吳佳蕓，李玲玲，孫 瑞，楊德爽，喬佳君，姚睿祺，朱春臨，黃 力

原發(fā)性高血壓(essential hypertension，EH)是臨床最常見的心血管病，是一種受遺傳、環(huán)境等多因素影響的以體循環(huán)動脈壓力升高為特點，目前病因與機制尚未完全明確的疾病。原發(fā)性高血壓在高血壓人群中約占95%，是諸多疾病的高危因素，更能誘發(fā)冠心病、心肌梗死、糖尿病、腦卒中等高度致殘和致死性疾病的發(fā)生。有統計顯示，全球近1/5的人口罹患高血壓，每年因高血壓并發(fā)癥死亡的人數多達940萬人[1]；而我國的高血壓現患人數高達2.9億人，且發(fā)病趨于年輕化[2]。我國高血壓調查發(fā)現，34歲以下男性發(fā)病率高達20.4%[3]，少年兒童高血壓發(fā)病率年均增加0.16%[4]。由此可見，高血壓的防治工作刻不容緩。當前指南提出的早期、規(guī)范、聯合應用西藥降壓治療雖有一定效果，但其副作用明顯，且逐步出現藥物耐受。中醫(yī)學將高血壓歸于“眩暈”“頭痛”范疇，認為肝陽上亢、痰濁內阻以及肝腎虧虛是其重要病機，強調從整體上抓病機，辨證論治，以恢復病人自身陰陽平衡，很少有不良反應，因而具有很大優(yōu)勢。而桑寄生、杜仲便是其中重于調補肝腎、用于治療肝腎虧虛型高血壓的代表要藥[5]。

桑寄生味苦、甘、平，入肝、腎經，具有補肝腎、強筋骨、除風濕、通經絡、安胎之效；杜仲味辛、平，亦入肝腎二經，頗具補益肝腎、強筋壯骨、安胎之功。二者均最早載于《神農本草經》，均可主治腰脊疼痛、可堅筋骨齒發(fā)，故后世常將二者作為藥對使用?，F代藥理研究證明，桑寄生具有降脂、降糖、降壓、抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗腫瘤、抗菌、利尿、增強記憶、保護神經等作用[6]，廣泛用于高血壓、心律失常、高脂血癥、缺血性中風、骨關節(jié)病、強直性脊柱炎、慢性乙型病毒性肝炎、腰椎間盤突出、蛋白尿、尿毒癥、先兆流產、習慣性流產以及凍傷等治療[7]；而杜仲則具有降壓、降糖、調節(jié)血脂、抗炎、預防骨質疏松、護肝、抗腫瘤、抗氧化、調節(jié)免疫、抗疲勞、鎮(zhèn)靜催眠、抑菌等作用[8]，臨床多用于治療高血壓、骨質疏松癥、膝骨性關節(jié)炎、腰肌勞損、腰椎間盤突出癥、腎虛腰痛、胎動不安、先兆流產、陽痿等[9]。研究發(fā)現，應用桑仲湯治療70例原發(fā)性高血壓病人，3個月后總有效率高達90%，病人舒張壓和收縮壓均有明顯改善，且失眠、頭痛、心煩等整體癥狀好轉[10]。仝小林教授常用懷牛膝、炒杜仲(6～10 g)、桑寄生(9～15 g)三味小方治療老年或久病體虛，脈管彈性變差，脈壓較大，屬于“病脈絡”至“病臟腑”階段的“腎虛態(tài)”高血壓，效果甚好[11]。然而，這其中的作用機制以及桑寄生-杜仲藥對的主要活性降壓成分目前尚還不清楚。網絡藥理學是挖掘中藥有效成分與疾病靶點、觀察藥物對疾病的作用網絡、預測藥物作用靶標繼而揭示藥物協同作用于人體機制的系統生物學方法，對于解釋中藥的復雜作用網絡具有重要意義。因而，本研究應用網絡藥理學和分子對接技術，從桑寄生-杜仲藥對降壓入手，探索其治療原發(fā)性高血壓的初步機制。

