楊英英，趙林姣，楊桂娟，張 玉，付鵬躍,4，胡繼文，劉 瑩，王 楠＊

(1.三峽大學(xué)生物技術(shù)研究中心,湖北 宜昌 443002；2.林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所,國(guó)家林業(yè)和草原局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,楸樹(shù)國(guó)家創(chuàng)新聯(lián)盟,北京 100091；3.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院,云南 昆明 650224；4.東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 哈爾濱 150040)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）是一種常見(jiàn)的檢測(cè)基因表達(dá)水平的技術(shù)手段，它可以將常規(guī)PCR 和熒光檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR 擴(kuò)增的過(guò)程[1]，具有成本低、靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)[2]，被廣泛應(yīng)用于新基因挖掘及功能研究[3]。由于qRT-PCR 技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果受到樣本、實(shí)驗(yàn)條件、RNA 質(zhì)量及純度、反轉(zhuǎn)錄效率等因素的影響[4]，因此，想要獲取準(zhǔn)確度高的試驗(yàn)結(jié)果，就必須使用合適的內(nèi)參基因進(jìn)行校準(zhǔn)[5]。

在大多數(shù)基因表達(dá)分析研究中，常選用能夠維持細(xì)胞骨架或參與細(xì)胞基本生命過(guò)程的管家基因作為內(nèi)參基因，如肌動(dòng)蛋白基因（Actin）、α/β 微管蛋白基因（TUA/TUB）、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（GAPDH），多聚泛素酶基因（UBQ）以及18S核糖體RNA（18S）等[6]。然而，近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，這類(lèi)管家基因的表達(dá)穩(wěn)定性也會(huì)受到物種和組織差異的影響[7]。如在連翹葉片中UKN1的表達(dá)最穩(wěn)定，但在花和花蕾中最穩(wěn)定的基因是ACT和SDH[8]；在茉莉不同器官（根、莖、葉及花）中篩選出的理想內(nèi)參也存在差異[9]。此外，同一物種內(nèi)參基因的選擇也受不同脅迫條件的影響，如EXP1和PP2A在高鹽脅迫后的北沙參中是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，而在MeJA 處理后CYP2和α-TUB是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因[10]。楊樹(shù)不同發(fā)育時(shí)期中篩選到的理想內(nèi)參基因是U6-1、EIF4A和PP2A-2[11]，而蘇曉娟等發(fā)現(xiàn)，鋅脅迫下楊樹(shù)的actin、ubiquitin、EF1α和18S r RNA基因表達(dá)最為穩(wěn)定[12]，儲(chǔ)文淵等發(fā)現(xiàn)，楊樹(shù)在鹽和干旱脅迫下，其新內(nèi)參基因PtRG1，PtRG3和PtRG5比傳統(tǒng)內(nèi)參基因的表達(dá)更加穩(wěn)定[13]。因此，內(nèi)參基因并不具有通用性，在開(kāi)展特定研究材料或?qū)嶒?yàn)條件的實(shí)時(shí)熒光定量分析前，首先應(yīng)進(jìn)行該物種特異性內(nèi)參基因的篩選[14]。

