田釵，張彩玉，楊婷，王婷，黃時海，石德順，李湘萍

廣西大學(xué) 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，南寧 530004

組蛋白修飾是最重要的表觀遺傳修飾標(biāo)記之一，在控制基因表達和細胞譜系規(guī)范中起到關(guān)鍵作用[1-3]．已有研究表明，組蛋白甲基化對早期胚胎發(fā)育和胚胎干細胞多能性的維持具有重要作用[4]．組蛋白甲基化發(fā)生在組蛋白的賴氨酸和精氨酸殘基上，作用位點在其側(cè)鏈．

在N原子上，常見位點有H3K4me3，H3K9me3和H3K27me3[5-6]．其中，組蛋白H3第9位賴氨酸三甲基化(Histone H3K9 trimethylation，H3K9me3)與維持異染色質(zhì)穩(wěn)定和沉默、X染色體失活、印記相關(guān)基因抑制及細胞特異性的鑒定有關(guān)[7]，也被認(rèn)為是胚胎發(fā)育的關(guān)鍵障礙[8]．

H3K9me3被證明是小鼠[9-10]、人類[11]和牛[12]重新編程中關(guān)鍵的一個表觀遺傳調(diào)節(jié)因子．在小鼠GV卵母細胞中，H3K9me3的表達與組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的活性密切相關(guān)．BHPF(Bateosi High Pass Filter)處理通過影響細胞骨架結(jié)構(gòu)、線粒體功能、氧化應(yīng)激、細胞凋亡提高了H3K9me3的表達，從而降低了小鼠卵母細胞的成熟效率和卵母細胞的質(zhì)量[13]．大劑量真菌毒素導(dǎo)致小鼠卵母細胞H3K9me3水平升高，這可能是導(dǎo)致卵母細胞發(fā)育能力下降的原因之一[14]．以上研究表明，適當(dāng)降低H3K9me3的表達有利于卵母細胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育．

H3K9me3在基因表達調(diào)控和卵母細胞生長中起重要作用[15]，目前其在體外成熟豬卵母細胞和孤雌胚胎中的表達模式還鮮有報道．毛殼素作為SUV39亞家族甲基轉(zhuǎn)移酶的抑制劑，能夠特異性抑制組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SUV39H1/2和G9A的活性，通過競爭性結(jié)合SUV39H1/2[16]，與關(guān)鍵殘基發(fā)生反應(yīng)，從而調(diào)控H3K9me3水平，以此增強表觀遺傳重編程效率[17]．因此，本實驗通過在豬卵母細胞體外成熟過程中添加毛殼素，調(diào)控卵母細胞H3K9me3及其相關(guān)基因的表達．研究結(jié)果有助于了解體外成熟卵母細胞和胚胎中H3K9me3表達的動態(tài)變化，并為改善豬卵母細胞成熟質(zhì)量，提高胚胎發(fā)育效率奠定基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

本實驗所用卵巢均來源于廣西南寧市屠宰場，實驗所用胚胎為孤雌激活胚胎．

1.2 豬卵巢的采集及體外成熟培養(yǎng)

將從屠宰場取得的卵巢置于37 ℃生理鹽水中，用生理鹽水清洗3遍，并用注射器采集卵巢表面直徑約3～10 mm的卵泡，挑選形態(tài)完好、胞質(zhì)均勻，周圍帶有3層以上致密卵丘細胞的卵丘-卵母胞復(fù)合體(cumulus-oocyte complexes，COCs)，用洗卵液清凈后將30～50個卵母細胞放入用礦物油覆蓋的一個胚胎培養(yǎng)液(PM)微滴中，每滴為150 μL培養(yǎng)液，[0～22)h將卵母細胞放入含有激素的培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，之后將卵母細胞移入另一個不含激素的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)[22～44] h．實驗組在對照組的基礎(chǔ)上添加了不同濃度的毛殼素．

1.3 豬卵母細胞的孤雌激活

實驗前先打開熱臺、融合儀，并安裝激活盤．用提前平衡的電激活液清洗3遍融合槽，然后把新的電激活液放置于融合槽中．將卵母細胞在融合液中清洗3遍后放于激活槽中進行激活．將激活過的卵母細胞移入平衡好的胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)15 min，然后移入35 μL的胚胎培養(yǎng)液微滴中進行培養(yǎng)．24 h統(tǒng)計卵裂率，48 h統(tǒng)計4-細胞率，7 d統(tǒng)計囊胚率．

