何軒輝，陳恒文，譚雨晴，2

擴(kuò)張型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)主要特征是左心室或雙心室擴(kuò)張和收縮功能受損，且不同于異常負(fù)荷狀態(tài)(如高血壓和瓣膜性心臟病)或冠狀動(dòng)脈疾病[1]。擴(kuò)張型心肌病病因復(fù)雜，可大致分為遺傳型和非遺傳型，遺傳型的涉及編碼細(xì)胞骨架、肌節(jié)等基因突變；非遺傳型包括感染引起的心肌炎、不良接觸(如藥物、酒精、毒素)以及代謝、免疫、內(nèi)分泌紊亂等[2]。擴(kuò)張型心肌病常導(dǎo)致充血性心力衰竭，但也可能出現(xiàn)循環(huán)衰竭、心律失常、血栓栓塞甚至猝死[2-3]。擴(kuò)張型心肌病臨床治療主要以改善心功能、減輕癥狀為主，應(yīng)該針對(duì)根本原因?qū)嵤﹤€(gè)體化治療，恢復(fù)心功能，逆轉(zhuǎn)心肌重塑[4]。中西醫(yī)病證結(jié)合治療擴(kuò)張型心肌病，可以增強(qiáng)心肌收縮功能，提高射血分?jǐn)?shù)，逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)，且可提高病人生活質(zhì)量，改善預(yù)后[5]。中醫(yī)認(rèn)為，心陽不足、氣陰虧虛與痰、濕、寒、瘀等交互作用，從而出現(xiàn)胸悶胸痛、心煩氣短、咳嗽氣促等癥狀，與《靈樞》《素問》《備急千金藥方》等所記載的“心脹”“心痹”相似?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》言：“人之所有者，血與氣耳”，運(yùn)用中醫(yī)藥治療擴(kuò)張型心肌病也應(yīng)氣血同調(diào)。

丹參飲出自《時(shí)方歌括》，由丹參、檀香、砂仁組成，原方廣泛運(yùn)用于治療氣滯血瘀的心胃痛諸癥[6]。有研究結(jié)果顯示，治療擴(kuò)張型心肌病的中藥方中，丹參飲使用頻率較高[7]。臨床多用降香代檀香，丹參倍用，為君藥，《本草綱目》記載丹參有活血之功效，可通心包絡(luò)，亦補(bǔ)亦瀉，氣行則血行，氣滯則血瘀，故配伍降香和砂仁，降香入氣分，辛香走竄，溫通行滯，又入血分，可散瘀止痛，善通血脈。《雷公炮制藥性解》記載砂仁可主腹痛、心疼，咳嗽喘滿。辛、溫之性味善于行氣和胃化濕，補(bǔ)中伏土，正所謂“溫升其肝脾，清降其肺胃”。三味藥物配伍相宜，氣血同調(diào)，攻補(bǔ)兼施，可行氣滯、通血瘀、止定痛。

中醫(yī)藥治療擴(kuò)張型心肌病優(yōu)勢(shì)顯著、療效穩(wěn)定、安全耐受，在改善心臟收縮舒張功能及逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)等方面具有巨大的潛能，然而其發(fā)揮心血管保護(hù)作用的藥物成分、干預(yù)靶點(diǎn)、作用途徑不甚明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以基于多學(xué)科交叉整合關(guān)聯(lián)藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病的網(wǎng)絡(luò)機(jī)制，本研究采用這一方法從不同層面、多個(gè)靶點(diǎn)、多種途徑分析丹參飲干預(yù)擴(kuò)張型心肌病的潛在機(jī)制，為臨床研究及機(jī)制研究提供依據(jù)，為后續(xù)中醫(yī)藥治療擴(kuò)張型心肌病的經(jīng)典傳承、機(jī)制研究、新藥研發(fā)、靶向化治療提供思路及理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 丹參飲主要活性成分及靶點(diǎn)篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP)查找丹參飲中三味藥物的化學(xué)成分，臨床檀香多用降香代替，故檢索丹參、降香、砂仁，根據(jù)毒藥動(dòng)力學(xué)(ADME)值中的口服利用度(OB)≥30%及類藥性(DL)≥0.18篩選獲得藥物主要活性成分，結(jié)合中藥藥典進(jìn)行補(bǔ)充，并利用TCMSP獲取化合物的靶點(diǎn)信息，利用UniProt數(shù)據(jù)庫對(duì)化合物靶點(diǎn)信息進(jìn)行規(guī)范化處理。