1 資料與方法

1.1 篩選桑寄生、杜仲中有效活性成分及靶點 在中藥系統藥理學數據庫及分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)中搜索桑寄生、杜仲2味中藥的有效活性成分和作用靶點(http: //lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)。根據口服用藥在體內代謝經過吸收、分布、代謝、排泄(ADME)等過程后最終發(fā)揮生物學作用的特點，將口服生物利用度(oral bioavailability，OB)設置為≥30%，類藥性(drug likeness，DL)設置為≥0.18進行篩選。此外，結合TCMID、YaTCM數據庫中有關桑寄生、杜仲的活性化合物信息，以及PubMed、中國知網、維普、萬方數據庫中的相關文獻，補充TCMSP數據庫中可能遺漏的靶點。利用UniProt KB(https://www.uniprot.org)數據庫規(guī)范蛋白質所得靶點的名稱和信息，得到便于識別的基因名稱。

1.2 獲取原發(fā)性高血壓疾病靶點庫 基于GeneCards(https://www.genecards.org)、OMIM(http://www.omim.org)與DisgeNET數據庫(https://www.disgenet.org)，以“hypertension”“high blood pressure”“essential hypertension”為關鍵詞查找原發(fā)性高血壓相關的疾病靶點，同時結合DrugBank數據庫中依據臨床用藥發(fā)現的有關靶點，參考Score值(值越高則疾病靶點間的聯系越緊密)進行靶標篩選并刪除重復的靶點，最終得到原發(fā)性高血壓的疾病靶點庫。

1.3 構建桑寄生-杜仲藥對的“藥物-成分-作用靶點”網絡 通過Cytoscape 3.8.0軟件構建桑寄生-杜仲藥對的“藥物-成分-作用靶點”網絡，其中有效成分、靶點、疾病以節(jié)點圖標表示，而相互間的作用關系以連線表示。節(jié)點的大小反映了活性成分和靶點與原發(fā)性高血壓的相關性和重要度，節(jié)點越大，相關性和重要性越高。

1.4 構建活性成分與原發(fā)性高血壓共同靶點的蛋白相互作用(PPI)網絡 取桑寄生、杜仲的有效成分和原發(fā)性高血壓相關的疾病靶點的交集，通過在線繪圖工具繪制韋恩圖(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)。隨后將疾病與藥物共同靶點輸入String Version 11 (https: //string-db.org/)，物種設置為“人”，得到PPI網絡，導出TSV文件。此外，通過MCODE插件對PPI網絡進一步分析，得到潛在的重要蛋白質功能模塊，試圖分析并闡釋其參與的生物學進程。

1.5 基因本體(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)分析核心靶點基因功能 通過DAVID數據庫獲取關鍵靶點的GO注釋和KEGG富集的相關信息，并利用在線繪圖工具(http://www.bioinformatics.com.cn/)進行基因功能分析的可視化展示。

1.6 構建桑寄生-杜仲藥對的“成分-靶點-信號通路”網絡 利用Cytoscape 3.8.0構建桑寄生-杜仲藥對的“成分-靶點-信號通路”網絡，并根據連接度、中介中心性等網絡拓撲學參數判斷主要發(fā)揮作用的靶點、核心成分以及參與調節(jié)的重要信號傳導途徑。

1.7 分子對接驗證 通過Swiss Dock (http://www.swissdock.ch/)平臺分析桑寄生-杜仲藥對成分與原發(fā)性高血壓網絡圖中度值排名前2位的靶點與桑寄生-杜仲藥對中的排名前5位的主要活性成分進行對接，事先確定靶點對應蛋白的PDB ID和獲取活性成分的mol2格式文件，參考估算熱結合能ΔG的值判斷結合活性和對接效果。

2 結 果

2.1 桑寄生與杜仲的有效活性成分及靶點 最初共獲得桑寄生化學成分78種、杜仲化學成分120種，經ADME篩選后共獲得桑寄生2種、杜仲21種活性成分，包括槲皮素、谷甾醇、山奈酚、麥甾醇、赤蘚堿、表兒茶素、丁香脂素等，其中槲皮素為二者共同成分，詳見表1。桑寄生成分作用靶點13個，杜仲成分作用靶點128個，合并后剔除重復值共得到靶點128個。

2.2 原發(fā)性高血壓相關靶點 在GeneCards數據庫中得到原發(fā)性高血壓相關靶點共計8 435個，參考以往文獻及經驗以Score大于或等于中位數為條件連續(xù)3次進行原發(fā)性高血壓疾病重要靶點的篩選，如通過GeneCards所得靶點Score值最小為0.09、最大為130.77，3次設立的中位數分別為1.47、3.19和6.06，最終以Score≥6.06的靶點作為潛在靶點。同時參照OMIM、DisgNET、DrugBank數據庫補充靶點，進行數據合并，去除重復靶點后得到1 398個原發(fā)性高血壓相關靶點。

