劉 壯，高 棟

細胞生物學國家重點實驗室，上海市分子男科學重點實驗室，中國科學院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心，上海 200031

1 基于個性化病理模型的藥物篩選技術

肝膽腫瘤是臨床最致命的腫瘤之一，但目前針對患者選擇特異性藥物缺乏明確依據(jù)，腫瘤位點檢測又常因為其異質(zhì)性受到影響，因此，建立可靠的、可用的體外篩選模型至關重要。肝的人體腫瘤組織小鼠移植(patient-derived xenografts,PDX)模型是一種傳統(tǒng)的個性化病理模型，具有特異性強、與臨床效果一致性高等優(yōu)勢。因此，借助PDX模型進行精準的藥物篩選在當前廣泛應用。

PDX模型是將取自臨床患者的手術或者穿刺取得的腫瘤組織直接異位移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)而建立的動物病理模型[1]。相較于其他類型動物模型，PDX模型可以更大程度上有效反映人類原發(fā)腫瘤的微環(huán)境，即細胞組成(如淋巴細胞、巨噬細胞、成纖維細胞及其他各類細胞等)以及細胞外基質(zhì)，能夠更好地展現(xiàn)腫瘤細胞與周圍基質(zhì)之間的密切聯(lián)系和相互作用，在模擬人體腫瘤組織微環(huán)境的重構及血管的生成、腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展甚至腫瘤的轉(zhuǎn)移逃逸等方面具有明顯的優(yōu)勢[2-3]。同時，由于PDX模型能夠保留原代腫瘤的遺傳學特征(特異性突變、基因組整體特性等)，因而可作為篩選抗癌藥物、評價藥物的臨床療效及檢測藥物毒性有效工具[4]，作為一類特異性的模型，其還可準確反映不同個體腫瘤間和腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性[5]，在藥物效能研究、患者治療后臨床效果及預后預測等方面優(yōu)勢明顯[6]。PDX模型還能夠保留不同患者原代腫瘤的特性并可在免疫缺陷小鼠上對原代腫瘤進行傳代，可作為腫瘤個性化治療的研究標本[7]。因此，肝細胞癌PDX模型在藥物和生物標志物篩選及聯(lián)合臨床試驗中顯示出作為臨床前模型的優(yōu)勢。

PDX模型多用于肝細胞癌的發(fā)病機制并據(jù)此進行藥物篩選的研究。Kissel等[8]以瑞戈非尼和索拉非尼為模型藥物，比較了H129小鼠肝癌模型和PDX模型對抗腫瘤藥物的敏感性差異。Lv等[9]利用肝癌細胞系和PDX模型評價了維他命C通過SVCT-2對肝細胞癌的抑制作用。Matsuki等[10]應用2個PDX模型證實了新型分子靶向藥物侖伐替尼具有通過抑制 FGF信號通路活性抑制肝細胞癌的增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲等作用。PDX模型廣泛用于肝細胞癌的臨床前抗腫瘤藥物療效方面的研究，一些臨床前抗腫瘤藥物療效評估的效應也依賴于PDX模型，能夠?qū)Ω渭毎┑呐R床治療提供指導，同時對于新藥的研發(fā)和應用具有重要意義。目前，索拉非尼是抗肝細胞癌的一線藥物，以索拉非尼為代表的分子靶向藥物在進展期肝細胞癌治療中發(fā)揮了重要作用，其抗癌機制是通過抑制多種絲氨酸/蘇氨酸和受體酪氨酸激酶，從而抑制腫瘤血管生成和促進腫瘤細胞凋亡等方面發(fā)揮作用，進而達到有效殺傷腫瘤細胞的目的[11]。雖然索拉非尼能夠顯著延長部分肝細胞癌患者的生存期，但還存在未能抑制的信號通路，如磷化硫醇3-激酶/蛋白激酶B信號通路[12]，這些信號通路反過來能夠促進索拉非尼耐藥細胞的生長和存活，從而出現(xiàn)更加難以克服的耐藥現(xiàn)象。研究者利用PDX模型對索拉非尼的抗癌機制以及在抗癌過程中可能會影響其作用的生物標志和信號通路進行了深入研究，同時也對開發(fā)其他抗肝細胞癌的藥物和成分展開了研究。Wu等[13]通過建立PDX模型證實了利用CDK1抑制劑阻斷CDK1/PDK1/β-Catenin信號通路能夠增強索拉非尼的抗腫瘤應答。利用PDX模型研究[14]發(fā)現(xiàn)，抑制胰島素樣生長因子受體1的活性能夠顯著增強索拉非尼抑制肝癌細胞生長和存活的作用。Liang等[15]應用PDX模型驗證pERK是評價索拉非尼治療肝細胞癌時一項顯著的生物標志物。當索拉非尼通過RAF/MEK/ERK通路發(fā)揮作用時，pERK會出現(xiàn)顯著下調(diào)。通過構建肝細胞癌PDX模型研究索拉非尼耐藥組與敏感組中DKK1的表達差異，發(fā)現(xiàn)通過降低DKK1表達可增強索拉非尼的敏感性[16]。PDX模型因保留患者腫瘤的分子特性和異質(zhì)性，能夠再現(xiàn)患者的藥物敏感性特征，被廣泛應用于肝細胞癌臨床前藥物敏感性研究。許多研究發(fā)現(xiàn)，PDX模型對抗癌藥物的反應與提供腫瘤樣本的實際患者反應相似[17]。因此，PDX模型有助于測試某些藥物的治療反應，并且可以從異種移植組織獲得治療后數(shù)據(jù)[18]。Wang等[19]利用PDX模型證實納米藥物SN38治療肝細胞癌的作用，研究發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后的藥物遞送結構可以更好地對肝腫瘤進行殺傷。Gu等[20]開展了臨床前研究分析65個PDX模型基因表達的差異以及包括索拉非尼等藥物在內(nèi)的PDX對藥物反應性。Xin等[21]利用PDX模型得到LIXC002、LIXC003、LIXC004、LIXC006、LIXC011、LIXC012以及CPL0903在內(nèi)的7種新的人來源肝細胞癌細胞系，并對每個細胞系的藥物敏感特性進行檢測分析對比?？梢灶A見的是，在肝膽腫瘤治療的層面，PDX模型仍然具有巨大的發(fā)展前景和應用潛力。

