王 燕， 張禮寧， 唐方毅,3， 趙曉曉,4， 奚亞軍， 王偉偉*

(1. 楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 陜西 楊凌 712100； 2. 西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 陜西 楊凌 712100；3. 中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所， 北京 100020；4. 高邑縣第一中學(xué)， 河北 石家莊 051330)

轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)、發(fā)育、代謝和繁殖等多種生物學(xué)進(jìn)程[1]。GRF是一種調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育和非生物脅迫反應(yīng)的特異性轉(zhuǎn)錄因子[2-4]。GRF蛋白的N端區(qū)域包含QLQ和WRC兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，QLQ(Gln，Leu，Gln)可以與GRF相互作用因子(GRF-interactingfactors,GIF)相互作用形成功能復(fù)合物進(jìn)行轉(zhuǎn)錄激活[5-6]；WRC包含一個(gè)核定位信號(hào)和一個(gè)用于DNA結(jié)合的C3H型鋅指結(jié)構(gòu)，可以與下游基因的啟動(dòng)子區(qū)域相互作用從而調(diào)節(jié)其表達(dá)[7]。GRF蛋白的C端區(qū)域包含一些保守性較低的結(jié)構(gòu)域，比如FFD，TQL和GGPL等，其可作為反式激活結(jié)構(gòu)域[8-9]。

目前已經(jīng)在多個(gè)物種進(jìn)行了GRF全基因組鑒定和分析，包括擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)[2]、水稻(OryzasativaL.)[5]、玉米(ZeamaysL.)[9]、大豆(GlycinemaxL.)[10]和小麥(TriticumaestivumL.)[11]等。GRF作為生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，可以通過細(xì)胞增殖來調(diào)控葉片的形狀和大小[12-13]。擬南芥AtGRF1，AtGRF2和AtGRF5的過表達(dá)植株葉片比野生型(WT)更大[2,12-13]，atgrf1/2/3，atgrf3，atgrf4和atgrf5突變體植株的葉片則比野生型更小[3,14-15]。先前報(bào)道表明水稻OsGRF家族基因參與調(diào)節(jié)植物的細(xì)胞增殖、花發(fā)育和種子的發(fā)育。例如，水稻OsGRF1由赤霉素誘導(dǎo)并調(diào)節(jié)水稻莖的生長(zhǎng)[6]；OsGRF3,OsGRF4和OsGRF5 的敲除導(dǎo)致植株矮化并延遲了生長(zhǎng)和花序形成[16]；同時(shí)OsGRF4 在調(diào)控水稻籽粒大小過程中發(fā)揮重要作用[17]。過表達(dá)ZmGRF10通過減少細(xì)胞增殖導(dǎo)致玉米葉片尺寸和株高降低[18]。在甘藍(lán)型油菜中，BnGRF2通過調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)量和植物光合作用來提高籽粒的產(chǎn)量[15]。研究表明大部分GRF基因可作為miR396的靶基因，其表達(dá)水平在轉(zhuǎn)錄后受miR396的調(diào)控，參與調(diào)節(jié)植物根，莖和葉的生長(zhǎng)和發(fā)育[19-21]。例如，擬南芥miR396a和miR396b的組成性過表達(dá)和ath-miR396a在煙草中的異源表達(dá)都降低了GRFs基因的表達(dá)，導(dǎo)致葉片變得更窄、更小[22-23]；柳枝稷(PanicumvirgatumL.)中13個(gè)GRF基因在轉(zhuǎn)錄過程中被miR396 識(shí)別并沉默，其中同義突變的過表達(dá)柳枝稷rPvGRF1，rPvGRF3和rPvGRF9植株可以抵消miR396 的作用，并且PvGRF9的過表達(dá)可以有效提高植株高度和生物質(zhì)產(chǎn)量[24]。GRF家族成員在多種脅迫激素反應(yīng)中也發(fā)揮作用，擬南芥AtGRF7在正常生長(zhǎng)條件下作為滲透脅迫響應(yīng)基因的阻遏物，可以抑制脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)來減少對(duì)植物生長(zhǎng)的不利影響；在脅迫條件下，其表達(dá)被抑制以激活滲透脅迫響應(yīng)基因[25]。同時(shí)，多個(gè)物種GRF基因響應(yīng)干旱、鹽、脫落酸(Abscisic acid，ABA)、赤霉素(Gibberellins，GA)和茉莉酸(Jasmonic acid，JA)等脅迫和激素處理暗示著它們參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的表達(dá)調(diào)控[8-11,26-27]。