2.3 桑寄生-杜仲藥對的“藥物-成分-作用靶點”網絡 將所得桑寄生-杜仲藥對中關鍵成分和靶點錄入Excel中進行整理，建立Network文件和屬性文件分別導入Cytoscape 3.8.0，得到153個節(jié)點、409條連線。按照node type分別篩選出桑寄生、杜仲以及基因，設置大小、形狀、排列方式等參數，同時進行網絡分析計算Degree值并以節(jié)點的大小等比例進行呈現(見圖1)。由圖1可知，山奈酚、β-谷甾醇、表奎尼丁、煙堿大黃素、槲皮素、赤蘚堿、β-胡蘿卜素、丁香脂素、3-羥基亞甲基丹參醌等是桑寄生與杜仲藥對中的核心化合物，而PTGS2、PIK3CG、AKT1、PTGS1、HSP90、KCNH2、NCOA2、CASP3、CASP9、SCN5A、CALM、PRKACA、RELA等是主要的作用靶點。

圖1 桑寄生-杜仲藥對的“藥物-成分-作用靶點”網絡圖

2.4 桑寄生與杜仲中有效成分與原發(fā)性高血壓疾病靶點的PPI網絡 找出桑寄生-杜仲與原發(fā)性高血壓病的交集，繪制韋恩圖，獲得二者共同靶點124個，將所得交集靶點輸入String Version 11，設置highest confidence(0.900)，構建藥物活性成分與靶點的PPI網絡，得到121個節(jié)點、339條連線，詳見圖2。進一步應用Cytoscape 3.8.0的MCODE插件對PPI網絡中連線密度較高的子網絡Module進行提取分析，找出主要的多蛋白復合體功能體和同通路中的重要功能模塊，詳見圖3。根據P值選擇3個最佳評分的生物學過程進行描述，分別是血液循環(huán)、G蛋白偶聯受體信號傳導途徑和細胞對有機環(huán)化合物的反應過程，詳見表2。

圖2 交集靶點PPI網絡圖

圖3 PPI網絡中的關鍵模塊

表2 交集靶點PPI Top3 Module功能描述

2.5 核心靶點的生物功能與信號通路富集分析 從David數據庫獲取關鍵靶點的GO和KEGG信息，通過在線平臺分別按照富集倍數和P值篩選分析對象進行結果的可視化呈現，結果顯示，桑寄生-杜仲藥對主要參與的生物學過程包括RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的雙向調控、正向調控轉錄、細胞增殖、ERK1和ERK2級聯反應、腺苷酸環(huán)化酶激活腎上腺素能受體信號通路、磷脂酶C激活G蛋白偶聯受體信號通路、蛋白激酶B信號轉導的正調控、細胞間信號、化學突觸傳遞、血管生成、凋亡過程的負調控等，主要集中于發(fā)揮與鋅離子結合、轉錄因子活性調節(jié)、序列特異性DNA結合、血紅素結合、蛋白質二聚體活性、染色質結合、藥物結合、鐵離子結合等的相關分子功能。而相關靶點所參與的通路主要富集于神經活性配體-受體相互作用、鈣信號通路、腫瘤壞死因子(TNF)信號通路、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)-環(huán)磷酸鳥苷酸依賴的蛋白激酶(PKG)信號通路、細胞凋亡、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)信號通路等。詳見圖4、圖5。

圖4 桑寄生-杜仲主要成分靶點的GO分析(BP為生物過程，CC為細胞組成，MF為分子功能)

圖5 桑寄生-杜仲主要成分靶點的KEGG通路富集分析

2.6 桑寄生與杜仲中有效成分-靶點-通路網絡圖 將所得桑寄生-杜仲主要活性成分和原發(fā)性高血壓共同靶點和富集通路聯系起來，利用Cytospace 3.8.0構建“桑寄生與杜仲中有效成分-靶點-通路網絡圖”，詳見圖6。通過內置的網絡分析功能獲取桑寄生-杜仲治療原發(fā)性高血壓的網絡拓撲學參數數據，進而比較找出最為關鍵的有效成分和作用點，詳見表3。