灰楸（Catalpa fargesiiBur.）是紫葳科、梓屬落葉喬木，是我國(guó)珍貴的用材樹(shù)種和著名的園林觀賞樹(shù)種，素有“木王”之稱(chēng)?！溇夊\楸’是從灰楸實(shí)生苗選育出的新品種，其葉片呈現(xiàn)中間綠邊緣黃的特征，目前已通過(guò)高干嫁接技術(shù)廣泛應(yīng)用于園林綠化等方面。課題組前期對(duì)‘麥緣錦楸’和灰楸的生理生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)不同顏色部位葉片的色素含量及葉綠素?zé)晒鈪?shù)存在顯著差異[15]。想要進(jìn)一步揭示該生理現(xiàn)象的分子機(jī)理，就需要分析‘麥緣錦楸’葉色形成途徑中差異基因的表達(dá)模式[16]，然而，目前尚未見(jiàn)梓樹(shù)屬對(duì)不同葉色表型篩選內(nèi)參基因的相關(guān)報(bào)道，因此，開(kāi)展‘麥緣錦楸’葉片內(nèi)參基因的選擇研究，以提高基因表達(dá)量的可靠性是十分必要的。本研究借助課題組前期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過(guò)比較‘麥緣錦楸’和灰楸不同組織部位的基因表達(dá)量，初步篩選出表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定的6 個(gè)基因CfUBC、CfActin11、＞CfPP2A、CfMADH、CfGADPH、CfEF-1以及本課題組常用的內(nèi)參基因CbuActin[17]，共7 個(gè)候選內(nèi)參基因進(jìn)行qRT-PCR 分析，利用GeNorm、NormFinder 和BestKeeper 等軟件綜合分析并篩選出‘麥緣錦楸’不同葉色中表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)參基因；接著以萜類(lèi)合成相關(guān)基因（CfGES）進(jìn)一步驗(yàn)證上述分析結(jié)果的可靠性。本研究將使‘麥緣錦楸’與灰楸葉片基因表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)化和定量化更加準(zhǔn)確，并為后期開(kāi)展‘麥緣錦楸’黃綠葉色分區(qū)形成的分子研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料取自河南省洛陽(yáng)市扁擔(dān)趙基地。樣品采集后，立即用刀片將‘麥緣錦楸’葉片黃綠部分切分，分別命名為Y1（黃色）、Y2（綠色），灰楸葉片對(duì)應(yīng)部位分別命名為G1、G2（圖1）。切好的葉片用錫箔紙包裹后立即置于液氮中速凍，并轉(zhuǎn)至-80℃保存。所有的樣品均設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)。

圖1 灰楸及‘麥緣錦楸’葉片取樣圖[15]Fig.1 Samples of leaves of 'Maiyuanjinqiu' and C.fargesii.[15]

1.2 方法

1.2.1 RNA 提取與cDNA 合成 RNA 提取按照EASY spin 植物RNA 快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）的操作說(shuō)明進(jìn)行。通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 樣品的完整性，并利用超微量紫外分光光度計(jì)探頭（Nanodrop 2000）檢測(cè)所提取RNA 的濃度與純度。利用PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒（Takara，RR047A），將RNA 樣品反轉(zhuǎn)錄為cDNA，獲得的cDNA 樣品置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 候選內(nèi)參基因的篩選 以課題組前期未發(fā)表的‘麥緣錦楸’和灰楸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為依據(jù)，選取FPKM 值大于100 且在樣品間無(wú)顯著差異表達(dá)的6 個(gè)基因（CfUBC、CfActin、CfPP2A、CfMADH、CfGADPH、CfEF-1）為候選基因，加上課題組前期常用的CbuActin[17]共7 個(gè)內(nèi)參基因。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)及特異性檢測(cè) 根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，利用在線工具Primer 3 Plus 設(shè)計(jì)內(nèi)參基因及CfGES基因引物，引物大小為18～27 bp，Tm 值在58～61℃，擴(kuò)增長(zhǎng)度為150～250 bp，GC 含量為40%～60%，并在NCBI 上對(duì)引物進(jìn)行特異性檢測(cè)。引物由北京擎科生物科技有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。以各候選基因引物做普通PCR 擴(kuò)增，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 內(nèi)參基因及CfGES 基因的引物設(shè)計(jì)Table 1 Primer design for internal reference genes and CfGES gene