柳枝稷是一種多年生C4草本植物，植株高大、根系發(fā)達(dá)，生物質(zhì)產(chǎn)量可達(dá)20 t·hm-2，根系長(zhǎng)度可達(dá)300 cm，在生產(chǎn)過程中很少需要能源投入，是一種具有高生產(chǎn)和低投入特性的模式能源作物[28]；隨著不可再生化石燃料的枯竭，利用能源作物生產(chǎn)乙醇將具有更好的前景[29-30]。由于耕地的有限性，柳枝稷經(jīng)常被種植在邊際土地上，不可避免的會(huì)受到多種非生物脅迫，從而降低其生物質(zhì)產(chǎn)量[31-33]，因此研究柳枝稷生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)基因和脅迫相關(guān)基因在提高柳枝稷生物質(zhì)產(chǎn)量具有重要的生產(chǎn)意義。本研究從全基因組水平對(duì)柳枝稷PvGRF家族進(jìn)行詳細(xì)的鑒定分析，包括系統(tǒng)發(fā)育、保守基序、基因結(jié)構(gòu)、共線性分析以及表達(dá)模式分析等，研究結(jié)果為柳枝稷GRF基因在其生長(zhǎng)發(fā)育及脅迫反應(yīng)的功能研究中提供一些候選基因。

1 材料與方法

1.1 植物材料和脅迫處理

柳枝稷(PanicumvirgatumL.)種子在覆有濾紙的發(fā)芽盒中發(fā)芽7 d后，選取生長(zhǎng)一致的幼苗轉(zhuǎn)移到營(yíng)養(yǎng)液中，培養(yǎng)箱參數(shù)為光照28℃(16 h)和黑暗24℃(8 h)。生長(zhǎng)36 d后進(jìn)行處理，處理方法為20%(w/v)的聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)、200 mM的氯化鈉(Sodium chloride,NaCl)、50 μM的ABA、1 mM的茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate,MeJA)和200 mM的水楊酸(Salicylic acid,SA)，分別在處理0,2和6 h后取葉片部位，每個(gè)處理取20株混合樣，之后在液氮中迅速冷凍，于-80℃保存，每個(gè)處理進(jìn)行三次生物學(xué)重復(fù)和三次技術(shù)重復(fù)。

1.2 柳枝稷PvGRF轉(zhuǎn)錄因子家族成員鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過JGI(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#)，tair(https://www.arabidopsis. org/index.jsp)和RGAP)http://rice.plantbiology.msu.edu/)獲取柳枝稷、擬南芥和水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，通過Pfam(http://pfam.xfam.org/)網(wǎng)站獲取GRF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域特征文件QLQ (PF08880) 和WRC (PF08879)。利用HMMER)v3.0)程序搜索柳枝稷GRF基因(e-value

1.3 PvGRF蛋白序列分析

通過ExPASy(https://www.expasy.org/)網(wǎng)站獲取柳枝稷GRF蛋白的等電點(diǎn)和相對(duì)分子量。通過MEME(http://meme-suite.org/)在線程序分析柳枝稷GRF蛋白的保守基序(結(jié)構(gòu)域的寬度設(shè)置為10～100，結(jié)構(gòu)域數(shù)目為9，其它參數(shù)為默認(rèn))。利用Gene Structure Display Server(GSDS：http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)網(wǎng)站繪制GRF基因結(jié)構(gòu)圖。

