張高煉，郭建輝，曾 敬，李 敏，陳 銳，張曉寧，劉姍姍，梁韡斌

癲癇是由于大腦神經(jīng)元異常放電進(jìn)而引起大腦功能障礙的一種慢性疾病，流行病學(xué)研究資料顯示，癲癇在發(fā)達(dá)國(guó)家的中位發(fā)病率約為45/10萬(wàn)，而在中低收入國(guó)家約為50.4/10萬(wàn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，發(fā)達(dá)國(guó)家癲癇病人的無(wú)故單次或多次癲癇發(fā)作發(fā)生率達(dá)到了50/10萬(wàn)～70/10萬(wàn)，在貧窮國(guó)家這一比例可能會(huì)更高。目前，我國(guó)的癲癇發(fā)病率與發(fā)達(dá)國(guó)家癲癇發(fā)病率基本保持一致。 研究發(fā)現(xiàn)，癲癇的發(fā)病機(jī)制與頭部腫瘤、顱腦外傷、遺傳因素等相關(guān)，且隨著疾病進(jìn)展，癲癇不僅危害病人生命安全，影響病人精神狀態(tài)，還會(huì)導(dǎo)致病人發(fā)生認(rèn)知功能障礙[1]，在兒童病人的臨床表現(xiàn)中，癲癇對(duì)認(rèn)知功能的影響則表現(xiàn)的更為明顯。研究證實(shí)，癲癇導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙及疾病進(jìn)展與海馬組織神經(jīng)元損傷密切相關(guān)[2]。近年來(lái)不斷有學(xué)者報(bào)道，反轉(zhuǎn)錄富含半胱氨酸蛋白(RECK)/膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)/蛋白激酶B(AKT)通路與顱腦損傷、抑郁及癲癇等腦部神經(jīng)細(xì)胞受損疾病的預(yù)后轉(zhuǎn)歸及惡化進(jìn)展均密切相關(guān)[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，RECK/GFAP/AKT通路與海馬組織細(xì)胞功能及神經(jīng)元正常生理、生命活動(dòng)密切相關(guān)[4-5]。本研究初步研究草果知母湯對(duì)戊四唑誘導(dǎo)的癲癇大鼠海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用及RECK/GFAP/AKT信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用，為草果知母湯在癲癇疾病中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 90只雄性SD大鼠，無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)，8周齡，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 藥品與試劑 草果知母湯由中藥飲片(草果4.5 g，知母6 g，半夏9 g，厚樸6 g，黃芩4.5 g，烏梅4.5 g，花粉4.5 g，姜汁25 mL)煎制而成，生藥含量為1 g/mL，購(gòu)自北京同仁堂藥業(yè)；丙戊酸鈉(山東方明藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司)；戊四唑(上海超研生物科技有限公司)；尼氏染色液(上海恒斐生物科技有限公司)；脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)凋亡檢測(cè)試劑盒(廣州捷威斯生物科技有限公司)；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物設(shè)計(jì)及合成(上海信帆生物科技有限公司)；RECK抗體(亞科因生物技術(shù)有限公司)；GFAP(普健生物科技公司)；磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、AKT購(gòu)自碧云天生物科技有限公司。

1.3 主要儀器 DMi8-M熒光倒置顯微鏡(徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易有限公司)；Sigma 3-18KS離心機(jī)(德國(guó)SIGMA公司)；SpectraMax iD3酶標(biāo)儀(美谷分子儀器有限公司)；E-Gel Imager凝膠成像儀(賽默飛世爾科技公司)；S700/S700A石蠟切片機(jī)(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；KEEBIO-VE186雙垂直電泳槽(上海金鵬分析儀器有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 癲癇大鼠造模、分組及給藥方法 將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、癲癇模型組、草果知母湯低劑量組、草果知母湯中劑量組、草果知母湯高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組，每組15只。除正常對(duì)照組外，其余大鼠按照35 mg/kg腹腔注射戊四唑[6]，每日1次，連續(xù)28 d，按照Recine[7]標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大鼠進(jìn)行分級(jí)，若大鼠連續(xù)5次出現(xiàn)Ⅱ級(jí)及以上癲癇癥狀，則視為造模成功。造模完成后，草果知母湯低、中、高劑量組大鼠按照2.5 mL/kg、5.0 mL/kg、10.0 mL/kg的劑量給予草果知母湯灌胃[8]，陽(yáng)性對(duì)照組給予大鼠丙戊酸鈉65 mg/kg灌胃[9]，對(duì)照組及模型組按照10 mL/kg灌胃生理鹽水，每日1次，給藥4周[9]。

