘤策略的發(fā)展。

外泌體是一種能夠在細胞間進行物質(zhì)交換和信息交流的胞外囊泡。癌細胞和M2型巨噬細胞之間的串擾已被廣泛研究，然而，腫瘤細胞如何激活M2型巨噬細胞的機制在HCC中仍不清楚。因此，本研究通過超速離心的方法提取外泌體，研究來源于HCC細胞的外泌體對巨噬細胞極化的影響，探討其在巨噬細胞極化過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞系 Hep G2細胞株、L02細胞株、人源單核細胞巨噬細胞(THP-1)購自上海中國科學院細胞培養(yǎng)中心。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 主要試劑 DMEM、RPMI 1640(美國Gibco公司)；胎牛血清、胰蛋白酶(美國Hyclone公司)；TSG101、CD63(英國Abcam公司)；Arg-1、CD163(美國CST公司)；佛波酯(美國Sigma公司)；HRP標記羊抗兔、抗鼠二抗(美國Promega公司)；β-actin抗體(北京TransGen Biotech公司)；BCA蛋白定量試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)；SYBR Green Supermix(美國Bio-Rad公司)；TAKALA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連TAKALA公司)。

1.2.2 主要儀器 LC480熒光定量PCR儀(型號：Roche LC 48032qw，瑞士Roche公司)；超凈工作臺(型號：BCM-1000A，美國AIRTECH公司)；CO2培養(yǎng)箱(型號：4111，美國Thermo Fisher Scientific公司)；高速離心機(型號：Beckman Optima L-100XP，美國Beckman Coulter公司)；高速離心管(批號：P00128MPI，美國Beckman Coulter公司)；微型蛋白電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(型號：PowerPac Basic，美國Bio-Rad)；化學發(fā)光儀(型號：3300029-7Q，上海勤翔科學儀器有限公司)；納米激光粒度儀(型號：Litesizer 500，奧地利Anton Paar公司)。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 所有細胞實驗操作過程都嚴格在超凈臺無菌環(huán)境下進行，細胞培養(yǎng)條件：溫度37 ℃，CO2含量5%以及飽和濕度培養(yǎng)箱環(huán)境。Hep G2細胞在含有10%胎牛血清的DMEM中培養(yǎng)，THP-1細胞在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.3.2 外泌體提取分離 采用超速離心法從Hep G2細胞培養(yǎng)基中分離出外泌體。將生長狀態(tài)良好的Hep G2細胞平鋪在細胞培養(yǎng)皿中，細胞貼壁過夜后去除含有10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，并使用無血清培養(yǎng)基維持細胞，48 h后收集細胞培養(yǎng)基。采用差速離心法依次以1000×g離心10 min，3000×g離心20 min，10 000×g離心30 min取上清，用0.22 μm的膜過濾。最后，將上清液置于固定角轉(zhuǎn)子中，以4 ℃ 100 000×g離心70 min，棄去上清，PBS重懸備用。

1.3.3 HCC細胞來源外泌體表征

1.3.3.1 透射電子顯微鏡(TEM)檢測 用1%戊二醛固定外泌體，將20 μL含外泌體的上清液滴在銅網(wǎng)上，室溫下放置5 min，用濾紙條吸取銅網(wǎng)一側(cè)多余液滴。取2%的磷鎢酸溶液10 μL滴于臘盤上，將銅網(wǎng)放置于染液表面靜置5 min后用濾紙將多余的染料溶液吸收并丟棄。在室溫下干燥后，將銅網(wǎng)放在樣品槽中，在TEM下觀察并拍照。

1.3.3.2 納米激光粒度儀分析外泌體粒徑 將外泌體用適量PBS稀釋置于比色皿，納米激光粒度儀Litesizer 500分析外泌體粒徑。

1.3.3.3 蛋白免疫印跡 加入含有蛋白酶抑制劑的裂解液重懸外泌體，提取總蛋白進行蛋白免疫印跡分析。將提取蛋白加入聚丙烯酰胺凝膠電泳中分離后，將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h。TSG101和CD63一抗在 4 ℃ 冰箱中孵育過夜。二抗室溫孵育1 h，采用化學發(fā)光法顯色拍照。

1.3.4 HCC細胞外泌體誘導巨噬細胞M2極化

1.3.4.1 巨噬細胞模型的構建 在小皿種植密度為7.5×105個/皿THP-1細胞，加入15 ng佛波酯(PMA)誘導24 h貼壁后實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測CD68表達。