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 將cDNA 模板混合稀釋8 倍后，按照Takara 公司的TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) 試劑盒（Takara，RR420A）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)體系為20 μL：TB Green Premix Ex Taq 10 μL，上游引物（10 μmol·L-1）0.8 μL，下游引物（10 μmol·L-1）0.8 μL，DNA 模板1 μL，dd H2O 7.4 μL。每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，所有操作均在冰上進(jìn)行。利用LightCycler480 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀對(duì)各樣品進(jìn)行擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30 s；定量分析40 個(gè)循環(huán)：95℃ 變性5 s，60℃退火30 s；融解曲線：95℃ 5 s，60℃ 1 min 后緩慢上升至95℃；降溫：50℃ 30 s。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理和分析 將各樣品得到的Ct值按公式Q=E(minCt-sampleCt)（E為擴(kuò)增效率，默認(rèn)值為2；minCt為基因在樣品中的最小Ct值；sampleCt為基因在樣品中的Ct值）進(jìn)行計(jì)算，將得到的Q值導(dǎo)入GeNorm 和NormFinder 軟件中進(jìn)行穩(wěn)定性分析。將各樣品得到的Ct值輸入到BestKeeper軟件中，得到候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性（M值）、穩(wěn)定值（SV 值）、變異系數(shù)（CV 值）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD 值），進(jìn)行表達(dá)穩(wěn)定性分析。使用3 款軟件分析后，將各樣品得到的Ct值輸入到在線網(wǎng)站RefFinder（https://www.heartcure.com.au/forresearchers/）中進(jìn)行綜合分析，得出最適合‘麥緣錦楸’不同葉色部位穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因。

1.2.6 內(nèi)參基因穩(wěn)定性驗(yàn)證 分別以綜合分析排名最靠前的2 個(gè)基因?yàn)閮?nèi)參，對(duì)萜類(lèi)合成基因CfGES的表達(dá)情況進(jìn)行分析，qRT-PCR 方法參照1.2.4，結(jié)合CfGES基因的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)2 個(gè)內(nèi)參基因進(jìn)行表達(dá)穩(wěn)定性驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA 提取與質(zhì)量檢測(cè)

Nanodrop 檢測(cè)到所有樣品總RNA 的OD260/280及OD260/230值均在1.8～2.2 之間，說(shuō)明所提RNA純度較好，1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 樣品完整性（圖2），各樣品的28S 和18S 條帶明顯，說(shuō)明總RNA 完整性較好，均可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 ‘麥緣錦楸’和灰楸不同葉色部位總RNA 電泳圖Fig.2 Total RNA electrophoresis of different leaf color parts of 'Maiyuanjinqiu' and C.fargesii.

2.2 內(nèi)參基因引物的特異性篩選

圖3 顯示：所有引物均能擴(kuò)增出單一且亮的條帶，無(wú)引物二聚體，條帶大小與預(yù)期相符，引物特異性完好，可用于后續(xù)檢測(cè)分析。對(duì)7 個(gè)候選內(nèi)參基因在各個(gè)樣品的qRT-PCR 分析表明：各基因Ct值均在23～35，且溶解曲線都呈現(xiàn)顯著單一的峰（圖4），表明qRT-PCR 所用引物可與模板cDNA特異性結(jié)合并擴(kuò)增靶基因。

圖3 7 種內(nèi)參基因的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.3 PCR products of seven reference genes.

圖4 7 個(gè)內(nèi)參基因溶解曲線Fig.4 Real-time PCR melting curves of seven reference genes

2.3 內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

2.3.1 候選內(nèi)參基因的表達(dá)豐度分析 7 個(gè)候選內(nèi)參基因中，CfActin的平均Ct值最大，為26.459，說(shuō)明該基因的表達(dá)豐度最低；CfGADPH的平均Ct值最小，為20.91，說(shuō)明該基因的表達(dá)豐度最高。7 個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)豐度大小排序依次是：CfGADPH ＞ CbuActin ＞ CfEF-1 ＞ CfMADH＞ CfPP2A ＞CfUBC ＞ CfActin（圖5）。