1.4 PvGRF啟動(dòng)子預(yù)測(cè)

從柳枝稷基因組獲取GRF家族所有成員ATG啟動(dòng)子上游區(qū)域的1500 bp核苷酸序列，提交PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)網(wǎng)站對(duì)GRF成員的啟動(dòng)子序列進(jìn)行順式作用元件分析，最后在GSDS網(wǎng)站進(jìn)行繪圖。

1.5 GRF基因的共線性分析

通過柳枝稷和水稻基因數(shù)據(jù)庫(kù)分別獲得其基因組信息和所有基因的位置信息，利用MCscanX[34]獲取柳枝稷種內(nèi)、柳枝稷和水稻種間的共線性信息，通過circos (version 0.69)繪制圖形。

1.6 PvGRF基因組織表達(dá)譜的構(gòu)建

從柳枝稷數(shù)據(jù)庫(kù)獲取GRF組織特異性表達(dá)數(shù)據(jù)[35]，進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理后，利用R(v4.0.3)繪制圖譜。

1.7 RNA提取和qRT-PCR分析

利用Trizol試劑盒提取柳枝稷總RNA，根據(jù)RT-PCR試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用primer 6軟件設(shè)計(jì)引物并確定其特異性，選用elongationfactor1α(EF1α)作為內(nèi)參基因，在QuantStudio 5 Real-Time PCR system(Thermo Fisher,MA,USA)上利用TB GreenTMPremix Ex TaqTMII(TaKaRa,Dalian,China) 試劑進(jìn)行GRF家族成員的定量試驗(yàn)。運(yùn)行程序?yàn)椋?5℃ 5 s，60℃ 31 s，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。通過2-ΔΔCt方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，在SPSS中進(jìn)行studentt檢驗(yàn)對(duì)不同處理之間的差異分析，2倍以上的差異且P<0.05被用來確定基因顯著性差異表達(dá)[26]，在Microsoft Excel 2019進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PvGRF基本信息

利用HMMER程序搜索柳枝稷數(shù)據(jù)庫(kù)，去除冗余后共獲得19個(gè)PvGRF基因，根據(jù)其在染色體上的位置分別命名為PvGRF1～PvGRF19(表1)。柳枝稷PvGRF蛋白長(zhǎng)度有所不同，PvGRF1長(zhǎng)度最短為206 aa，PvGRF7蛋白長(zhǎng)度最長(zhǎng)為609 aa。將PvGRF家族蛋白提交ExPASy進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析，其理論等電點(diǎn)(PI)在5.07～9.77之間，分子量(MW)在21.41～63.30 kDa之間。

表1 柳枝稷PvGRF家族概況Table 1 The Overview of PvGRF family in switchgrass

2.2 柳枝稷、擬南芥和水稻的系統(tǒng)發(fā)育分析

本研究利用9個(gè)擬南芥GRF成員、12個(gè)水稻GRF成員和19個(gè)柳枝稷的GRF成員構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1)。結(jié)果顯示，GRF家族共分為6個(gè)亞家族，命名為A～F，分別包含9，7，11，2，2和9個(gè)GRF成員；其中亞家族A只包含柳枝稷和水稻GRF成員，亞家族D和E只包含擬南芥GRF成員。

柳枝稷GRF家族系統(tǒng)進(jìn)化分析表明(圖2A)，柳枝稷GRF家族可分為亞家族I，II，III和IV(分別對(duì)應(yīng)圖1的亞家族C，B，A和F)，分別包含5，3，6和5個(gè)GRF成員。

圖1 柳枝稷、擬南芥和水稻GRF成員的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.1 Phylogenetic tree of GRF members of switchgrass,Arabidopsis and rice注：黃色方框、紅色三角和綠色圓形分別代表柳枝稷、擬南芥和水稻GRF基因；外圈代表A～F分組Note:Yellow rectangle,red triangle and green circle respectively represent GRF genes in switchgrass,Arabidopsis and rice respectively. The outer circle represents the group of A～F