生物學基礎研究和疾病診療應用研究均離不開合適的研究模型。經(jīng)典的二維(2D)培養(yǎng)人源細胞模型極大的促進了生物學基礎研究和疾病診療應用研究的進展，但是這種模型同時也存在嚴重缺陷。2D細胞培養(yǎng)往往細胞類型單一，不能全面反映細胞在體內(nèi)的特征，難以反映特異性與個性化的特點[22-24]。類器官模型是近年來新出現(xiàn)的生物學研究模型，兼具2D細胞培養(yǎng)的簡單操作特性和PDX模型的復雜結構特征，是極佳的生物學基礎研究和疾病診療應用研究模型。類器官是由不同譜系來源的細胞，在三維培養(yǎng)條件下自發(fā)形成類似體內(nèi)組織結構的多細胞團，具有自更新和自組織能力，并可以在一定程度上維持其來源組織的生理結構和功能[25]，是開展腫瘤生物學和干細胞生物學研究的有力工具。類器官模型在研究組織構建與再生，疾病發(fā)生、發(fā)展和治療等方面都具有獨特優(yōu)勢，例如能夠長時間體外增殖，很好地保持了組織生理和病理狀態(tài)下的組織結構和細胞異質(zhì)性[25-28]，適用于大規(guī)模的藥物篩選[25,28]，在新型藥物的篩選中有著廣闊的應用前景。

腫瘤異質(zhì)性是指在同一腫瘤組織內(nèi)部或者不同的腫瘤來源的組織之間存在著的遺傳及病理差異[29]，這種特性是臨床治療腫瘤需要考慮的關鍵因素。肝癌在腫瘤的發(fā)生機制、臨床患者的組織形態(tài)、腫瘤微環(huán)境，以及遺傳分子特異性層面均表現(xiàn)出高度異質(zhì)性[30]，因此迫切需要開發(fā)出能穩(wěn)定維持腫瘤細胞體內(nèi)特征的肝癌研究模型用于肝癌的個體化精準診療研究。原發(fā)性肝癌主要包括肝細胞癌、肝內(nèi)膽管癌、混合型肝細胞癌-膽管癌3種亞型。2017年，Broutier等[31]利用肝癌患者臨床腫瘤切除組織生成了3種原發(fā)性肝癌類器官，該模型較好地保留了原發(fā)腫瘤的組織學結構、基因表達和基因組特征，并在相同培養(yǎng)基條件下長期傳代仍可保留不同腫瘤組織結構和亞型。異種移植試驗表明，原發(fā)性肝癌類器官的成瘤潛能、病理學特性和轉(zhuǎn)移能力在體內(nèi)均可以得到很好地保存。此外，該研究團隊還將原發(fā)性肝癌的類器官作為生物標記物鑒定和藥物篩選模型，用其篩選得到了ERK抑制劑SCH772984作為潛在的原發(fā)性肝癌治療藥物。2018年，另有研究團隊[32]從肝癌組織穿刺活檢材料中成功構建類器官，與2017年的研究相比，該研究擴大了肝癌類器官建立的來源。這是由于手術切除是少數(shù)肝癌早期或非肝硬化患者的治療選擇，這些患者通常未接受全身治療，因此只能在一定程度上反映原發(fā)性肝癌的特性，而對于其他進展階段的肝癌患者，則無法有效地代表。該研究在構建體外類器官的過程中使用了肝癌的液體活檢材料，其可取材于接受全身治療的中晚期腫瘤患者。因此，該研究中活檢材料衍生的類器官有助于研究者建立一個反映肝細胞癌全譜的動態(tài)生物樣本庫，可以包括各種臨床信息，如治療反應、耐藥性發(fā)展和生存預后等數(shù)據(jù)，從而更好地幫助醫(yī)生確定個性化治療方案。