圖5 7 個(gè)內(nèi)參基因平均Ct 值Fig.5 Average Ct values of seven reference genes

2.3.2 GeNorm 分析 GeNorm 是通過(guò)比較計(jì)算內(nèi)參基因穩(wěn)定性的M 值，以確定表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。該軟件以M=1.5 作為臨界點(diǎn)，低于該值表明基因的表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，且M 值越小表示內(nèi)參基因的表達(dá)越穩(wěn)定[18]。GeNorm 分析結(jié)果表明：7 個(gè)候選內(nèi)參基因的M 值均小于1.5（表2），即各候選內(nèi)參的表達(dá)都相對(duì)穩(wěn)定，穩(wěn)定性排名從高到低依次是：CfMADH＞CfEF-1＞CfGADPH＞CfPP2A＞CfActin11＞CfUBC ＞CbuActin。為確定內(nèi)參基因的最佳數(shù)量，進(jìn)一步通過(guò)配對(duì)變異系數(shù)Vn/ (n+1)，得出以4 個(gè)候選基因同時(shí)做為內(nèi)參基因的效果最佳，2 個(gè)組合使用次之（圖6）。

表2 GeNorm 軟件分析下內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性Table 2 Analysis of the expression stability of reference genes in leaves by GeNorm

圖6 GeNorm 軟件分析最適合內(nèi)參基因數(shù)目Fig.6 The number of the most suitable reference genes analyzed by GeNorm software

2.3.3 NormFinder 分析 NormFinder 的計(jì)算原理與GeNorm 相似，該軟件是基于Excel 結(jié)合組間方差與組內(nèi)方差計(jì)算SV 值，來(lái)確定內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。SV 值的大小與基因的穩(wěn)定性呈負(fù)相關(guān)。Norm-Finder 分析結(jié)果（表3）顯示：CfUBC、CbuActin、CfActin11、CfPP2A、CfGADPH、CfEF-1、CfMADH基因在葉片不同顏色部位的表達(dá)穩(wěn)定值分別為0.406、0.520、0.329、0.340、0.068、0.095、0.062，其中，CfMADH、CfEF-1和CfGADPH的SV 值最小，說(shuō)明這3 個(gè)基因的穩(wěn)定性較強(qiáng)。

表3 NormFinder 軟件分析‘麥緣錦楸’及灰楸不同葉色部位內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性Table 3 Analysis of the expression stability of reference genes by NormFinder software

2.3.4 BestKeeper 分析 BestKeeper 通過(guò)計(jì)算變異系數(shù)（CV）和標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）來(lái)反映內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，CV 和SD 的值與基因的穩(wěn)定性負(fù)相關(guān)，其中，SD 值的默認(rèn)閾值為1.0，低于該值即認(rèn)為表達(dá)穩(wěn)定[19]。BestKeeper 分析結(jié)果（表4）顯示：在灰楸及‘麥緣錦楸’葉片中，7 個(gè)基因的SD 值均小于1.0，說(shuō)明各基因的表達(dá)均較為穩(wěn)定，并且穩(wěn)定性從高到低排序依次是：CfActin11、CfMADH、CfGADPH、CfEF-1、CbuActin、CfPP2A、CfUBC，其中CfActin11的CV 和SD 值最?。–V=0.80；SD=0.21），表達(dá)最為穩(wěn)定；CfUBC的CV 和SD 值最大（CV=2.35；SD=0.62），其表達(dá)最不穩(wěn)定。

表4 BestKeeper 軟件分析灰楸及‘麥緣錦楸’不同葉色部位內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性Table 4 BestKeeper software was used to analyze the expression stability of internal reference genes in different leaf color sectors of Maiyuanjinqiu and C.fargesii.

2.3.5 綜合性分析 對(duì)GeNorm、NormFinder 以及BestKeeper 3 種軟件的數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析，綜合評(píng)估基因的表達(dá)穩(wěn)定性。將各基因在不同樣品中的Ct值導(dǎo)入在線網(wǎng)站RefFinder（https://www.heartcure.com.au/for-researchers/）中。結(jié)果顯示，各基因穩(wěn)定性綜合排名由高到低依次為CfMADH＞CfEF-1＞CfGADPH＞CfActin11＞CfPP2A＞CfUBC＞CbuActin(圖7)，其中，CfMADH和CfEF-1的表達(dá)穩(wěn)定性最好，符合qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)內(nèi)參基因的選擇標(biāo)準(zhǔn)。