2.3 保守基序分析

將柳枝稷PvGRF蛋白提交至MEME，對(duì)其保守基序進(jìn)行分析(圖2)。結(jié)果表明，不同的亞家族具有不同的結(jié)構(gòu)域特征，同一個(gè)亞家族內(nèi)成員具有相似的結(jié)構(gòu)域特征。具體如下：柳枝稷PvGRF成員都包含保守的Motif1(QLQ結(jié)構(gòu)域)和Motif2(WRC結(jié)構(gòu)域)，其次，亞家族I包含Motif5，Motif6和Motif7；亞家族II包含Motif5；亞家族III包含Motif3，Motif4和Motif5；亞家族IV包含Motif7，Motif8和Motif9。

圖2 柳枝稷PvGRF家族蛋白的保守基序Fig.2 Conserved motifs of PvGRF family proteins in switchgrass注：A表示柳枝稷PvGRF家族的系統(tǒng)發(fā)育樹，不同的顏色代表不同的亞家族；B表示PvGRF蛋白保守基序分布情況，其中Motif 1代表QLQ結(jié)構(gòu)域，Motif 2代表WRC結(jié)構(gòu)域，底部的比例尺代表氨基酸長(zhǎng)度Note:A represents the phylogenetic tree of switchgrass PvGRF family,with different colors representing different subfamilies. B represents conserved motifs distribution of PvGRF proteins,in which Motif 1 represents the QLQ domain,Motif 2 represents the WRC domain,and the scale bar on the bottom line indicates size of Amino acids

2.4 基因結(jié)構(gòu)分析

從柳枝稷數(shù)據(jù)庫(kù)提取GRF家族成員的位置信息，在GSDS進(jìn)行可視化。根據(jù)圖3可以看出，不同的亞家族具有不同的基因結(jié)構(gòu)，同一個(gè)亞家族具有相似的基因結(jié)構(gòu)。亞家族I，亞家族II和亞家族IV成員分別包含3，2和2個(gè)內(nèi)含子，亞家族III大多數(shù)成員包含4個(gè)內(nèi)含子(PvGRF11包含3個(gè)內(nèi)含子)。

圖3 柳枝稷PvGRF家族成員的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)Fig.3 Exon-intron structure of members of the PvGRF family in switchgrass注：A表示柳枝稷PvGRF家族的系統(tǒng)發(fā)育樹，不同的顏色代表不同的亞家族；B表示PvGRF基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，黑色線、藍(lán)色柱狀和黃色柱狀分別代表內(nèi)含子、非翻譯區(qū)和基因編碼區(qū)，底部的比例尺表示基因長(zhǎng)度Note:A represents the phylogenetic tree of switchgrass PvGRF family,with different colors representing different subfamilies. B represents exon-intron structure of PvGRF genes. Black line,blue column and yellow column represent intron,untranslated region and gene coding region respectively. The scale bar on the bottom line indicates size of genes

2.5 柳枝稷PvGRF家族的共線性分析

基因加倍事件促使了基因功能分化和多樣化。通過MCscanX獲取柳枝稷中GRF家族成員的共線性信息，在circos進(jìn)行作圖。如圖4所示，19個(gè)PvGRF基因不均勻分布在柳枝稷11條染色體上，7條染色體上未定位到；其中染色體Chr01N上分布最多，有4個(gè)PvGRF基因；其次染色體Chr02K，Chr01K，Chr04N和Chr09N分別分布有3，2，2和2個(gè)PvGRF基因；剩余的6個(gè)PvGRF基因分別分布在染色體Chr02N，Chr04K，Chr07K，Chr07N，Chr08K和Chr08N上。柳枝稷中13個(gè)PvGRF基因發(fā)生了10對(duì)共線性事件，包含一一對(duì)應(yīng)、一對(duì)二和一對(duì)三等三種共線性關(guān)系，它們都屬于節(jié)段性重復(fù)事件。其中一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系包括PvGRF11-PvGRF12和PvGRF16-PvGRF17；一對(duì)二的關(guān)系包含PvGRF2-PvGRF14/PvGRF15，PvGRF4-PvGRF1/PvGRF15和PvGRF10-PvGRF8/PvGRF9，一對(duì)三的關(guān)系包括PvGRF14-PvGRF2/PvGRF3/PvGRF15和PvGRF15-PvGRF2/PvGRF4/PvGRF14。