1.2 擴(kuò)張型心肌病靶點(diǎn)篩選 查找GeneCards數(shù)據(jù)庫及OMIM數(shù)據(jù)庫中與疾病相關(guān)的靶點(diǎn)，設(shè)定檢索詞為“dilated cardiomyopathy”，GeneCards數(shù)據(jù)庫中relevance score參數(shù)值表述靶點(diǎn)與疾病相關(guān)度，數(shù)值與相關(guān)度成正比，根據(jù)相關(guān)度篩選，合并兩個(gè)數(shù)據(jù)庫的疾病靶點(diǎn)信息，保留唯一值建立擴(kuò)張型心肌病疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫。

1.3 丹參飲-擴(kuò)張型心肌病靶蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 合并丹參飲活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫以及擴(kuò)張型心肌病疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫，映射組建丹參飲-擴(kuò)張型心肌病靶蛋白，采用Cytoscape 3.7.2軟件，將化合物與潛在靶點(diǎn)的關(guān)系對(duì)應(yīng)關(guān)聯(lián)，形成“藥物有效成分-潛在作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。將靶蛋白輸入STRING數(shù)據(jù)庫，完成篩選，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，最小互作閾值設(shè)定為中等置信度(medium confidence)，游離點(diǎn)無須隱藏，分析網(wǎng)絡(luò)參數(shù)，確定蛋白互作關(guān)系中的關(guān)鍵點(diǎn)。

1.4 丹參飲-擴(kuò)張型心肌病功能和通路富集分析 將丹參飲與擴(kuò)張型心肌病的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 6.8平臺(tái)，以P值條件篩選，對(duì)其進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)功能和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，通過潛在作用靶點(diǎn)參與的生物學(xué)途徑，分析丹參飲發(fā)揮藥理作用的主要信號(hào)通路及生物過程，探討其治療擴(kuò)張型心肌病可能的作用機(jī)制。

2 結(jié) 果

2.1 丹參飲主要活性成分 初步篩查TCMSP中丹參飲中3味藥物的化學(xué)成分，結(jié)合中藥藥典中對(duì)這3味中藥主要成分的描述進(jìn)行補(bǔ)充，增加了丹酚酸B、丹參酮Ⅰ、乙酸龍腦酯3個(gè)成分，其中丹參相關(guān)的活性成分67個(gè)、降香相關(guān)的活性成分37個(gè)、砂仁相關(guān)的活性成分11個(gè)，刪除重復(fù)項(xiàng)后，共得112個(gè)化合物，詳見圖1。其中，poriferast-5-en-3beta-ol是丹參和砂仁共有的化合物， beta-sitosterol是降香和砂仁共有的化合物，OB最高的兩種化合物為przewalskinb、(2R)-3-(3， 4-dihydroxyphenyl)-2-[(Z)-3-(3，4-dihydroxyphenyl)acryloyl]oxy-propionic acid；DL最高的2種成分為stigmasta-5，22-dien-3-beta-yl acetate、sitosteryl acetate。丹參飲部分化合物信息見表1。

圖1 丹參飲主要成分韋恩圖

表1 丹參飲部分成分基本信息

(續(xù)表)