2019年，Erlangga課題組[33]報導了一種利用環(huán)化重組cre-lox系統(tǒng)、RNA干擾和定期間隔短回文重復序列相關蛋白9(CRISPR/cas9)與肝臟類器官相結合的技術，建立了一個易于處理的小鼠膽管細胞癌類器官模型，然后將其移植到免疫能力強的同基因小鼠體內(nèi)。組織學上，腫瘤顯示細胞角蛋白19陽性的導管結構，周圍有促結締組織增生的基質(zhì)即人類乳腺癌的典型特征。該成果加深了人們對于膽管細胞癌類器官的生理病理學的理解。

2016年，Takai等[34]研究證實在多孔海藻酸鹽支架中的肝細胞性肝癌細胞可以產(chǎn)生類似于體內(nèi)腺上皮的許多特征的類器官球狀體，例如腺泡的形態(tài)發(fā)生和EPCAM的頂端表達模式。EPCAM是一種肝干/祖細胞標記物，在具有干細胞性特征的肝細胞癌亞群中高度表達。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號通路的激活是肝癌球狀體形成和腺泡結構維持的必要條件，而Wnt/β-catenin信號通路是肝癌細胞保持細胞干性的重要途徑。同時該研究還證實，與傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)相比，體內(nèi)培養(yǎng)的EPCAM(+)肝癌細胞對TGFβ誘導的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化更為敏感，具有更高的致瘤性和轉(zhuǎn)移潛能。此外，EPCAM(+)球體中的肝癌細胞對化療藥物的抵抗力強于2D培養(yǎng)的肝癌細胞。以海藻酸鹽為載體的器官型培養(yǎng)系統(tǒng)是一種有前途的、可靠的、簡便易行的系統(tǒng)，可用于肝癌關鍵信號轉(zhuǎn)導途徑的鑒定和分子藥物靶點的篩選。

2019年，Cao等[35]研究發(fā)現(xiàn)可以從小鼠原發(fā)性肝腫瘤中建立腫瘤類器官。該研究從129個肝組織/腫瘤中，成功培養(yǎng)出91個細胞株。這些類器官可以在體外長期培養(yǎng)，約20%在免疫缺陷小鼠移植后形成腫瘤，證實了其致瘤性和自我更新特性。來自腫瘤類器官的單個細胞具有高效的類器官啟動效率，而來自癌細胞的單個類器官能夠啟動小鼠的腫瘤，表明腫瘤類器官中的啟動細胞增多。此外，這些類器官在一定程度上概括了肝癌患者在表型、癌細胞組成和治療反應方面的異質(zhì)性。這些模型系統(tǒng)將為推進肝癌(干細胞)生物學、藥物開發(fā)和個體化醫(yī)學方面的研究提供巨大的機會。

2019年，Li等[36]報道了27個可以體外培養(yǎng)的肝癌類器官，同時對包括色瑞替尼等在內(nèi)的129個肝癌特異性抑制劑或者廣靶腫瘤抑制劑進行了藥物篩選，證實了不同患者來源的類器官模型對藥物的敏感性有差異，發(fā)現(xiàn)包括伊沙佐米在內(nèi)的7個泛腫瘤抑制劑對肝細胞癌具有顯著的抑制效果，彰顯了肝細胞癌類器官在篩選臨床藥物方面的巨大潛力。2021年，該課題組[37]同樣利用來自肝癌患者的40例腫瘤類器官模型進行了藥物篩選工作，發(fā)現(xiàn)高三尖杉酯堿具備潛在的有效抑制肝癌類器官的潛能，從“老藥新用”的角度為臨床肝細胞及膽管細胞癌的治療提供了新的選項，揭示了肝腫瘤類器官的培養(yǎng)可以對藥物進行有效的甄別和篩選。在不久的將來，肝膽腫瘤類器官模型將會向著更大規(guī)模，更高的覆蓋度以及更加精準的預測藥物響應的方向發(fā)展，在輔助臨床的治療中發(fā)揮更大的作用。