圖4 柳枝稷PvGRF基因的位置分布和共線性分析Fig.4 The distribution on chromosomes and synteny analysis of switchgrass PvGRF gene注：圓圈代表柳枝稷的18條染色體，黑色連線代表兩個(gè)基因的共線性區(qū)塊Note:The colored circle represents 18 chromosomes in switchgrass,and the black lines represent the synteny regions

2.6 柳枝稷和水稻GRF家族的共線性分析

通過比較柳枝稷與水稻基因組中的GRF基因，可以比較分析柳枝稷中GRF基因的起源、進(jìn)化歷史和功能相似性。本研究利用MCscanX獲取柳枝稷和水稻GRF家族成員的共線性信息。如圖5所示，共有15個(gè)柳枝稷基因和11個(gè)水稻基因被鑒定為直系同源關(guān)系，存在20對(duì)共線性區(qū)段。共線關(guān)系包含一個(gè)水稻基因?qū)?yīng)兩個(gè)柳枝稷基因，例如OsGRF1-PvGRF5/PvGRF6，OsGRF12-PvGRF1/PvGRF4和OsGRF5-PvGRF11/PvGRF12等；一個(gè)柳枝稷基因?qū)?yīng)兩個(gè)水稻基因，例如PvGRF1-OsGRF10/OsGRF12，PvGRF6-OsGRF1/OsGRF2和PvGRF15-OsGRF3/OsGRF4；值得注意的是，僅有兩對(duì)基因被確定為一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系，包括PvGRF18-OsGRF6和PvGRF19-OsGRF9。

圖5 柳枝稷和水稻GRF基因的共線性分析Fig.5 Synteny regions distribution of GRF genes between switchgrass and rice注：圓圈分別代表柳枝稷18條染色體和水稻的12條染色體，不同顏色的連線代表柳枝稷與水稻GRF基因的共線性區(qū)域Note:The colored circle represents 18 chromosomes in switchgrass and 12 chromosomes in rice. The thick colored bars represent synteny regions of GRF genes between switchgrass and rice

2.7 啟動(dòng)子分析

利用PlantCARE在線工具分析了柳枝稷GRF基因的啟動(dòng)子區(qū)域(圖6)。結(jié)果顯示，GRF基因啟動(dòng)子區(qū)域包含有激素和脅迫相關(guān)的順式作用元件；10種激素相關(guān)的順式作用元件包括ABRE(18.48%)，TGA-element(2.37%)，AuxRR-core(2.37%)，ERE(2.37%)，GARE-motif(0.47%)，TATC-box(1.90%)，P-box(1.42%)，CGTCA-motif(15.64%)，TGACG-motif(15.64%)和TCA-element(5.21%)，7種脅迫相關(guān)的順式作用元件包括LTR(4.74%)，TC-rich repeats(2.37%)，DRE(3.79%)，MBS(4.27%)，W box(6.64%)，ARE(10.43%)和WUN-motif(1.90%)。

圖6 PvGRF家族成員啟動(dòng)子區(qū)域中順式作用元件的分布Fig.6 Cis-acting element distribution in the promoter region of PvGRF members注：黑色細(xì)線代表PvGRF基因編碼區(qū)上游的1500 bp區(qū)域，不同顏色的方塊代表不同的順式作用元件Note:The thin black lines represent the 1500 bp upstream region of PvGRF encoding regions,and the rectangles of different colors represent different cis-acting elements

