于飛 楊育華 趙陽 黃天壬

摘要：目的：探究HBV X區(qū)A1762T/G1764A突變對人肝癌HepG2細(xì)胞磷脂酰肌醇-3-激酶（the phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B（serine/threonine protein kinase B， AKT）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路的影響。方法：體外培養(yǎng)人肝癌 HepG2細(xì)胞;將HepG2細(xì)胞隨機(jī)分為慢病毒空白載體（陰性對照）組、HBX-wt（野生型）組，HBX-A1762T/G1764A（實(shí)驗）組。實(shí)時熒光定量 PCR（RT-qPCR）法檢測各組細(xì)胞PI3K、AKT、mTOR的表達(dá)情況;蛋白印跡分析法檢測各組細(xì)胞磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶（p-PI3K）、磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B（p-AKT）、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）表達(dá)情況。CCK8和平板克隆形成實(shí)驗檢測細(xì)胞增殖情況，Transwell實(shí)驗檢測細(xì)胞遷移和侵襲情況。結(jié)果：與陰性對照組和HBX-wt組相比，HBX-A1762T/G1764A組PI3K AKT、mTOR基因表達(dá)水平升高（P<0.05）;p-AKT及p-mTOR水平升高（P<0.05）;HBX-A1762T/G1764A組HepG2細(xì)胞增殖速率、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)升高（P<0.05）。結(jié)論：HBVX區(qū)A1762T/G1764A雙突變可能調(diào)控了肝癌HepG2激活了PI3K/AKT/mTOR信號通路，同時增強(qiáng)了HepG2細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。HBVX區(qū)A1762T/G1764A突變可能是HBV所致HCC診斷和治療的潛在靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：肝癌，HBV，HBX區(qū)A1762T/G1764A突變，PI3K/AKT/mTOR

【中圖分類號】R735.7 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】1673-9026（2022）06--02

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC簡稱肝癌）是世界最常見的惡性腫瘤之一。乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus， HBV）慢性感染是HCC發(fā)生的主要危險因素。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，全球HCC病例中大約53%與HBV感染有關(guān)[1]，其中95%以上的感染者有不同程度的HBV突變[2]。HBx由HBV的X開放閱讀框編碼，在肝癌的發(fā)生過程中起著至關(guān)重要的作用[3]。HBx還可以促進(jìn)HBV的復(fù)制，調(diào)節(jié)生物過程，如宿主基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期進(jìn)程和氧化應(yīng)激[4-6]。結(jié)合國內(nèi)外研究進(jìn)展與本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，HBV X 區(qū)的A1762T/G1764A突變?yōu)橛胁町惖臒狳c(diǎn)突變，差異有統(tǒng)計學(xué)意義[7]。

PI3K/AKT/mTOR信號通路在生理和病理條件下對細(xì)胞生長和存活的許多方面都是十分重要的[9]。本研究在體外建立了人肝癌細(xì)胞HBX突變模型，以探討HBV X區(qū)A1762T/G1764A突變對人肝癌HepG2細(xì)胞株增殖、遷移和侵襲及PI3K/AKT/mTOR通路影響，為肝癌治療提供可能的新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1主要材料與試劑

人肝癌HepG2細(xì)胞株，課題組前期購買。特級澳洲胎牛血清、DMEM高糖型細(xì)胞培養(yǎng)基：美國Gbico公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及qRT-PCR試劑盒：日本TaKaRa 公司。慢病毒表達(dá)載體HBX-A1762T/G1764A突變組、HBx野生型組、陰性對照組。HBX、PI3K、AKT、mTOR基因引物：上海生工生物工序股份有限公司。乙型肝炎病毒X多克隆抗體：美國Abcam公司。beta-ActinRabbit mAb、PI3Kinase plloalpha Rabbit mAb、Phospho-PI3 Kinase Rabbit mAb、AKT Rabbit mAb、p-AKTRabbitmAb、mTORRabbitmAb、p-mTORRabbitmAb：美國CST公司。