2 基于特異靶點的藥物篩選技術

前文討論的是針對個性化模型開展的藥物篩選新技術，而對藥物具體作用的機制，則并不完全了解。實際上，肝膽腫瘤患者往往有著同樣的特異性突變，這些突變也可以作為藥物靶向設計的靶點。針對這些癌癥特異的敏感位點，也衍生出了對應的藥物篩選技術。

2.1 基于大規(guī)模測序數(shù)據(jù)分析的腫瘤敏感位點預測 隨著測序技術的突飛猛進，特別是第二代測序技術的廣泛發(fā)展及應用，已提出肝細胞癌的分子亞型為增殖、非增殖型，并在多項研究超過1500個樣品測序后，確定了肝細胞癌的關鍵驅(qū)動因素，這些關鍵驅(qū)動因素也具有成為藥物靶點的巨大潛力[38]。

2.2 基于靶向藥物位點的藥物篩選技術 肝細胞癌是公認的最耐化療的腫瘤之一。2007年之前一直缺少系統(tǒng)治療晚期腫瘤患者的推薦藥物，全身化療藥物如多柔比星或奧沙利鉑添加5G氟尿嘧啶/亞葉酸鈣方案在臨床試驗中也未顯示出生存益處[39-41]。目前，內(nèi)科精準治療主要體現(xiàn)在分子靶向藥物和免疫治療，以及目前在各個領域研究較熱門的腸道菌群應用。單克隆抗體和酪氨酸激酶抑制劑可對潛在靶點進行精確治療，如高焦點擴增成纖維細胞生長因子或血管內(nèi)皮生長因子A等[42]分子靶向治療多靶點酪氨酸激酶抑制劑的系統(tǒng)治療是一種可以確切治療各種晚期腫瘤的方法。采用新一代測序技術分析基因組揭示了人類肝細胞癌腫瘤內(nèi)和腫瘤間的異質(zhì)性，并提供了有效抵抗腫瘤細胞的多個靶點。索拉非尼是美國食品藥品監(jiān)督管理局批準用于晚期肝細胞癌標準系統(tǒng)治療的口服多酪氨酸激酶抑制劑[43]，通過選擇性抑制血管內(nèi)皮生長因子受體、血小板源性生長因子受體(PDGFR)阻斷腫瘤血管的生成，同時通過阻斷RAF/MEK/ERK信號通路抑制腫瘤細胞增殖。歐洲多中心隨機SHARP研究(Ⅲ期臨床試驗)[44]顯示，索拉非尼治療的晚期肝細胞癌患者的中位總生存期從7.9個月延長至10.7個月。FISH分析顯示，攜帶血管內(nèi)皮生長因子A擴增的肝細胞癌患者對索拉非尼明顯敏感。ARAO等[45]研究顯示，索拉非尼治療組的部分患者腫瘤明顯縮小。最近，經(jīng)動脈放療栓塞vs索拉非尼的Ⅲ期試驗未達到主要終點，兩者治療效果對比尚不明確[46]。2017年4月，美國食品藥品監(jiān)督管理局批準瑞戈非尼可在索拉非尼治療晚期肝細胞癌進展時應用，索拉非尼序貫瑞戈非尼療法可能對于晚期肝細胞癌患者是一個很好的選擇。在多項臨床試驗中，3種系統(tǒng)性藥物在晚期肝細胞癌治療中均顯示出生存益處，包括一線治療藥物索拉非尼和樂伐替尼，以及二線治療藥物瑞戈非尼。2018年，美國臨床腫瘤學會消化腫瘤研討會報道第二、三線治療的第4種靶向藥物——卡博替尼治療晚期肝細胞癌效果優(yōu)于安慰劑，患者總生存期也從8個月提高到10.2個月[47]。在不久的將來，基于靶點的藥物篩選策略將朝著3個方向發(fā)展：(1)尋找肝膽腫瘤的敏感突變位點，為新一代藥物的設計提供新的靶標；(2)從多位點多種藥物聯(lián)合治療的策略解決患者治療的復雜性問題；(3)進一步揭示“一次突變”背景下，腫瘤可能產(chǎn)生的“二次突變”進而抵抗藥物治療的分子機制，為進一步靶向和治療肝膽腫瘤提供依據(jù)。