2.8 柳枝稷PvGRF家族組織表達(dá)分析

從數(shù)據(jù)庫(kù)提取了19個(gè)GRF基因的表達(dá)數(shù)據(jù)，包含21個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的組織或器官。通過R軟件作圖后可以看出(圖7)，柳枝稷GRF基因具有不同的表達(dá)模式。例如，PvGRF6，PvGRF7，PvGRF18和PvGRF19在花序組織中具有較高的表達(dá)量，在莖和葉片中表達(dá)量較低；PvGRF2，PvGRF11，PvGRF12，PvGRF16和PvGRF17在花序和種子中都具有較高的表達(dá)量；PvGRF4在花序和莖中具有較高表達(dá)量，同時(shí)在種子、根和葉片中也具有高表達(dá)量；值得注意的是，PvGRF5在21個(gè)不同組織或發(fā)育階段都具有很高的表達(dá)量。

圖7 PvGRF基因組織特異性表達(dá)分析Fig.7 Tissue specific expression analysis of PvGRF genes注：Seed0 d，Seed5 d，Seed10 d，Seed15 d，Seed20 d，Seed25 d和Seed30 d分別表示開花期的全花，5 d的種子、種子可見穎果期、乳熟期的種子、蠟熟初期種子、蠟熟后期的種子和生理成熟階段的種子。Inflo-meristem，Inflo-floret，Inflo-REL和Inflo-PEM分別代表0.5～3.0 mm，10～20 mm，50～150 mm和大于200 mm的花序。E4-LFB，E4-LSH，E4-node，E4i4t，E4i4b，E4i4 m，E4i3 m，E4i3 mVB，E4-crown，E4-root分別代表E4期的葉片、葉鞘、節(jié)、第4節(jié)間頂部1/5片段、第4節(jié)間底部1/5片段、第4節(jié)間中間1/5片段、第3節(jié)間中間1/5片段、第三個(gè)節(jié)間分離維管束的1/5片段、花冠和根Note:Seed0 d,Seed5 d,Seed10 d,Seed15 d,Seed20 d,Seed25 d and Seed30 d respectively represent the whole flower at the flowering stage,the seed at 5 d,the visible caryopsis stage of the seed,the seed at the milky stage,the seed at the soft dough stage,and the seed at the hard dough stage and seed at maturity stage. Inflo-meristem,Inflo-floret,Inflo-REL,and Inflo-PEM represent inflorescences 0.5～3.0 mm,10～20 mm,50～150 mm,and larger than 200 mm,respectively. E4-LFB,E4-LSH,E4-node,E4i4t,E4i4b,E4i4 m,E4i3 m,E4i3 mVB,E4-crown,and E4-root represent leaf blade,leaf sheath,node,top 1/5 fragment of the fourth internode,bottom 1/5 fragment of the 4th internode,middle 1/5 fragment of the 4th internode,middle 1/5 fragment of the 3rd internode,1/5th fragment of the separating vascular bundle of the third internode,whole crown and root system from E4 stage,respectively

2.9 非生物脅迫下PvGRF基因的表達(dá)模式分析

為了探索柳枝稷GRF基因在不同脅迫和激素處理下的表達(dá)模式，本研究選取6個(gè)PvGRF基因進(jìn)行qRT-PCR分析(圖8)，結(jié)果顯示PvGRF基因在多種處理下發(fā)生差異表達(dá)。在鹽脅迫中，PvGRF2，PvGRF17和PvGRF19在2 h處理后顯著上調(diào)表達(dá)(P<0.05)，分別達(dá)到對(duì)照(0 h)的3.7，4.2和4.8倍；PvGRF10和PvGRF17在PEG處理2 h后顯著下調(diào)表達(dá)(P<0.05)；在ABA處理中，PvGRF2，PvGRF9和PvGRF10的表達(dá)量分別在6，2和2 h處理下顯著下降，PvGRF19在2 h處理下顯著升高(P<0.05)；在MeJA處理中，PvGRF2，PvGRF9，PvGRF10和PvGRF17的表達(dá)量分別在2，2，2和6 h處理下顯著下降，表達(dá)量分別下降了0.75，0.74，0.71和0.71倍，而PvGRF7和PvGRF19的表達(dá)在2 h處理下分別升高到對(duì)照組的2.1和9.4倍(P<0.05)；在SA處理中，PvGRF7，PvGRF9和PvGRF10的表達(dá)量在6 h處理下顯著下降(P<0.05)。

