王思威， 常 虹， 王瀟楠， 孫海濱， 劉艷萍

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)試驗(yàn)室，廣東 廣州 510640)

1 前言

氟吡菌酰胺是拜耳公司開(kāi)發(fā)的吡啶乙基苯酰胺類(lèi)殺菌劑，主要用于防治蔬菜、水果等作物的病害，作用機(jī)理為琥珀酸脫氫酶抑制劑[1-3]。肟菌酯屬甲氧基丙烯酸脂類(lèi)殺菌劑，具有高效、廣譜、保護(hù)、治療、鏟除、滲透、內(nèi)吸活性、耐雨水沖刷、持效期長(zhǎng)等殺菌特性，對(duì)幾乎所有真菌綱(子囊菌綱、擔(dān)子菌綱、卵菌綱和半知菌類(lèi))病害如白粉病、銹病、潁枯病、網(wǎng)斑病、霜霉病、稻瘟病等均有良好的活性[4-5]。43%氟吡菌酰胺·肟菌酯懸浮劑(商品名露娜森)是由拜耳公司研發(fā)的氟吡菌酰胺和肟菌酯復(fù)配混合制劑，可同時(shí)抑制真菌孢子萌發(fā)、芽管伸長(zhǎng)、菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，與其他殺菌劑不易產(chǎn)生交互抗性，被廣泛用于果樹(shù)、蔬菜上病菌的防治，應(yīng)用前景廣闊。

目前，35%氟吡菌酰胺·戊唑醇懸浮劑、41.7%氟吡菌酰胺懸浮劑、75%肟菌酯·戊唑醇水分散粒劑等的分析方法有相關(guān)報(bào)道[3，5-6]，但關(guān)于氟吡菌酰胺和肟菌酯混配制劑的分析方法未見(jiàn)公開(kāi)報(bào)道。本文采用高效液相色譜法對(duì)試樣中氟吡菌酰胺和肟菌酯進(jìn)行定量分析，該方法操作快速、簡(jiǎn)便，分離度和精密度均能滿足定量分析要求。

2 試驗(yàn)部分

2.1 試劑和溶液 乙腈：色譜純；水：超純水；氟吡菌酰胺標(biāo)準(zhǔn)品純度為99.2%(CHEM SERVICE)；肟菌酯標(biāo)準(zhǔn)品純度為99.5%(CHEM SERVICE)；43%氟吡菌酰胺·肟菌酯懸浮劑。

2.2 儀器 高效液相色譜儀：島津LC-20A，帶可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器和自動(dòng)控溫進(jìn)樣器；色譜柱WondaSil C18-WR(150mm×4.6mm，5μm)；過(guò)濾器：微孔濾膜，孔徑0.22μm。

2.3 高效液相色譜操作條件 流動(dòng)相：乙腈-水(體積比60：40)；柱溫：35℃；流速：1mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：220nm；進(jìn)樣量：10μL；氟吡菌酰胺保留時(shí)間5.67 min，肟菌酯保留時(shí)間14.42min。

典型的氟吡菌酰胺、肟菌酯以及43%氟吡菌酰胺·肟菌酯懸浮劑試樣液相色譜圖(圖1～2)。

圖1 氟吡菌酰胺和肟菌酯標(biāo)樣液相色譜圖

圖2 43%氟吡菌酰胺·肟菌酯懸浮劑液相色譜圖

2.4 測(cè)定步驟

2.4.1 標(biāo)樣溶液的配制 分別準(zhǔn)確稱(chēng)取氟吡菌酰胺和肟菌酯標(biāo)樣0.05g(精確至0.000 2g)于不同的50mL容量瓶中，用甲醇溶解，超聲振蕩5min，定容至刻度，搖勻。用移液管移取上述溶液5mL于25mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻，備用。

2.4.2 試樣溶液的配制 準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1g(精確至0.000 2g)樣品于50mL容量瓶中，用甲醇溶解，超聲振蕩5min，稀釋至刻度，搖勻備用。

2.4.3 測(cè)定 在上述操作條件下，待儀器基線穩(wěn)定后，連續(xù)注入數(shù)針標(biāo)樣溶液，待相鄰2針?lè)辆０泛碗烤?biāo)樣溶液的峰面積相對(duì)變化<1.5%時(shí)，按照標(biāo)樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)行測(cè)定。

2.4.4 計(jì)算 將測(cè)定的2針試樣溶液及試樣前后2針標(biāo)樣溶液中氟吡菌酰胺和肟菌酯的峰面積分別平均。氟吡菌酰胺和肟菌酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω(%)按式(1)計(jì)算。

(1)