1.2 細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染

HepG2細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖型細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板中。待細(xì)胞密度約為30%-50%時，按慢病毒使用說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗分組：（1）轉(zhuǎn)染慢病毒空白載體的陰性對照組（NC），轉(zhuǎn)染含HBX野生基因型序列的野生型組（WT），轉(zhuǎn)染含HBX野生基因序列發(fā)生A1762T/G1764A位點(diǎn)聯(lián)合突變的實(shí)驗組（EG）。

1.3? RT-qPCR實(shí)驗檢測HBX、PI3K、AKT、mTOR的表達(dá)

按照Trizol試劑盒說明書提取各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，然后按照qRT-PCR試劑盒說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：95 °C變性10min，60°C退火 30s、72 °C延伸 40min，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算HBX、PI3K、AKT、mTOR表達(dá)水平。引物序列見表1。

1.4Western blot檢測HBx、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)

收集各組細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白。取30μg蛋白樣品行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、快速封閉液封閉后，加入一抗HBx、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、β-actin （1∶1 000）， 4℃搖床孵化過夜;次日洗膜后加入1∶2000稀釋的山羊抗兔IgG作為二抗，室溫孵化1 h，TBST洗滌后，加入ECL顯色發(fā)光，凝膠成像儀成像。以為β-actin內(nèi)參， Image J軟件測定蛋白灰度值，計算各組各蛋白相對表達(dá)量。

1.5CCK-8實(shí)驗檢測細(xì)胞的增殖能力

將各組細(xì)胞接種至96孔板中常規(guī)培養(yǎng)，每組設(shè)置5個復(fù)孔。分別于培養(yǎng)24h、48h、72h時，向每孔加入CCK-8試劑，于37℃培養(yǎng)箱中孵育2h后，使用多功能酶標(biāo)儀檢測450nm波長處的光密度（OD）值。

1.6平板克隆形成實(shí)驗檢測細(xì)胞的增殖能力

將各組細(xì)胞接種至6孔板（約1000/孔）中，每組設(shè)置3個復(fù)孔。加入2m L完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔4～5d更換1次培養(yǎng)基。培養(yǎng)11～15d后，當(dāng)孔中出現(xiàn)肉眼可見細(xì)胞克隆球時，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗后，用4%多聚甲醛固定20min，0.1%結(jié)晶紫染色10min，洗去染色液，室溫干燥。拍照并計數(shù)各孔中的克隆球（>50細(xì)胞）數(shù)目。

1.7Transwell小室實(shí)驗檢測細(xì)胞的遷移和侵襲能力

使用Transwell小室進(jìn)行細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗。對于侵襲實(shí)驗，預(yù)先在Transwell小室上室鋪被基質(zhì)膠。將各組細(xì)胞接種至Transwell小室上室（約8×105/孔），培養(yǎng)基體積為300μL，不含血清;下室加入700μL含有20%胎牛血清的培養(yǎng)基。37℃孵育48h后取出小室，用4%多聚甲醛固定20min，用0.1%結(jié)晶紫染色10min，用棉簽拭去小室內(nèi)表面細(xì)胞。在顯微鏡下觀察并計算5個隨機(jī)視野中的細(xì)胞數(shù)。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法

以統(tǒng)計學(xué)軟件GraphPad Prism 8.0分析實(shí)驗數(shù)據(jù)并進(jìn)行繪圖，計量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（） 描述，多組間比較使用單因素方差分析，進(jìn)一步兩組間比較行LSD-t檢驗，當(dāng)P<0.05時，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1HepG2細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染驗證

將提取的總蛋白進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果如圖1所示：陰性對照轉(zhuǎn)染組未見任何條帶，而HBX-wt、HBX-A1762T/G1764A組在相對分子質(zhì)量約為17KD處存在顯著條帶，見圖1。以上結(jié)果說明成功構(gòu)建了HepG2細(xì)胞模型。

2.2 HBX突變對HepG2細(xì)胞PI3K/AKT/mTOR通路基因表達(dá)的影響

與陰性對照組和HBX-wt組相比，HBX-A1762T/G1764A組細(xì)胞PI3K、AKT、mTOR的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05）;與陰性對照組相比，HBX-wt組PI3K、AKT、mTOR的表達(dá)水平也均升高（P<0.05），見表1。

Note：Compared with negative control group， aP<0.05. Compared with HBX-wt， bP<0.05. Three independent repeated experiments.