表3 桑寄生-杜仲主要有效成分及作用靶點的網絡節(jié)點特征參數

圖6 桑寄生-杜仲藥對有效成分-靶點-通路網絡圖

2.7 分子對接驗證 選取連接度排名前2位的靶點(分別是PTGS2與CALM)，以及排名前5位的活性成分，依次為山奈酚、煙堿大黃素、表奎尼丁、β-谷甾醇、槲皮素。通過Swiss Dock進行對接模擬和分析分子通路圖配體-受體結合動作，驗證關鍵靶點與成分之間的結合潛能和活性，其中Full Fitness和能量值越低結合效果越好，詳見圖7。結果顯示，各靶點與主要活性成分估算ΔG均<-29.30 kJ/mol，Full Fitness均<-5 023.20 kJ/mol。PTGS2與Top5成分的對接Full Fitness更是低于-8 372.00 kJ/mol，提示較好的結合活性。同時，結合能越低，分子對接的效果越好。詳見表4。

圖7 Top2靶點與Top5成分的對接模式圖

表4 Top2靶點與活性成分對接的詳細信息

3 討 論

原發(fā)性高血壓是發(fā)病率最高的心血管疾病，其導致的靶器官損害也已成為病人死亡主因。中醫(yī)藥調治血壓異常依據整體辨證個性化施治具有顯著特色和優(yōu)勢，尤其在避免類似西藥降壓存在的不良反應和改善病人整體癥狀方面。肝腎虧虛型高血壓是臨床中常見的類型，采用補益肝腎法治療原發(fā)性高血壓更是收效甚豐。劉麗娟等[12]研究顯示，復方桑寄生鉤藤顆粒高、中劑量不僅能降低高血脂大鼠血脂水平，更能明顯降低收縮壓和舒張壓，效果優(yōu)于利血平陽性藥物。對復方杜仲片的臨床觀察結果也顯示其能有效降低病人血壓，改善高血壓病人頭暈頭痛、腰膝酸軟、耳鳴、五心煩熱等癥狀。

而在補肝腎治療高血壓的用藥規(guī)律中發(fā)現，治療老年性腎氣虧虛型高血壓使用頻次位列前5位的中藥中，桑寄生位列第2位[13]。張莉等[14]觀察了6種不同寄主桑寄生藥材對原發(fā)性高血壓大鼠血壓的影響，發(fā)現除了夾竹桃寄主桑寄生外，各寄主來源桑寄生均具有降壓作用，并且高劑量桑樹和柳樹寄主桑寄生可減少自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)血漿血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)和內皮素-1(ET-1)水平(P<0.01)；而桑樹、柳樹、楓香樹寄主高劑量桑寄生還可明顯改善SHR血清一氧化氮(NO)和超氧化物歧化酶(SOD)活性(P<0.01)。而對360首治療高血壓的804味中藥進行頻次分析發(fā)現，杜仲使用頻次高達108次，排名第2位[15]。杜仲中的木質素類、阿魏酸、槲皮素等10多種成分均有降壓作用[16]；且桑寄生與杜仲的關聯規(guī)則置信度為0.584，說明二者常配合應用[15]。郭維琴教授常用桑寄生、杜仲配伍治療肝腎陰虛型高血壓，對伴有腰膝酸軟、筋骨無力者，療效明顯[17]，而含桑寄生、炒杜仲為主的“寄屑思仙花生醯”方治療高血壓的療效也較明顯[18]。

鑒于以上基礎，本研究從桑寄生-杜仲藥對入手探索其治療原發(fā)性高血壓的潛在機制，結果發(fā)現：桑寄生與杜仲的主要活性成分有槲皮素、山奈酚、煙堿大黃素、β-谷甾醇、丁香脂素等，其中槲皮素為二者共同成分。多項研究證實，槲皮素不僅可降低SHR、Dahl鹽敏感性大鼠等多種實驗高血壓模型血壓[19-20]，更可降低高血壓病人血壓[21]，其降壓機制涉及廣泛，可能與調節(jié)熱休克蛋白70/ERK/PPARγ信號通路、抑制氧化應激、螯合鋅離子抑制血管緊張素轉換酶活性、降低ET-1而促進內皮依賴的血管舒張功能、增加NO等有關。山奈酚是槲皮素的代謝產物，對阻力動脈的舒血管效力很強[22]。研究顯示其可抑制絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、蛋白激酶C(PKC)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)等炎癥通路信號傳導[23]，抑制還原型輔酶Ⅱ(NADPH) 或Fe2+誘導的脂質微粒系統中的脂質過氧化，清除超氧化物陰離子，并能增強內外源性NO引起的血管舒張，減少氧化損傷，從而加強內皮保護[24]，以及通過沉默調節(jié)因子1(SIRT1)介導的線粒體途徑，增加淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)的表達，抑制心肌凋亡[25]。而煙堿大黃素是一種單萜類吲哚生物堿，有報道稱其可能有引起血管舒張、降血壓、抗動脈粥樣硬化和凋亡誘導的作用[26]。β-谷甾醇是可通過結構修飾和進一步的合成制備出高血壓藥等幾乎所有甾體藥物的活性物質，可降低血清鈣離子水平，保護高血壓大鼠肝腎功能，具有抗炎、降壓、降脂等作用[27]。本研究分子對接的結果也表明，槲皮素、山奈酚、煙堿大黃素、β-谷甾醇與主要靶點PGST2和CALM結合活性高，說明桑寄生-杜仲藥對可能主要是通過這些成分發(fā)揮降壓效應的。