式中：A1為標(biāo)樣溶液中氟吡菌酰胺或肟菌酯峰面積的平均值；A2為試樣溶液中氟吡菌酰胺或肟菌酯峰面積的平均值；m1為氟吡菌酰胺或肟菌酯標(biāo)樣的質(zhì)量，g；m2為試樣的質(zhì)量，g；P為標(biāo)樣中氟吡菌酰胺或肟菌酯的純度，%；5為標(biāo)樣溶液的稀釋倍數(shù)。

3 結(jié)果與討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 使用島津LC-20A的PDA檢測(cè)器將波長(zhǎng)掃描范圍調(diào)整為190～400nm，對(duì)氟吡菌酰胺和肟菌酯標(biāo)樣進(jìn)行3D譜圖掃描，得到氟吡菌酰胺和肟菌酯的紫外吸收光譜圖。氟吡菌酰胺在220nm處有較大紫外吸收，肟菌酯在254nm處有較大紫外吸收，(圖3)為220nm和254nm譜圖比較。綜合考慮氟吡菌酰胺和肟菌酯峰型、響應(yīng)值等因素，選擇220nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖3 不同波長(zhǎng)譜圖比較

3.2 流動(dòng)相的選擇 選用WondaSil C18-WR反相色譜柱作為分離柱，分別比較甲醇-水和乙腈-水作為流動(dòng)相對(duì)試樣進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用乙腈-水作為流動(dòng)相，試樣的峰型對(duì)稱(chēng)性更好、基線更平穩(wěn)，更能準(zhǔn)確定量分析。

3.3 線性相關(guān)性試驗(yàn) 將氟吡菌酰胺和肟菌酯配制成5個(gè)系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述2.3的色譜操作條件分析，測(cè)定其峰面積，每個(gè)質(zhì)量濃度測(cè)定3次，取平均值。以氟吡菌酰胺和肟菌酯的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到氟吡菌酰胺的線性方程為y=215 63x-2 814.4，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 2(圖4)；肟菌酯的線性方程為y=506 73x-7 335.8，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 2(圖5)。

圖4 氟吡菌酰胺線性關(guān)系圖

圖5 肟菌酯線性關(guān)系圖

3.4 方法精密度試驗(yàn) 從43%氟吡菌酰胺·肟菌酯懸浮劑中稱(chēng)取5份試樣，在2.3色譜操作條件下進(jìn)行分析并取平均值、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)和變異系數(shù)(CV)。結(jié)果表明：氟吡菌酰胺的RSD為0.063，CV為0.29%；肟菌酯的RSD為0.091，CV為0.42%(表1)。

表1 分析方法精密度試驗(yàn)結(jié)果

3.5 方法準(zhǔn)確度試驗(yàn) 稱(chēng)取5份含量的43%氟吡菌酰胺·肟菌酯懸浮劑，置于50mL容量瓶中，分別加入一定量氟吡菌酰胺和肟菌酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述色譜操作條件下進(jìn)行測(cè)定，氟吡菌酰胺的平均回收率為100.28%，肟菌酯的平均回收率為100.24%(表2)。

表2 分析方法準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

3.6 特異性鑒定 按照2.4.1和2.4.2中方法分別配制標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液，按標(biāo)準(zhǔn)中方法對(duì)氟吡菌酰胺和肟菌酯進(jìn)行全波段掃描、峰純度分析，特異性典型譜圖(圖6)。從譜圖可知，氟吡菌酰胺和肟菌酯在該分析方法下對(duì)紫外光有較強(qiáng)的吸收信號(hào)。從色譜圖中可以清晰看出，有效成分氟吡菌酰胺和肟菌酯出峰處無(wú)其他物質(zhì)干擾，符合定量分析要求。

圖6 特異性鑒定(A為氟吡菌酰胺；B為肟菌酯)

3.7 非分析物干擾實(shí)驗(yàn) 助劑輔料中干擾物質(zhì)存在會(huì)導(dǎo)致分析方法出現(xiàn)系統(tǒng)偏差，因此，在評(píng)價(jià)準(zhǔn)確度時(shí)，需要開(kāi)展非分析物干擾實(shí)驗(yàn)。配制相應(yīng)空白溶劑溶液、原藥溶液、標(biāo)樣溶液及制劑試樣，不含助劑的氟吡菌酰胺和肟菌酯的原藥按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法進(jìn)行液相色譜分析(圖7～10)，不存在與有效成分的保留時(shí)間重合的其他非分析物。因此，按照2.3分析方法分析有效成分，無(wú)明顯雜質(zhì)干擾。

圖7 空白溶劑色譜圖

圖8 不含助劑的原藥色譜圖

圖9 標(biāo)樣色譜圖

圖10 試樣色譜圖

4 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了測(cè)定43%氟吡菌酰胺·肟菌酯懸浮劑中2種有效成分含量的分析方法，操作簡(jiǎn)便、分離度高、線性好，具有較高的精密度和準(zhǔn)確度，適用于該制劑的質(zhì)量檢測(cè)。