2.3 HBXA1762T/G1764A突變對HepG2細(xì)胞p-PI3K、p-AKT 及 p-mTOR表達(dá)情況表達(dá)的影響

與陰性對照組和HBX-wt組相比，HBX-A1762T/G1764A組細(xì)胞p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）;與陰性對照組相比，HBX-wt組p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR的表達(dá)水平升高（P<0.05）;與陰性對照組相比，HBX-A1762T/G1764A組細(xì)胞p-PI3K/ PI3K表達(dá)水平升高（P<0.01），見圖1。

2.4HBX A1762T/G1764A突變對HepG2細(xì)胞增值、遷移和侵襲的影響

CCK-8實(shí)驗結(jié)果顯示，HBX-A1762T/G1764A組細(xì)胞增殖速率增高（F24 h=106.3，P<0.01;F48 h=364.7，P<0.01;F72 h=183.4，P<0.01），平板克隆形成數(shù)目增多（F=58.96，P<0.01），提示HBX A1762T/G1764A突變可促進(jìn)HepG2細(xì)胞增殖，見圖2、圖3。Transwell小室實(shí)驗顯示，HBX-A1762T/G1764A組細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)增多（F=59.28， P<0.01;F=44.35， P<0.01），提示HBX A1762T/G1764A突變可促進(jìn)HepG2細(xì)胞遷移和侵襲，見圖4。

3? 討論

在所有誘導(dǎo) HCC 的因素中， HBV慢性感染最為常見和重要。長期 HBV 感染的人患 HCC 的風(fēng)險可能會增加5至15倍[10]。因此，探究 HBV 在 HCC 發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上尋找有效的措施防治HCC尤為重要。由于HBV復(fù)制過程的特點(diǎn)導(dǎo)致HBV DNA基因變異率較一般DNA病毒高10倍左右[11]。

PI3K/AKT通路是細(xì)胞應(yīng)激期間的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。由于腫瘤存在于內(nèi)在的壓力環(huán)境中，例如營養(yǎng)和氧氣供應(yīng)不足等，在此類環(huán)境下這一途徑在癌癥的發(fā)生發(fā)展中有著關(guān)鍵作用。mTOR是一種在哺乳動物細(xì)胞中普遍表達(dá)的絲氨酸/蘇氨酸激酶。它拾取并整合各種細(xì)胞刺激啟動的信號，以調(diào)節(jié)下游信號和蛋白質(zhì)合成。它的激活導(dǎo)致細(xì)胞生長和存活調(diào)控的嚴(yán)重紊亂，最終導(dǎo)致競爭生長優(yōu)勢、轉(zhuǎn)移能力、血管生成和治療耐藥[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組、HBX-wt組相比，HBX-A1762T/G1764A組HepG2細(xì)胞PI3K、AKT、mTOR基因表達(dá)量均升高，p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR的表達(dá)水平均顯著升高。與此同時HBX-A1762T/G1764A組HepG2細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲也均增強(qiáng)。提示HBX的A1762T/G1764A雙突變可能在HBV所致的HCC中起到了一定的促進(jìn)作用。

綜上所述HBV X區(qū)A1762T/G1764A突變可能通過磷酸化PI3K/AKT信號通路中的AKT，上調(diào)mTOR的表達(dá)，并增強(qiáng)了HepG2細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，從而可能促進(jìn)HCC的發(fā)生發(fā)展。

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基金項目：廣西自然科學(xué)基金資助（編號：2019GXNSFDA245001）