圖7 RefFinder 分析7 個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性綜合排名Fig.7 Stability ranking of seven genes by RefFinder analysis

2.4 內(nèi)參基因穩(wěn)定性驗(yàn)證

分別以CfMADH和CfEF-1為內(nèi)參，分析萜類(lèi)合成酶基因CfGES在‘麥緣錦楸’和灰楸不同葉色部位（Y1、Y2、G1、G2）的表達(dá)量差異，以驗(yàn)證軟件預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性。結(jié)果表明：?jiǎn)为?dú)或組合使用CfMADH及CfEF-1基因?yàn)閮?nèi)參時(shí)，CfGES基因的表達(dá)差異與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果趨勢(shì)一致（圖8）。因此，本研究結(jié)果表明：?jiǎn)为?dú)使用CfMADH、CfEF-1基因或組合使用這2 個(gè)基因，能夠準(zhǔn)確校準(zhǔn)‘麥緣錦楸’不同葉色部位的熒光定量結(jié)果。

圖8 CfGES 在‘麥緣錦楸’和灰楸不同葉色部位的基因表達(dá)量差異Fig.8 The expression differences of CfGES among different leaf color sectors of 'Maiyuanjinqiu'and C.fargesii .

3 討論

基因表達(dá)分析是分子生物學(xué)科中最為重要的研究?jī)?nèi)容之一，qRT-PCR 是當(dāng)前最常用的檢測(cè)基因表達(dá)情況的技術(shù)手段，常用來(lái)檢測(cè)基因在不同樣品、組織、生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期及特定實(shí)驗(yàn)條件下的表達(dá)模式[20]。對(duì)基因進(jìn)行表達(dá)情況分析時(shí)，必須選擇準(zhǔn)確的內(nèi)參基因做標(biāo)準(zhǔn)化分析[21-22]。眾多研究中發(fā)現(xiàn)，管家基因可作為內(nèi)參基因來(lái)進(jìn)行表達(dá)量分析。然而近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)參基因并不具有通用性，需要根據(jù)特定的物種或?qū)嶒?yàn)條件來(lái)確定最適宜的內(nèi)參基因[23-24]。如GADPH在黃山欒樹(shù)、銀杏、肉桂和大葉清化桂中穩(wěn)定表達(dá)[25-27]，但在絲瓜和苧麻中卻被認(rèn)為是最不理想的內(nèi)參基因[28-29]。18SrRNA基因在紅豆杉多種處理下都表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性[30]，但在稻瘟病菌侵染的水稻、靈芝及紅木不同處理下該基因的表達(dá)最不穩(wěn)定[31-32]。目前尚未發(fā)現(xiàn)能在各類(lèi)實(shí)驗(yàn)條件下都穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，所以研究者需要根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)條件找到可以作為標(biāo)準(zhǔn)化的基因進(jìn)行定量分析。