1.3.4.2 qRT-PCR檢測CD68表達 CD68引物序列，上游引物：5′-CACGCAGCACAGTGGACATTCT-3′，下游引物：5′-TGGGGCAGGAGAAACTTTGCC-3′；GAPDH引物序列，上游引物：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′均由廣州銳博公司設計與合成。按照常規(guī)Trizol法提取細胞總RNA，測定提取總RNA濃度，按照RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄，條件:37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保持。逆轉(zhuǎn)錄后qRT-PCR反應程序如下：95 ℃預變性10 min；變性(95 ℃，28 s)，復性(55 ℃，28 s)，延伸(74 ℃，35 s)反應40個循環(huán)，CD68表達水平采用 2-ΔΔCt計算。

1.3.4.3 外泌體誘導巨噬細胞 將PMA誘導的人單核巨噬細胞，分別用PBS和正常肝細胞分泌的外泌體(L02-Exo)作為陰性對照，Hep G2細胞分泌的外泌體(Hep G2-Exo)低(10 μg)、中(20 μg)、高(30 μg)劑量和陽性對照IL-4+IL-13 20 ng/mL分別孵育誘導成功的巨噬細胞，檢測M2型巨噬細胞標志蛋白Arg-1、CD163。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism 8和Image J軟件進行作圖和統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的計量資料兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 外泌體的表征

2.1.1 外泌體形態(tài)特征 通過TEM對超速離心法提取到的外泌體進行鑒定，Hep G2和L02細胞來源外泌體均拍到了圓形或橢圓形囊泡結(jié)構，電鏡下囊泡大小為100 nm左右(圖1)。

注：a，Hep G2-Exo；b，L02-Exo。

2.1.2 外泌體粒徑分布 通過動態(tài)光散射粒度儀對外泌體進行粒徑大小的檢測，超速離心法提取得到的外泌體其粒徑大小為(172.65±2.34)nm (圖2)，該結(jié)果符合外泌體的正常粒徑大小。

圖2 外泌體粒徑分布圖

2.1.3 外泌體標志蛋白CD63和TSG101表達水平 CD63和TSG101均在所提外泌體中表達，且表達豐度較高，而在超速離心后的上清液中沒有檢測到表達，說明經(jīng)提取后上清液已不含外泌體，進一步驗證了該方法能從細胞培養(yǎng)上清液中高效提取外泌體(圖3)。

注：EDS，超速離心分離外泌體后的上層液體。

2.2 PMA誘導THP-1細胞的CD68表達水平 通過qRT-PCR檢測了PMA誘導THP-1細胞標志物CD68的表達情況。結(jié)果顯示，相比對照組，經(jīng)PMA誘導的巨噬細胞中CD68表達水平顯著增加(6.67±0.98 vs 1.00±0.25，t=11.20,P<0.001)。

2.3 標志蛋白Arg-1、CD163的表達水平 通過HCC細胞來源的外泌體誘導巨噬細胞模型(M0)，并檢測M2型巨噬細胞的標志物。結(jié)果顯示，相比對照組(L02來源外泌體)，HCC細胞來源外泌體(低、中、高3種劑量)誘導巨噬細胞M0后，M2型巨噬細胞標志蛋白Arg-1、CD163表達均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)(圖4)。

圖4 蛋白免疫印跡法檢測M2型巨噬細胞標志蛋白Arg-1、CD163表達

3 討論

HCC是一種原發(fā)性肝臟惡性腫瘤，是目前全球第四大常見的癌癥相關死亡原因，發(fā)病率不斷上升，預后不良。由于現(xiàn)有的治療方法有限，因此迫切需要開發(fā)新的治療方法。

腫瘤微環(huán)境是指腫瘤的發(fā)生、生長及轉(zhuǎn)移與腫瘤細胞所處的內(nèi)外環(huán)境，由細胞成分和非細胞成分構成，細胞成分包括腫瘤細胞和免疫細胞、內(nèi)皮細胞、癌相關成纖維細胞等非腫瘤細胞成分，非細胞成分主要是指細胞外基質(zhì)以及各種細胞因子[7]。巨噬細胞作為組成腫瘤微環(huán)境的主要細胞成分之一，對腫瘤細胞的生長和增殖發(fā)揮重要的作用[8]。巨噬細胞可在多種細胞因子的作用下分化成不同亞型[9]。它可以分泌促血管生成因子和各種細胞因子介質(zhì)，促進腫瘤細胞的生長、侵襲和腫瘤相關的血管生成。