1.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)大鼠海馬組織Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA水平 取各組大鼠部分海馬組織，用RNA提取試劑盒提取大鼠海馬組織的總RNA，并將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以GAPDH為內(nèi)參，熒光定量PCR檢測(cè)海馬組織Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA的表達(dá)。各基因引物見(jiàn)表1，結(jié)果采用2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表1 各檢測(cè)基因引物序列

1.4.3 尼氏染色法檢測(cè)大鼠海馬神經(jīng)元尼氏小體 取各組大鼠海馬組織，經(jīng)石蠟包埋后進(jìn)行4 μm切片，石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟后使用梯度乙醇脫水后，使用1%焦油紫染料室溫孵育30 min，70%乙醇分色1 min，梯度乙醇脫水，DPX封片劑封片后在顯微鏡下觀察，尼氏體呈紫色，細(xì)胞核呈淡紫色。

1.4.4 TUNEL染色法檢測(cè)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡水平 取大鼠海馬組織，石蠟包埋切片，常規(guī)脫蠟處理，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)漂洗兩次，使用Proteinase K工作液室溫反應(yīng)30 min，PBS洗兩次，加入預(yù)先制備好的TUNEL反應(yīng)混合液，37 ℃的濕化室中孵育1 h，滴加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液，避光孵育15 min，使用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。計(jì)算細(xì)胞總數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)并記錄平均值，凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.4.5 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)大鼠海馬組織RECK、GFAP、p-AKT、AKT水平 取各組大鼠海馬組織，在玻璃勻漿器中加入RIPA蛋白裂解液進(jìn)行勻漿，以4 ℃，12 000 r/min離心10 min，取上清液，置于100 ℃沸水中水浴5 min變性，BCA法測(cè)定蛋白濃度后，取50 μg蛋白進(jìn)行電泳分離，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉液封閉后，RECK、GFAP、p-AKT、AKT及GAPDH抗體(1∶500)4 ℃孵育過(guò)夜。磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗膜后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(1∶1 000)室溫孵育1 h，PBST再次清洗3次，凝膠成像儀成像后，使用Image J 1.52v軟件進(jìn)行灰度值檢測(cè)及分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠海馬組織Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA水平比較 癲癇模型組大鼠海馬組織Bcl-2 mRNA較正常對(duì)照組明顯降低(P<0.05)，Bax及Caspase-3 mRNA較正常對(duì)照組大鼠明顯升高(P<0.05)；與癲癇模型組比較，草果知母湯低、中、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組大鼠海馬組織Bcl-2 mRNA明顯升高(P<0.05)，Bax及Caspase-3 mRNA明顯降低(P<0.05)，且隨著草果知母湯劑量的增加，癲癇大鼠海馬組織Bcl-2 mRNA逐漸升高(P<0.05)，海馬組織Bax及Caspase-3 mRNA逐漸降低。詳見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠海馬組織Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA水平比較(±s)

2.2 尼氏染色法觀察各組大鼠海馬神經(jīng)元尼氏小體 正常對(duì)照組大鼠尼氏小體數(shù)量正常，海馬錐體細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)完整；與正常對(duì)照組比較，癲癇模型組大鼠及陽(yáng)性對(duì)照組海馬錐體細(xì)胞數(shù)量減少，排列分散，結(jié)構(gòu)模糊，尼氏小體染色淺，尼氏小體大量丟失；與癲癇模型組比較，草果知母湯各劑量組尼氏小體染色豐富，錐體細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列較整齊。詳見(jiàn)圖1。

圖1 尼氏染色法檢測(cè)各組大鼠海馬神經(jīng)元尼氏小體(A為正常對(duì)照組；B為癲癇模型組；C為草果知母湯低劑量組；D為草果知母湯中劑量組；E為草果知母湯高劑量組；F為陽(yáng)性對(duì)照組)

2.3 各組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡指數(shù)比較 癲癇模型組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡指數(shù)較正常對(duì)照組明顯升高(P<0.05)；與癲癇模型組比較，草果知母湯低、中、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡指數(shù)明顯降低(P<0.05)，且海馬神經(jīng)元凋亡指數(shù)隨著草果知母湯劑量的增加而逐漸降低。詳見(jiàn)圖2。

與正常對(duì)照組相比，＊P<0.05；與癲癇模型組相比，#P<0.05；與草果知母湯低劑量組相比，△P<0.05；與草果知母湯中劑量組相比，☆P<0.05。圖2 各組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡指數(shù)比較(A為熒光顯微鏡下觀察；B為各組海馬神經(jīng)元凋亡指數(shù)比較的柱狀圖)