圖8 不同脅迫和激素處理下PvGRF基因差異表達(dá)分析Fig.8 Differential expression analysis of PvGRF gene under different stress and hormone treatments注：*顯著相關(guān)(P<0.05);誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)差(SD)Note:* means significant correlation at the 0.05 level;Error bars represent standard deviations

3 討論與結(jié)論

GRF轉(zhuǎn)錄因子家族在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中起著重要作用。從水稻中鑒定的第一個(gè)GRF基因介導(dǎo)赤霉素調(diào)節(jié)水稻莖生長(zhǎng)以來，已經(jīng)在多個(gè)物種進(jìn)行了GRF全基因組鑒定分析，然而關(guān)于柳枝稷GRF基因的研究還未見報(bào)道，本研究在柳枝稷中共鑒定了19個(gè)PvGRF成員，多于擬南芥中的9個(gè)[2]，水稻中的12個(gè)[5]和玉米中的14個(gè)GRF成員[9]；少于大豆中的20個(gè)[10]和小麥中的30個(gè)[11]GRF成員。柳枝稷、擬南芥和水稻的系統(tǒng)進(jìn)化分析表明(圖1)，這三個(gè)物種的GRF蛋白可分為6個(gè)亞家族，在大豆GRF家族的研究中也出現(xiàn)相似的結(jié)果[10]；擬南芥GRF成員分布在亞家族A，B，C，D和E，而水稻和柳枝稷GRF成員都分布于亞家族A，B，C和F，說明柳枝稷的GRF家族成員和水稻有更近的親緣關(guān)系；并且柳枝稷和水稻同為單子葉植物，這也符合植物的進(jìn)化歷史。

柳枝稷PvGRF家族成員分為四個(gè)亞家族(圖2,圖3)。模體結(jié)構(gòu)和基因結(jié)構(gòu)可作為基因之間進(jìn)化關(guān)系的支持依據(jù)，同一個(gè)亞家族具有相似的基因結(jié)構(gòu)和模體結(jié)構(gòu)，不同的亞家族具有不同的基因結(jié)構(gòu)和模體結(jié)構(gòu)[36]，本研究也得出相同的結(jié)果，這暗示著柳枝稷GRF同一亞家族成員具有功能相似性；另一方面，基因結(jié)構(gòu)的分化往往也意味著基因功能的不同[37]。此外，PvGRF蛋白在亞家族中的結(jié)構(gòu)保守性與擬南芥、水稻、大豆和玉米等一致。