外泌體是由細胞分泌到細胞外環(huán)境粒徑為30～200 nm的小膜泡[10]，首次被Harding和Pan等發(fā)現(xiàn)[11-12]。此外，外泌體參與了細胞間的通訊，通過向鄰近的細胞或組織轉(zhuǎn)移信號調(diào)節(jié)微環(huán)境和免疫系統(tǒng)，進而參與調(diào)節(jié)正?；虍惓５纳镞^程[13-14]。外泌體不僅能啟動目標細胞的下游信號，而且還能將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到下游細胞，為細胞間的交流提供了新的機制[12]。

此前，針對腫瘤治療和預后評估的思路大多局限在腫瘤細胞本身。近年來，腫瘤微環(huán)境尤其是巨噬細胞在腫瘤治療和預后評估等臨床行為中的價值受到了越來越多的關注?，F(xiàn)有研究也表明，腫瘤來源的外泌體通過激活巨噬細胞的M2極化而促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Qian等[15]發(fā)現(xiàn)，低氧膠質(zhì)瘤來源的外泌體中的miRNA-1246可以通過STAT3和NF-κB途徑靶向TERF2IP，進而誘導M2巨噬細胞的極化。低氧環(huán)境下，HCC細胞來源外泌體促進了腫瘤的增殖、遷移和侵襲[16]。Zhao等[17]發(fā)現(xiàn)，腫瘤來源的外泌體中的miRNA-934能誘導巨噬細胞M2的極化，促進結(jié)直腸癌的肝轉(zhuǎn)移。外泌體與HCC的發(fā)生發(fā)展有著重要聯(lián)系，F(xiàn)ang等[18]發(fā)現(xiàn)HCC細胞來源的miRNA-1247-3p外泌體靶向作用于B4 GALT3，促進成纖維細胞激活并分泌 IL-6和IL-8等促炎細胞因子，促進癌癥的進展和HCC的肺轉(zhuǎn)移。此外，外泌體也具有成為藥物載體以及治療靶點的潛能。Lou等[19]發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞分泌的外泌體可以明顯提高HCC細胞對5-氟尿嘧啶的敏感性。因此，研究HCC外泌體對巨噬細胞的影響，有助于闡明HCC發(fā)生發(fā)展的生物學過程，對HCC的診斷、治療和預后具有重要意義。

外泌體的提取分離方法有多種，包括超速離心法、超濾法、尺寸排斥色譜法和基于微孔板的磁免疫捕獲法，其中超速離心法被認為是外泌體提取的金標準[20]。本研究通過超速離心法提取外泌體，并經(jīng)由TEM、動態(tài)光散射分析儀和蛋白免疫實驗進行了外泌體的鑒定。通過上述方法提取的外泌體呈現(xiàn)典型“茶托樣”杯形或類圓形囊泡結(jié)構；其粒徑分布于30～200 nm，符合外泌體的粒徑分布標準；免疫印跡結(jié)果顯示外泌體標志蛋白CD63和TSG101表達陽性，進一步證明了該提取方法科學有效。

在研究外泌體對巨噬細胞極化的影響中，筆者采用PMA誘導THP-1細胞的方法[21]構建巨噬細胞模型(M0)，巨噬細胞模型標志物的qRT-PCR分析表明模型誘導成功，將提取的外泌體刺激M0型巨噬細胞，通過免疫印跡分析，發(fā)現(xiàn)與L02細胞外泌體對照組(L02-Exo)相比，HCC來源的外泌體誘導的M2型巨噬細胞相關標識蛋白CD163和Arg-1表達顯著提高，綜合上述證據(jù)可以明確HCC外泌體能有效促進巨噬細胞發(fā)生M2型極化。以往的研究大多集中于癌細胞來源的外泌體與M2型巨噬細胞之間的串擾，但腫瘤細胞如何激活巨噬細胞發(fā)生M2型極化的機制在HCC中仍不清楚。而在本研究中，發(fā)現(xiàn)HCC細胞來源的外泌體能夠有效促進巨噬細胞M2型極化，可能是HCC發(fā)生發(fā)展的一種新機制。這不僅加深了對HCC外泌體調(diào)節(jié)巨噬細胞功能的認識，也揭示了HCC細胞與天然免疫之間復雜的相互作用關系。但是受限于本研究中采用的體外研究方法，仍需要更多的體內(nèi)實驗驗證這一作用，以及HCC外泌體中的哪些基因參與巨噬細胞調(diào)控，還有待進一步研究。加強對HCC外泌體的基本特征及其對巨噬細胞調(diào)節(jié)作用的了解，有助于今后更好地闡明HCC的發(fā)病機制，為其臨床應用奠定理論基礎。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：姚濤、徐值紅參與課題設計，資料分析，撰寫論文；姚紀友、夏雨參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；劉冰、蘭天、陸敏強負責課題設計，數(shù)據(jù)資料分析，指導撰寫文章并最后定稿。