2.4 各組大鼠海馬組織RECK、GFAP、p-AKT、AKT水平比較 與正常對(duì)照組比較，癲癇模型組大鼠海馬組織RECK及p-AKT水平明顯降低(P<0.05)，而GFAP水平則明顯升高(P<0.05)；與癲癇模型組比較，草果知母湯低、中、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組大鼠海馬組織RECK及p-AKT水平明顯升高(P<0.05)，GFAP水平則明顯降低(P<0.05)，且隨著草果知母湯劑量的增加，大鼠海馬組織RECK及p-AKT水平逐漸升高，GFAP水平則逐漸降低。各組大鼠海馬組織AKT水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)圖3。

與正常對(duì)照組相比，＊P<0.05；與癲癇模型組相比，#P<0.05； 與草果知母湯低劑量組相比，△P<0.05；與草果知母湯中劑量組相比，☆P<0.05。圖3 各組大鼠海馬組織RECK、GFAP、p-AKT、AKT水平比較(A為大鼠海馬組織RECK、GFAP、p-AKT、AKT水平表達(dá)條帶圖；B為各組大鼠海馬組織RECK、 GFAP、p-AKT、AKT水平比較的柱狀圖)

3 討 論

癲癇是目前臨床上最常見(jiàn)的嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)疾病，不但對(duì)病人身心造成嚴(yán)重傷害，也給病人家庭及社會(huì)帶來(lái)負(fù)擔(dān)，截至目前全球癲癇病人約有6 000萬(wàn)人。由于目前臨床使用的抗癲癇藥物治療效果有限，接受藥物治療后緩解病人的復(fù)發(fā)率也缺少流行病學(xué)研究，需要進(jìn)一步研究癲癇病人的發(fā)病機(jī)制，尤其是對(duì)突發(fā)性癲癇病人和已建立耐藥性的癲癇病人進(jìn)行深入研究及跟蹤隨訪，并加速抗癲癇藥物的研發(fā)。戊四唑誘導(dǎo)的癲癇大鼠模型是近年來(lái)實(shí)驗(yàn)室常用的建立實(shí)驗(yàn)室癲癇動(dòng)物模型的一種方法，采用腹腔注射給予大鼠35 mg/kg戊四唑方法建立癲癇模型大鼠，安全性好且造模成功率高[10-11]。丙戊酸鈉作為一種臨床常用抗癲癇藥物，其應(yīng)用范圍廣且藥理機(jī)制較明確，所以本實(shí)驗(yàn)使用丙戊酸鈉作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。

中醫(yī)理論認(rèn)為癲癇作為一種“癇病”，是由于脾腎虧虛及痰氣郁結(jié)引起的氣血津液運(yùn)行不利，加之情志刺激，發(fā)為癇疾。中醫(yī)藥學(xué)者認(rèn)為，對(duì)于癇病的治療應(yīng)以具有清肝利膽、活血安神、滋陰養(yǎng)液等功效的中藥為主。草果知母湯出自《溫病條辨》，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為其具有燥濕清熱等功效。方中草果具有溫散濕濁之功效，厚樸、半夏、姜汁和胃化濁，知母、天花粉則能夠清瀉胃火養(yǎng)陰，黃芩及烏梅清肝瀉火、斂肝生津，并防耗散陰津，諸藥調(diào)和，起到燥濕清熱的作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，其具有較強(qiáng)的抗癲癇作用，對(duì)于各種大發(fā)作、小發(fā)作均有明顯效果[12]。在臨床應(yīng)用中，草果知母湯在癲癇的治療中也已表現(xiàn)出明顯效果。戴克銀等[13]研究表明，草果知母湯在臨床應(yīng)用中表現(xiàn)出明顯療效，其能夠明顯改善癲癇病人的認(rèn)知功能，減少發(fā)病次數(shù)，并改善精神狀態(tài)及生活質(zhì)量。張麗萍等[14-16]研究發(fā)現(xiàn)，草果知母湯對(duì)癲癇大鼠具有一定的神經(jīng)元保護(hù)作用，并能夠調(diào)節(jié)海馬組織凋亡基因及抗凋亡基因的表達(dá)。Bax、Bcl-2及Caspase-3基因都是與細(xì)胞凋亡過(guò)程相關(guān)的重要基因，其中，Bcl-2作為抗凋亡基因抑制細(xì)胞的凋亡，而B(niǎo)ax 及Caspase-3則為促凋亡基因，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立戊四唑誘導(dǎo)的癲癇大鼠模型，并給予癲癇大鼠不同劑量的草果知母湯，結(jié)果表明，草果知母湯低、中、高劑量組大鼠海馬組織Bcl-2 mRNA水平逐漸升高，而海馬組織Bax及Caspase-3 mRNA水平則逐漸降低，提示草果知母湯能夠呈劑量依賴性地促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)，抑制Bax 及Caspase-3的表達(dá)，調(diào)節(jié)海馬組織細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制海馬神經(jīng)元凋亡，發(fā)揮海馬神經(jīng)元保護(hù)作用。