2.2 丹參飲藥物-主要活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 采用TCMSP獲取活性成分相關(guān)靶點(diǎn)，UniProt數(shù)據(jù)庫限定物種為“人”，校正靶點(diǎn)，得到丹參相關(guān)成分靶點(diǎn)130個(gè)，降香相關(guān)成分靶點(diǎn)71個(gè)、砂仁相關(guān)成分靶點(diǎn)50個(gè)，去除重復(fù)值后獲得丹參飲藥物靶點(diǎn)151個(gè)。采用Cytoscape 3.7.2繪制藥物-主要活性成分-靶點(diǎn)圖，有266個(gè)節(jié)點(diǎn)，1 490條邊，不同藥物可以有相同的成分，不同成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，一般對(duì)應(yīng)多個(gè)靶點(diǎn)，圖中活性成分取MOD ID后5位數(shù)字表示。詳見圖2。

圖2 丹參飲藥物-主要活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 丹參飲治療擴(kuò)張型心肌病潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 在GeneCards檢索擴(kuò)張型心肌病相關(guān)的基因，根據(jù)Relevance score值篩選大于10，獲取722個(gè)候選基因，OMIM數(shù)據(jù)庫檢索獲得222個(gè)候選基因，將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫獲取的疾病靶點(diǎn)取并集，保存唯一值，最終獲得891個(gè)疾病潛在靶點(diǎn)。與TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得的活性成分相關(guān)靶點(diǎn)取交集，最終共同靶基因有44個(gè)，詳見圖3。利用Cytoscape 3.7.2對(duì)丹參飲活性成分治療擴(kuò)張型心肌病作用靶點(diǎn)的關(guān)系繪制網(wǎng)絡(luò)圖，涉及73個(gè)活性成分和345條邊，節(jié)點(diǎn)度值(Degree)表示該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的重要性，圖形面積與度值成正比，結(jié)果顯示：鈉通道蛋白5型亞基α(SCN5A)、β2 -腎上腺素能受體(ADRB2)、雌激素受體(ESR1)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(NOS2)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)、毒蕈堿型乙酰膽堿受體M2(CHRM2)、腎上腺素受體α1D (ADRA1D)、磷酸二酯酶3A(PDE3A)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(NOS3)、絲裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)等靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中較重要。詳見圖4。

圖3 丹參飲有效成分作用靶點(diǎn)及擴(kuò)張型心肌病靶點(diǎn)交集韋恩圖

圖4 丹參飲有效成分治療擴(kuò)張型心肌病作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 丹參飲有效成分-擴(kuò)張型心肌病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 獲取丹參飲和擴(kuò)張型心肌病交集靶點(diǎn)44個(gè)，利用STRING 數(shù)據(jù)庫分析交集靶點(diǎn)，構(gòu)建丹參飲潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)，如圖5所示。PPI網(wǎng)絡(luò)圖中有42個(gè)靶點(diǎn)發(fā)生相互作用，2個(gè)孤立的靶點(diǎn)，有447條邊，平均度值為21.286，度值大于平均值的靶點(diǎn)蛋白有27個(gè)，排名較為靠前的為內(nèi)皮素1(EDN1)、白介素6(IL6)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 A(VEGFA)、低聚果糖(FOS)、腫瘤壞死因子(TNF)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)、白介素10(IL10)、NOS3，提示這些靶點(diǎn)蛋白可能在丹參飲治療擴(kuò)張型心肌病的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。詳見圖5。