在植物進(jìn)化過程中，大部分基因都經(jīng)歷了加倍化進(jìn)程，基因重復(fù)在不同的進(jìn)化方向上具有發(fā)生分化的可能性[38]?；蛲ǔ６济媾R著三種不同的命運(yùn)：新功能化，非功能化或亞功能化；這些不同的命運(yùn)為重復(fù)基因提供了獲得功能多樣性的機(jī)會(huì)，從而增加了生物的復(fù)雜性[39]?；蛑貜?fù)主要包括節(jié)段性重復(fù)事件和串聯(lián)重復(fù)事件[40-41]，本研究中未發(fā)現(xiàn)任何串聯(lián)重復(fù)的基因加倍事件，但是有10對(duì)基因被確定為節(jié)段性重復(fù)事件(圖4)，包括PvGRF1-PvGRF4，PvGRF4-PvGRF15和PvGRF16-PvGRF17等，因此可以推斷節(jié)段性重復(fù)事件有助于柳枝稷GRF基因的擴(kuò)張。使用比較基因組學(xué)方法可以很好的研究未鑒定物種的基因組結(jié)構(gòu)和進(jìn)化，它被認(rèn)為是揭示研究較少的生物中基因生物學(xué)功能的相對(duì)快速和有效的方法[42]，柳枝稷和水稻的共線性分析中共鑒定出20對(duì)直系同源基因(圖5)，同源基因?qū)赡芫哂邢嗨频墓δ躘43]；例如，OsGRF1在GA誘導(dǎo)的莖伸長(zhǎng)中起調(diào)節(jié)作用，這為柳枝稷中同源基因PvGRF5/PvGRF6的功能研究提供參考依據(jù)。

本研究利用組織表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)GRF進(jìn)行了組織特異性表達(dá)分析(圖7)，結(jié)果表明多個(gè)PvGRF基因包括PvGRF2，PvGRF6，PvGRF7和PvGRF11等在花序中具有較高的表達(dá)量，PvGRF2，PvGRF4和PvGRF11等在種子中具有較高的表達(dá)量。在以前的研究中，擬南芥中多個(gè)GRF基因在花發(fā)育進(jìn)程中發(fā)揮作用[3,23,44]，水稻OsGRF3，OsGRF4和OsGRF5的RNA干擾沉默導(dǎo)致花序形成的延遲[16]；OsGIF1直接與OsGRF4相互作用參與調(diào)節(jié)水稻籽粒大小[17]。因此本文推測(cè)這些PvGRF基因可能在柳枝稷花和種子生長(zhǎng)生命進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。

啟動(dòng)子分析表明柳枝稷GRF基因包含多種脅迫和激素相關(guān)的順式作用元件(圖6)，包括ABRE，TGA-element，DRE和MBS等，這可能是PvGRF基因參與植物生長(zhǎng)發(fā)育和非生物脅迫的證據(jù)。為了評(píng)估PvGRF基因在各種脅迫和激素下的作用，包括非生物脅迫(PEG和NaCl)和激素處理(ABA，MeJA和SA)，本研究對(duì)PvGRF基因進(jìn)行了qRT-PCR分析(圖8)。結(jié)果表明，PvGRF基因在各種非生物脅迫和激素處理下具有不同的表達(dá)模式。例如，PvGRF19在NaCl和ABA處理后顯著上調(diào)表達(dá)；PvGRF17在PEG和MeJA處理后的表達(dá)量顯著下降；PvGRF7在MeJA處理后顯著上調(diào)表達(dá)，在SA處理后顯著下調(diào)表達(dá)。最新的研究表明，柳枝稷中13個(gè)GRF基因被miR396 靶向切割，轉(zhuǎn)基因PvGRF9正向調(diào)節(jié)柳枝稷的植株高度和生物質(zhì)產(chǎn)量，并且過表達(dá)PvGRF9和同義突變過表達(dá)rPvGRF9可以恢復(fù)OE-miR396株系的表型[24]。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步證明了在柳枝稷生長(zhǎng)發(fā)育過程中GRF基因的功能多樣性和不可缺少性以及miR396 靶向調(diào)控GRF基因的密切關(guān)系。

本研究對(duì)柳枝稷GRF基因家族進(jìn)行了詳細(xì)的鑒定和分析，通過多種生物信息學(xué)方法來預(yù)測(cè)GRF基因的生物學(xué)功能，并使用qRT-PCR進(jìn)一步確定了GRF基因在柳枝稷生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆性反應(yīng)中具有重要作用。本研究為柳枝稷GRF家族基因的功能研究提供了基礎(chǔ)，為柳枝稷GRF基因參與抗逆性應(yīng)答調(diào)控提供了依據(jù)。