海馬組織是大腦認(rèn)知、學(xué)習(xí)及記憶能力的功能組織。研究發(fā)現(xiàn)，在由癲癇導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的病理進(jìn)展中，海馬神經(jīng)元對(duì)其疾病進(jìn)展及預(yù)后起到至關(guān)重要的作用[17]。同時(shí)海馬組織相關(guān)蛋白通路的變化又能夠影響海馬神經(jīng)元的正常生理活動(dòng)，所以，通過(guò)調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元凋亡相關(guān)基因水平及多種細(xì)胞生命活動(dòng)所必需的蛋白通路進(jìn)而發(fā)揮對(duì)海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用，是目前治療癲癇引起的認(rèn)知障礙藥物研發(fā)的思路之一。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，給予癲癇模型大鼠不同劑量的草果知母湯后，大鼠海馬組織病理學(xué)明顯改善，同時(shí)癲癇大鼠海馬組織神經(jīng)元凋亡率明顯降低，提示草果知母湯能夠修復(fù)癲癇大鼠海馬組織尼氏小體損傷，降低海馬組織神經(jīng)元損傷凋亡，保護(hù)并修復(fù)戊四唑誘導(dǎo)的癲癇大鼠海馬神經(jīng)元損傷。

GFAP被證明是與癲癇大鼠神經(jīng)損傷密切相關(guān)的蛋白。癲癇病人的腦損傷病理進(jìn)展與星形膠質(zhì)細(xì)胞有關(guān)，星形膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)隨著腦損傷的病理變化進(jìn)而出現(xiàn)以肥碩與增生為主要特征的反應(yīng)性細(xì)胞，而GFAP則是該反應(yīng)性細(xì)胞的主要標(biāo)志蛋白。GFAP是癲癇腦損傷狀態(tài)的標(biāo)志物，同時(shí)又是癲癇引起腦損傷疾病進(jìn)展的標(biāo)志，并反映抗癲癇藥物的治療效果。盧萬(wàn)可等[18]研究表明，癲癇大鼠腦損傷是GFAP表達(dá)升高，而抑制GFAP的過(guò)表達(dá)則能夠起到降低大鼠腦損傷的作用。RECK基因由20個(gè)外顯子及21個(gè)內(nèi)含子組成，是互補(bǔ)DNA編碼的膜錨定糖蛋白，共有971個(gè)氨基酸組成，近年來(lái)研究表明，其在頭頸部腫瘤及乳腺癌等疾病的發(fā)病機(jī)制中起到重要作用，并能夠通過(guò)影響基質(zhì)金屬蛋白酶等機(jī)制參與血管生成、組織重塑、細(xì)胞增殖、凋亡等生命活動(dòng)[19-21]。Du等[3]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，癲癇大鼠海馬組織損傷與RECK蛋白表達(dá)異常有關(guān)，通過(guò)激活RECK蛋白的表達(dá)能夠降低大鼠海馬組織損傷；AKT通路參與了癲癇發(fā)病過(guò)程中神經(jīng)元異常放電及病理形成過(guò)程，AKT通路活化則能夠促進(jìn)神經(jīng)元的修復(fù)，抑制神經(jīng)元的凋亡及損傷。張思遠(yuǎn)等[22]研究表明，激活癲癇大鼠腦組織PI3K/AKT信號(hào)通路及相關(guān)蛋白能夠調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而起到抗癲癇及保護(hù)海馬神經(jīng)元的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，草果知母湯各劑量組大鼠海馬組織RECK及p-AKT蛋白水平升高，GFAP水平降低，而海馬組織AKT蛋白水平無(wú)明顯變化，提示草果知母湯能夠呈劑量依賴性地促進(jìn)癲癇大鼠海馬組織RECK及p-AKT的表達(dá)，抑制GFAP水平，推測(cè)草果知母湯能夠通過(guò)抑制海馬神經(jīng)元病理性變化，同時(shí)促進(jìn)AKT蛋白的磷酸化水平，并促進(jìn)細(xì)胞增殖，表明草果知母湯能夠通過(guò)調(diào)節(jié)RECK/GFAP/AKT通路，進(jìn)而發(fā)揮其神經(jīng)元保護(hù)作用。

綜上所述，草果知母湯能夠降低戊四唑誘導(dǎo)的癲癇大鼠海馬神經(jīng)元凋亡，調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)RECK/GFAP/AKT信號(hào)通路有關(guān)。由于時(shí)間及資金條件的限制，本實(shí)驗(yàn)未能考察草果知母湯對(duì)癲癇大鼠RECK/GFAP/AKT信號(hào)通路的靶向調(diào)節(jié)作用，在今后的實(shí)驗(yàn)中將對(duì)上述問(wèn)題做進(jìn)一步的闡述說(shuō)明。