3 基于人工智能和大數(shù)據(jù)整合分析的新型藥物篩選技術

隨著信息時代下計算機分析能力的突飛猛進，人工智能也越來越多地被應用到了現(xiàn)實生活中，腫瘤藥物篩選便是其未來主要發(fā)展方向之一。當前，人工智能已經(jīng)可以借助腫瘤患者全基因組測序數(shù)據(jù)，結合患者體內(nèi)外的病理模型和藥物敏感性的數(shù)據(jù)，對患者的治療提供全方位、多層面的藥物治療指導。

Yao等[48]構建了一個緊密連接的深層神經(jīng)網(wǎng)絡(Densely Connected Deep Neural Networks)，使用13個最常用的肝功能檢測指標和人口信息進行肝臟疾病篩查。在一個包含76 914個樣本的數(shù)據(jù)集上進行測試，ROC曲線下面積為0.8919，隨機曲線下面積為0.8790，邏輯模型曲線下面積為0.797。結果表明，該模型的性能明顯優(yōu)于傳統(tǒng)方法，深層神經(jīng)網(wǎng)絡模型的性能優(yōu)于DNN(深度神經(jīng)網(wǎng)絡)模型。α胎兒蛋白是目前唯一用于肝癌篩查的血液標志物，但其敏感度和特異度均很低，臨床應用受限。對此，Tao等[49]開發(fā)了一種基于體細胞拷貝數(shù)畸變的機器學習驅(qū)動模型，用于HBV感染者早期肝癌的非侵入性檢測。經(jīng)過嚴格的獨立驗證，該模型表現(xiàn)出穩(wěn)健的預測性能，2個驗證組的ROC曲線下面積分別為0.920和0.812。由于早期診斷的復雜性，大多數(shù)肝癌患者發(fā)現(xiàn)時已進入晚期，尤其是肝硬化患者。經(jīng)過Signal課題組[50]和其他機構的研究，機器學習算法可以提高肝硬化患者分層的準確性，并能準確地識別肝癌高危患者。理想的肝癌預后的關鍵挑戰(zhàn)是盡早發(fā)現(xiàn)疾病，以上2種方法的結合，為改善肝癌患者的預后提供了一個巨大的機會。肝癌的預后很大程度上取決于核分級和微血管位置[51]。Cucchetti等[52]開發(fā)了一種全新的算法系統(tǒng)，可以根據(jù)非侵入性變量預測腫瘤分級和微血管的位置信息。與傳統(tǒng)的模型相比，其可以根據(jù)術前變量更準確地識別肝癌腫瘤分級和微血管的位置信息，并調(diào)整治療計劃和預后的判斷。Xu等[53]提出一種結合大規(guī)模臨床和影像學的計算方法，特別是增強CT的影像學特征，來預測肝癌患者的核分級和微血管的位置和預后，為基礎的機器學習模型。該模型在訓練和驗證集中的ROC曲線下面積為0.909，在測試集中的ROC曲線下面積為0.889。同一類型報告的ROC曲線下面積為0.806[54]和0.918[55]。這些結合的人工智能方法可以加強與患者關于治療方案的溝通，并指導臨床管理人員使用更好的降低復發(fā)風險的藥物。人工智能輔助臨床治療腫瘤已經(jīng)開始在手術中應用，而受制于目前臨床患者信息及藥物數(shù)據(jù)的不完善和不全面的問題，目前利用人工智能預測藥物的策略尚未展開大規(guī)模的應用，但隨著測序活動的推進和數(shù)據(jù)庫的進一步完善，人工智能在這個基礎上可以獲得進一步的訓練，其預測患者對藥物反應的能力將大大提升，將更好地為臨床治療提供依據(jù)。相信，基于人工智能和大數(shù)據(jù)整合分析的新型藥物篩選技術在未來必將會大放異彩。

總結當前的肝膽腫瘤藥物篩選模型(表1)，可見隨著技術的發(fā)展，越來越多的新興技術開始在肝膽腫瘤的藥物篩選領域嶄露頭角，腫瘤的診斷及治療正在完成從整體性治療到“個性化”及“精確化”治療的升級或轉(zhuǎn)變，可以預見的是，以類器官的培養(yǎng)為代表的精準醫(yī)學技術將會在未來更加精準有效地輔助臨床的治療。

表1 肝膽腫瘤模型與精準藥物篩選新技術

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：劉壯負責撰寫論文，文獻篩選，整理數(shù)據(jù)和修改論文；高棟負責擬定寫作思路，指導撰寫論文及并最終定稿。