GeNorm、NormFinder 和BestKeeper 是基因組研究中篩選穩(wěn)定內(nèi)參基因最常見(jiàn)的計(jì)算軟件，本研究應(yīng)用3 款軟件及1 個(gè)分析網(wǎng)站對(duì)7 個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析發(fā)現(xiàn)，這7 個(gè)內(nèi)參基因在‘麥緣錦楸’和灰楸葉片中均穩(wěn)定表達(dá)，但穩(wěn)定性排名略有差異：在GeNorm 和NormFinder 中均得出CfMADH和CfEF-I是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，而在BestKeeper中CfMADH和CfEF-I的排名卻分別居于第2 和第4名，排名的差異可能是由于3 款軟件所設(shè)定的統(tǒng)計(jì)學(xué)算法不同所導(dǎo)致的。GeNorm 和NormFinder 的原理基本相似，都是將qRT-PCR 所得到的Ct值轉(zhuǎn)化為基因相對(duì)表達(dá)量，再進(jìn)行最適內(nèi)參的分析，每個(gè)候選基因的穩(wěn)定性取決于單個(gè)樣品的最小Ct值；而B(niǎo)estKeeper 則直接在內(nèi)置公式中輸入各基因表達(dá)的Ct值來(lái)進(jìn)行分析，候選基因的穩(wěn)定性與每個(gè)樣品Ct值的離散程度相關(guān)，因此，該算法易受極端值影響，無(wú)法規(guī)避系統(tǒng)誤差[33-34]?？紤]到每款軟件的局限性，筆者利用RefFinder 對(duì)這3 款軟件得出的結(jié)果進(jìn)行綜合分析，確定了7 個(gè)候選內(nèi)參基因在‘麥緣錦楸’葉片中的穩(wěn)定性排名依次是：CfMADH＞CfEF-1＞CfGADPH＞CfActin11＞CfPP2A＞CfUBC＞CbuActin。在GeNorm 分析的內(nèi)參基因變異系數(shù)配對(duì)值來(lái)看，n=4 時(shí)，Vn/ (n+1)的比值最小，是最佳的內(nèi)參基因組合數(shù)量，n=2 次之，但綜合考慮實(shí)驗(yàn)成本及樣品用量問(wèn)題本文認(rèn)為組合使用2 個(gè)候選基因作為內(nèi)參更為合適，此前也有研究認(rèn)為以2 個(gè)或2 個(gè)以上基因?yàn)閮?nèi)參更能校準(zhǔn)定量分析實(shí)驗(yàn)上的系統(tǒng)偏差[35]。

萜類(lèi)物質(zhì)（葉綠素、胡蘿卜素）在葉色形成過(guò)程中有重要的作用。在本課題組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，萜類(lèi)合成酶基因CfGES在‘麥緣錦楸’和灰楸不同葉色部位中差異表達(dá)，可以驗(yàn)證候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。CbuActin是課題組前期利用同源克隆法獲得的內(nèi)參基因[17]，在‘麥緣錦楸’和灰楸葉片中其M＜1.5（M=0.790），符合作為內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)，但本研究通過(guò)軟件分析排名最好的內(nèi)參基因是CfMADH和CfEF-1。筆者分別以這2 個(gè)最適合的內(nèi)參基因及其組合來(lái)校準(zhǔn)CfGES的表達(dá)量，結(jié)果表明單獨(dú)或組合使用CfMADH和CfEF-1時(shí)，CfGES的表達(dá)差異與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致，進(jìn)一步表明了本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。本研究所篩選到的最適內(nèi)參基因CfMADH和CfEF-1均為真核生物中常見(jiàn)的管家基因，在其他觀賞性樹(shù)種（紫薇、花葉唐竹等）的不同葉色葉片中也被報(bào)道可作為理想內(nèi)參基因[36-38]。此外，本研究材料中CfUBC和CfActin11在‘麥緣錦楸’葉片中穩(wěn)定性不佳，但在其他物種（如景寧木蘭、板栗）中卻表現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性[39-40]，這些結(jié)論也體現(xiàn)了內(nèi)參基因不具有通用性的特點(diǎn)。

4 結(jié)論

本研究根據(jù)課題組前期研究及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出7 個(gè)候選基因（CfUBC、CfActin11、CfPP2A、CfMADH、CfGADPH、CfEF-1及CbuActin），結(jié)合qRT-PCR 技術(shù)及GeNorm、NormFinder和BestKeeper等內(nèi)參分析軟件對(duì)各候選基因進(jìn)行穩(wěn)定性分析，結(jié)果表明CfMADH和CfEF-1是最適合‘麥緣錦楸’和灰楸不同葉色部位的內(nèi)參基因，萜類(lèi)合成基因CfGES驗(yàn)證了軟件分析結(jié)果的可靠性。本研究?jī)?yōu)化了紫葳科植物‘麥緣錦楸’內(nèi)參基因的選擇，將為‘麥緣錦楸’葉色形成的分子生物學(xué)機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，也將為課題組及其它植物研究選擇合適內(nèi)參基因提供參考依據(jù)。