圖5 丹參飲有效成分-擴(kuò)張型心肌病交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 丹參飲GO功能與KEGG通路富集分析 將丹參飲有效成分靶點(diǎn)與擴(kuò)張型心肌病疾病靶點(diǎn)的交集輸入DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO功能以及通路分析，以P<0.01進(jìn)行篩選，獲得生物學(xué)過程137項(xiàng)條目、細(xì)胞組分13項(xiàng)條目、分子功能22項(xiàng)條目，丹參飲主要涉及的細(xì)胞組分主要涉及質(zhì)膜、細(xì)胞外間隙、胞外區(qū)等(見圖6)；生物學(xué)過程包括RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄正向調(diào)控、藥物反應(yīng)、凋亡過程的負(fù)調(diào)控等(見圖7)；丹參飲調(diào)節(jié)擴(kuò)張型心肌病的分子功能主要富集在蛋白質(zhì)結(jié)合、細(xì)胞因子活性、蛋白質(zhì)異二聚化活性等(見圖8)。根據(jù)P<0.05篩選KEGG通路，得到77條通路信息，以基因數(shù)目降序，取前20位通路進(jìn)行分析，結(jié)果見圖9，顯示丹參飲干預(yù)擴(kuò)張型心肌病靶點(diǎn)基因主要富集于低氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、 磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-磷酸激酶B(Akt)信號(hào)通路、恰加斯病(美洲錐蟲病)、T細(xì)胞受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑、鈣信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK) 信號(hào)通路等。以P值取負(fù)對(duì)數(shù)，以顏色深淺表示顯著性，富集基因數(shù)目與氣泡面積成正比。

圖6 丹參飲主要成分潛在靶點(diǎn)的細(xì)胞組成富集分析(前10位)

圖7 丹參飲主要成分潛在靶點(diǎn)的關(guān)鍵生物過程富集分析

圖8 丹參飲主要成分潛在靶點(diǎn)的分子功能富集分析

圖9 丹參飲治療擴(kuò)張型心肌病的KEGG通路富集分析(前20位)

3 討 論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，借助多個(gè)數(shù)據(jù)庫、軟件分析平臺(tái)，建立了丹參飲-有效成分-作用靶點(diǎn)-擴(kuò)張型心肌病網(wǎng)絡(luò)模型，初步篩選后獲得丹參飲有效成分112個(gè)，藥物靶點(diǎn)151個(gè)，對(duì)丹參飲有效成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)簡(jiǎn)要分析發(fā)現(xiàn)，藥物成分多樣，不同藥物成分可能有交叉，成分相對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)也有不同。β-谷甾醇、木犀草素、丹參酮ⅡA、維斯體素、柚皮素等成分在網(wǎng)絡(luò)圖中聯(lián)系密切，占據(jù)重要位置，可能是丹參飲治療擴(kuò)張型心肌病的潛在有效成分。研究表明，β-谷甾醇是一種天然的抗氧化劑，對(duì)氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用[8]，可以促進(jìn)線粒體產(chǎn)生活性氧生成三磷酸腺苷(ATP)，保護(hù)心肌[9]，增強(qiáng)阿司匹林的抗炎作用，且具有調(diào)節(jié)血脂、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)功能[10-11]。木犀草素具有抗炎、抗癌、抗氧化[12]、抗病毒[13]等藥理特性，可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子[如STAT3、核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)[14]]，抑制白介素-8的產(chǎn)生，環(huán)氧合酶-2(COX-2)及NOS2的表達(dá)和一氧化氮(NO)的過度生成[15]，其利尿排鈉作用可能與毒蕈堿型乙酰膽堿受體有關(guān)[16]。丹參酮ⅡA可通過雌激素受體介導(dǎo)激活蛋白激酶B并抑制Leu27IGF-Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)受體信號(hào)激活的細(xì)胞凋亡作用，表明丹參酮ⅡA用于預(yù)防心肌細(xì)胞凋亡和心血管疾病的治療，而不會(huì)增加患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)[17]，且可以通過細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)-2信號(hào)通路抑制血小板活化，改善血液微循環(huán)，減輕脂質(zhì)沉積，從而預(yù)防心腦血管疾病[18-19]。維斯體素通過干預(yù)中性粒細(xì)胞發(fā)揮抗炎作用[20]。柚皮素也具有廣泛的藥理活性，如抗病毒、抗氧化、抗炎、抗癌，可干預(yù)骨再生、代謝綜合征、氧化應(yīng)激損傷、中樞神經(jīng)系統(tǒng)類疾病[21]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示，柚皮素可上調(diào)沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Sirt1)、過氧化物酶體增殖激活受體γ輔助激活因子α(PGC-1α)等蛋白表達(dá)，抑制PI3K/Akt/Sirt1信號(hào)通路，從而減輕心肌損傷，保護(hù)心臟[22]。