本研究結果表明，桑寄生-杜仲藥對發(fā)揮作用的靶點主要集中在PTGS2，而CALM亦是其重要靶點。PTGS2是編碼環(huán)氧化酶2(COX-2)的基因，參與轉化花生四烯酸(AA)為前列環(huán)素(PG)，正常狀態(tài)下水平極低，在炎癥狀態(tài)下表達明顯升高。而花生四烯酸代謝途徑及其衍生物在高血壓發(fā)病中有重要意義，同時對心血管活性有復雜的調節(jié)作用[28]。高血壓病人體內花生四烯酸明顯高于正常人，且隨病情加重而加重[29]。PGE2受體(EPs)的平衡在維持正常血壓中發(fā)揮重要作用，其一方面可通過降低EP1介導的Ca2+內流和EP3介導的cAMP而增加血管張力和血壓[30]；同時，又可經EP2和EP4介導的cAMP合成可激活腺苷酸環(huán)化酶途徑，導致血壓下降[31]。CALM負責編碼產生鈣調蛋白，后者是多功能鈣離子傳感器，在鈣依賴性信號傳導途徑中起關鍵作用，參與調控細胞增殖、靶酶如磷酸化酶激酶、鳥苷酸環(huán)化酶、磷脂酶A2等的調節(jié)、cAMP合成以及血管平滑肌細胞收縮活性[32]，與高血壓密切相關[33]。

而桑寄生-杜仲藥對干預原發(fā)性高血壓的關鍵通路主要有神經活性配體-受體相互作用、鈣信號通路、TNF信號通路。神經活性配體-受體相互作用包括了5-羥色胺(5-HT)、γ-氨基丁酸(GABA)等具有興奮或抑制神經活性的物質與受體之間的作用。中樞與外周5-HT的活性和水平與整個脈管系統密切相關，也與高血壓聯系緊密[34]；而他們發(fā)揮作用的關鍵在于與血管上各種5-HT受體的親和力，不同受體類型介導的作用不同。如5-羥色胺2A受體(5-HT2A)具有很強的縮血管作用[35]，而5-HT 1B/1D受體可以通過介導抑制交感神經末端釋放去甲腎上腺素(NE)減弱血管收縮[36]。原發(fā)性高血壓中Ca2+動員和肌絲Ca2+敏感性增強, 導致血管平滑肌過度收縮, 是高血壓重要的病理生理改變之一[37]，而血管舒張、血壓下降的關鍵在于降低細胞內鈣離子濃度，減少鈣誘導引起的鈣釋放引起的興奮-收縮偶聯，這也正是降壓藥Ca2+拮抗劑的作用依據。而TNF是具有免疫調節(jié)作用的小分子多肽，是炎癥反應的重要媒介。高血壓和高血壓前期病人血清均可檢測到TNF-α升高，而TNF-α不僅可通過細胞毒作用直接破壞血管內皮結構從而降低血管舒張功能，同時還可以促進強效縮血管物質ET-1的釋放，并通過誘導白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)等炎性因子分泌，引起血管壁重塑，阻力增高，促進原發(fā)性高血壓的發(fā)生發(fā)展[38]。

綜上可見，桑寄生-杜仲藥對的多個活性藥物組分可調控原發(fā)性高血壓的多個不同靶點，而同一靶點又能作用于不同的通路和生物學過程發(fā)揮不同效應，具有多成分、多靶點、多通路、多網絡的特點，作用機制復雜，后期仍需在本研究發(fā)現的基礎上設計完善的動物或細胞實驗對關鍵靶點加以驗證，以彌補網絡藥理學的不足，并為該藥對的臨床應用提供更多參考。