1.4 囊胚細胞總數(shù)的鑒定

將收集的豬孤雌囊胚放入4%的多聚甲醛固定液中固定24 h，然后放入10 μg/mL細胞核染料(Hoechst)中，避光染色10 min，然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3遍，每次5 min，染好的囊胚移入載玻片的抗淬滅劑中，用凡士林封片，在熒光顯微鏡下觀察并做好統(tǒng)計．

1.5 細胞免疫熒光

收集不同時期的卵母細胞和孤雌囊胚放入4%多聚甲醛中4 ℃固定24 h．固定之后，室溫條件下放入阻斷液中阻斷3次，每次5 min，然后放入1% Triton X-100中，透化30 min，再用阻斷液阻斷2次，每次5 min，然后用1%牛血清蛋白溶液(BSA)進行非特異性位點封閉1～2 h，封閉之后用T-BSA-PBS清洗3次，每次5 min，把處理好的樣品放入H3K9me3的一抗4 ℃過夜．第2 d把樣品放入培養(yǎng)箱孵育30 min，然后用T-BSA-PBS清洗3遍，每次5 min，清洗好之后把樣品放入裝有二抗的EP管中，避光室溫孵育1.5 h，然后用清洗液清洗3遍，每次5 min，最后用10 μg/mL Hoechst 33342復(fù)染10 min，用清洗液清洗兩遍放入滴有抗淬滅劑的玻片上，用凡士林封片鏡檢，記錄實驗數(shù)據(jù)．

1.6 反轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR

收集不同時期的豬卵母細胞和孤雌囊胚，用PBS+PVA清洗3遍，洗去樣品所帶的培養(yǎng)液和血清等物質(zhì)后將樣品放入裝有細胞裂解液的管中．微量反轉(zhuǎn)錄所有步驟均在冰上操作：裂解，將樣品放入聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀中4 ℃裂解15 min；消化，裂解后每管加入1 μL DNase I和1.3 μL 10×DNA buffer，瞬時離心后放入PCR儀中37 ℃消化40 min；終止，消化完每管加入1 μL EDTA，2 μM Random Primer，1 μL mixture deoxynucleotides (dNTPs)，瞬時離心后放入PCR儀中65 ℃10 min；反轉(zhuǎn)，終止后依次加入2 μL DTT，4 μL 5×First-Strand Buffer，0.5 μL RNase Inhibitor(RRI)，0.25 μL SuperScriptTMⅡ Reverse Transcriptase (SSⅡ)，瞬時離心，進行反轉(zhuǎn)錄，其條件是25 ℃ 10 min，42 ℃ 90 min，95 ℃ 10 min，4 ℃停止．將反轉(zhuǎn)錄得到的樣品存放于-20 ℃?zhèn)溆茫?/p>

將微量反轉(zhuǎn)錄得到的產(chǎn)物作為模板，進行qRT-PCR檢測，觀察目的基因的表達情況．反應(yīng)體系按說明書進行．

1.7 結(jié)果統(tǒng)計與分析

本實驗結(jié)果均使用SPSS 22.0軟件進行分析，早期胚胎發(fā)育率先通過反正弦變化后再進行分析．每個實驗重復(fù)至少3次，每次重復(fù)實驗中至少隨機挑選10個以上卵母細胞進行實驗．p<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義．

2 結(jié)果與分析

2.1 [0～22)h毛殼素處理對豬卵母細胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育的影響

[0～22)h采用不同濃度毛殼素處理，發(fā)現(xiàn)2 nmol/L處理組的卵母細胞第一極體排出率顯著高于未處理組、5 nmol/L組和10 nmol/L組；4-細胞率顯著高于未處理組、5 nmol/L組和10 nmol/L組；2 nmol/L處理組的囊胚率顯著高于未處理組和10 nmol/L組(p<0.05)；2 nmol/L處理組的囊胚細胞總數(shù)顯著高于5 nmol/L組和10 nmol/L組(p<0.05)，與未處理組之間差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)(表1)．

表1 毛殼素處理對豬卵母細胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育的影響

2.2 [22～44] h毛殼素處理對豬卵母細胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育的影響

[22～44] h采用不同濃度毛殼素處理時發(fā)現(xiàn)，與未處理組相比，5 nmol/L毛殼素處理組的第一極體排出率顯著提高(87.37% VS 71.91%，p<0.05)，各處理組之間的卵裂率、4-細胞率、囊胚率和囊胚細胞總數(shù)差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)(表2)．