繪制丹參飲有效成分-擴(kuò)張型心肌病網(wǎng)絡(luò)圖，進(jìn)行度值分析，發(fā)現(xiàn)SCN5A、ADRB2、ESR1、NOS2、PPARG、CHRM2、ADRA1D、PDE3A、NOS3、MAPK14是網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，丹參飲可能通過作用于這些靶點(diǎn)發(fā)揮治療作用。SCN5A參與編碼心肌細(xì)胞電壓門控Na+通道基因，SCN5A基因突變，導(dǎo)致離子水平失衡，與擴(kuò)張型心肌病病因相關(guān)[23]。ADRB2與特發(fā)性擴(kuò)張型心肌病相關(guān)，具有調(diào)節(jié)心率和心肌收縮的作用[24]，ADRB2過度甲基化誘導(dǎo)的β2腎上腺素能受體，抑制PI3K/Akt通路，進(jìn)而導(dǎo)致心功能不全，ADRB2去甲基化可能是預(yù)防心臟損傷的新靶標(biāo)[25]。ESR1不僅作用于生殖系統(tǒng)，對(duì)于心血管系統(tǒng)也有調(diào)節(jié)作用，ERK1/2/成骨細(xì)胞磷酸化糖原合成激酶3β(GSK-3β)磷酸化抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔道(mPTP)開放的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，可能在小鼠心肌缺血-復(fù)灌損傷中起關(guān)鍵作用[26]。

富集分析結(jié)果顯示，丹參飲涉及的生物學(xué)過程復(fù)雜，發(fā)揮治療作用可能相關(guān)的通路較多，主要包括心血管系統(tǒng)(如HIF-1信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路)、炎癥過程和免疫抑制(如TNF信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑、MAPK 信號(hào)通路)等。HIF-1信號(hào)通路，可以促進(jìn)血管新生，上調(diào)與血管系統(tǒng)相關(guān)蛋白的基因表達(dá)，恢復(fù)組織血流，降低缺血性損傷[27]。PI3K-Akt信號(hào)通路在細(xì)胞存活與凋亡、心電生理和能量代謝等方面發(fā)揮著重要作用，是控制心肌細(xì)胞存活和功能重要的促增殖及抗凋亡信號(hào)通路之一[28]。鈣信號(hào)通路與動(dòng)脈鈣化、心肌收縮功能、代謝調(diào)節(jié)等關(guān)系密切[29-31]。TNF信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)。MAPK信號(hào)通路在介導(dǎo)炎癥、應(yīng)激反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，可以干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化，調(diào)控血小板功能[32]。

綜上所述，擴(kuò)張型心肌病病因復(fù)雜，疾病對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)多樣，客觀分析疾病靶點(diǎn)作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，達(dá)到針對(duì)性治療的效果。丹參飲成分多樣、靶點(diǎn)復(fù)雜、通路交錯(cuò)，關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)大有牽一發(fā)而動(dòng)全身的效果，把握關(guān)鍵點(diǎn)靈活調(diào)控網(wǎng)絡(luò)作用機(jī)制。初步的分析表明，丹參飲可能通過抗炎、抗氧化、保護(hù)血管、調(diào)控心肌細(xì)胞等發(fā)揮治療擴(kuò)張型心肌病的作用，從一定程度上闡述了丹參飲的作用機(jī)制，也為后續(xù)的治療提供了新的理論基礎(chǔ)和探索方向。限于研究方法的局限性，中藥成分、疾病及藥物靶點(diǎn)有待完善，單藥炮制、復(fù)方煎煮、人體吸收等一系列過程，組分間復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)尚未明確，丹參飲治療擴(kuò)張型心肌病確切作用靶點(diǎn)及作用通路需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。