表2 [22～44] h毛殼素處理對豬卵母細胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育的影響

基于以上實驗結(jié)果，后續(xù)實驗均采用體外成熟[0～22)h 添加2 nmol/L毛殼素處理方法．

2.3 毛殼素處理對豬卵母細胞和早期胚胎中H3K9me3表達的影響

與未處理組相比，H3K9me3在GV期2 nmol/L處理組有明顯的表達，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)．隨著卵母細胞的成熟進程，H3K9me3表達逐漸減弱，在MI和MⅡ期卵母細胞中未檢測到H3K9me3表達．與未處理組相比，2 nmol/L處理組的囊胚中H3K9me3表達顯著降低(p<0.05)(圖1、圖2)．

圖1 毛殼素處理對豬卵母細胞和囊胚中H3K9me3表達的影響

2.4 毛殼素處理對豬卵母細胞和早期胚胎中重要基因表達的影響

在相同時期各組之間*表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)．圖2 GV期豬卵母細胞和囊胚中H3K9me3的熒光強度分析

與未處理組相比，2 nmol/L處理組的MI期卵母細胞中的SUV39H1和SUV39H2表達顯著降低(p<0.05)，兩組之間G9A的表達差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)．與未處理組相比，2 nmol/L處理組的MⅡ期卵母細胞中SUV39H1，SUV39H2，G9A表達均顯著降低(p<0.05)；囊胚中Nanog，Oct4，CDX2的表達顯著提高(p<0.05)(圖3)．

在相同時期各組之間*表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)．圖3 不同處理豬卵母細胞和早期胚胎中相關(guān)基因的表達

3 討論與結(jié)論

近年來的研究表明，胚胎中高表達的H3K9me3是阻礙胚胎發(fā)育的關(guān)鍵因素，特別是在合子基因激活(ZGA)過程中[18]．在ZGA期間，卵母細胞中H3K9me3的異常變化會阻礙轉(zhuǎn)錄激活[19]，且在核移植胚胎重編程抗性區(qū)域(RRR)中檢測到高水平的H3K9me3，而體外受精胚胎的RRR基因表達正常．這些RRRs區(qū)域的特征是富含SUV39H1/2并且缺乏DNasr1，這兩點都是異染色質(zhì)的一般特征[20]．由于H3K9的甲基化與基因的表達抑制密切相關(guān)，去除這些表觀遺傳標(biāo)記有利于基因的重新激活和胚胎發(fā)育．以往的研究也表明，降低人和小鼠胚胎中H3K9me3水平能提高胚胎的發(fā)育能力[10]．因此，適當(dāng)降低H3K9me3的表達有利于卵母細胞體外成熟和早期胚胎的發(fā)育．

在本研究中，免疫熒光數(shù)據(jù)顯示GV期卵母細胞中H3K9me3的表達水平較高，但MI期和MⅡ期卵母細胞中未檢測到該蛋白的表達，發(fā)育到囊胚階段又表現(xiàn)出較高的表達水平，這意味著MII期卵母細胞中H3K9me3的缺失可能正在為通過其他修飾的細胞表觀遺傳重新編程做準(zhǔn)備[21]．H3K9me3的動態(tài)表達說明了其在卵母細胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育過程中具有重要的調(diào)控作用．

本實驗通過在豬卵母細胞體外成熟過程中添加毛殼素，觀察其是否對豬卵母細胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育產(chǎn)生影響．結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未處理組相比，2 nmol/L處理組顯著提高了卵母細胞的第一極體排出率、4-細胞率和囊胚率．在本研究中2 nmol/L處理組囊胚率增加12.92%，表明抑制劑只部分糾正了異常的表觀遺傳修飾．通過qRT-PCR和免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，毛殼素處理之后顯著降低了卵母細胞中SUV39H1/2和G9A的表達，以及囊胚中H3K9me3的表達．這與Zhang等[22]在羊核移植胚胎中的研究一致．2 nmol/L毛殼素處理后顯著提高囊胚中多能性基因Nanog，Oct4和CDX2的表達，該結(jié)果與李海艷[23]對豬孤雌胚胎的研究結(jié)果一致．本實驗結(jié)果證明適量毛殼素處理有利于豬卵母細胞體外成熟和早期胚胎的發(fā)育．

豬卵母細胞中H3K9me3的去除對于正常的ZGA和表觀遺傳重編程至關(guān)重要[18]，用毛殼素作為組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SUV39H1/2和G9A特異性抑制劑，能有效降低H3K9me3的表達水平，最終提高豬體外成熟和胚胎發(fā)育效率．