周 俊, 陳舒曼, 邢 兵, 陳雅靜, 李銀玲, 何 柳, 周祖平, 蒲仕明*

(1. 廣西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 廣西 桂林 541006; 2. 廣西高校干細(xì)胞與醫(yī)藥生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(廣西師范大學(xué)),廣西 桂林 541004; 3. 廣西師范大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心, 廣西 桂林 541004)

肺癌是最常見的癌癥類型，致死率居高不下的主要因素有遺傳、環(huán)境以及腫瘤治療產(chǎn)生的不良反應(yīng)[1-2]。肺癌是一種異質(zhì)性疾病，包括多個具有病理和臨床相關(guān)性的亞型，主要分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌[3]。肺癌的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體的免疫系統(tǒng)密切相關(guān)，正常的免疫應(yīng)答是機(jī)體抵抗腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素。免疫系統(tǒng)和腫瘤細(xì)胞相互作用能夠影響腫瘤的形成和進(jìn)程[4]。在腫瘤組織中，腫瘤細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞等共同構(gòu)成腫瘤微環(huán)境[5-6]。腫瘤微環(huán)境是一個復(fù)雜的細(xì)胞生態(tài)位，其免疫細(xì)胞能夠在腫瘤向惡性腫瘤轉(zhuǎn)化的過程中與腫瘤細(xì)胞共同進(jìn)化，并為腫瘤細(xì)胞提供支持，促進(jìn)腫瘤的存活和進(jìn)程。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的種類和數(shù)量在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，其中骨髓來源的抑制性細(xì)胞(myeloid derived suppressor cells)和Treg細(xì)胞的數(shù)量與腫瘤患者臨床預(yù)后負(fù)相關(guān)[7]。CD4+CD25+細(xì)胞在抗腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。CD4+CD25+細(xì)胞是調(diào)節(jié)性CD4+T細(xì)胞亞群，可以被自身抗原和非自身抗原激活，激活后非特異性抑制T細(xì)胞在維持機(jī)體免疫耐受和體內(nèi)平衡中起重要作用[8]。目前，腫瘤發(fā)生中CD4+CD25+免疫抑制機(jī)制已有初步研究結(jié)果：CD4+CD25+細(xì)胞介導(dǎo)的抑制是通過一種獨(dú)立于細(xì)胞因子之外的未知的細(xì)胞接觸依賴機(jī)制；而在體內(nèi)，則可能存在多種抑制機(jī)制[9]，一是CD4+CD25+細(xì)胞的不同亞群通過細(xì)胞接觸(例如表達(dá)機(jī)制性受體CTLA-4和LAG-3[10-11])或者多種細(xì)胞因子(例如IL-10、TGF-β、IL-35[12-14])產(chǎn)生抑制，二是CD4+CD25+細(xì)胞可能被多種機(jī)制抑制。然而在正常生理狀態(tài)下，仍有大量Treg細(xì)胞存在，可以抑制炎癥并抑制許多自身免疫性疾病[15-16]。這些正常狀態(tài)下的Treg細(xì)胞在腫瘤環(huán)境中是否發(fā)揮著與腫瘤來源Treg細(xì)胞同樣的免疫調(diào)節(jié)作用，還有待確認(rèn)。

本研究利用Lewis肺癌模型，探討移植正常和荷瘤小鼠脾臟來源的CD4+CD25+細(xì)胞對荷瘤小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級C57BL/6J小鼠購自湖南省斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，在廣西師范大學(xué)干細(xì)胞與醫(yī)藥生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)動物中心飼養(yǎng)至8周，挑選體質(zhì)量(22±0.5) g健康小鼠用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

流式細(xì)胞分選儀(FACS Aria SORP)和流式細(xì)胞分析儀(FACS Verse)購自Becton Dickinson公司；超純凈去離子水組合系統(tǒng)(Nanopure Life Scientific)和臺式高速冷凍離心機(jī)(Labofuge400R)購自Thermo Fisher公司；超凈工作臺購自ESCO公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

Anti-mouse CD3-PerCP-eFluor710、Anti-mouse CD25-APC、Anti-mouse CD4-FITC、Anti-mouse CD8-PE-Cy7、7-AAD、DMEM培養(yǎng)基購自Thermo Fisher公司；無鈣鎂20×PBS溶液購自上海生工生物工程有限公司；青鏈霉素混合液、紅細(xì)胞裂解液等購自Solarbio公司。

1.2 方法

1.2.1 肺癌小鼠模型構(gòu)建

選擇對數(shù)生長期的LLC細(xì)胞，消化后PBS重懸為2.5×106個/mL單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液接種于小鼠左腋皮下，每只小鼠接種0.2 mL，對照組注射等體積的PBS。受體荷瘤小鼠分3組：1)移植正常小鼠脾臟來源CD4+CD25+細(xì)胞的荷瘤小鼠(N-Treg-T)；2)移植荷瘤小鼠脾臟來源CD4+CD25+細(xì)胞的荷瘤小鼠(T-Treg-T)；3)注射等體積PBS的荷瘤小鼠為對照組(PBS-T)。

1.2.2 流式細(xì)胞分選

T-Treg細(xì)胞供體小鼠是接種LLC細(xì)胞5周后、腫瘤體積大于2 cm3的小鼠；N-Treg細(xì)胞供體小鼠是注射等體積PBS 5周后的小鼠。首先，在無菌條件下制備小鼠脾臟單細(xì)胞懸液，經(jīng)紅細(xì)胞裂解和細(xì)胞篩過濾后，離心去上清并計數(shù)；接著，使用7-AAD、Anti-mouse CD4-FITC、Anti-mouse CD25-APC流式抗體4 ℃避光孵育30 min；然后，用PBS洗滌重懸，并進(jìn)行流式細(xì)胞分選(或分析)；最后，收集得到CD4+CD25+細(xì)胞，備用。

1.2.3 細(xì)胞移植

將PBS重懸流式分選得到的正常和荷瘤小鼠脾臟來源的CD4+CD25+細(xì)胞調(diào)整為1.25×105個/mL后，于實(shí)驗(yàn)鼠接種LLC細(xì)胞當(dāng)日，尾靜脈移植CD4+CD25+細(xì)胞，每只小鼠注射約0.2 mL。對照組為尾靜脈注射等體積PBS。

1.2.4 腫瘤體積測量

LLC細(xì)胞接種5周后，用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑a、短徑b，并計算腫瘤體積。

1.2.5 流式細(xì)胞分析

移植CD4+CD25+細(xì)胞5周后，處死小鼠，取外周血(眼球取血)、脾臟制備單細(xì)胞懸液。懸液經(jīng)紅細(xì)胞裂解和細(xì)胞篩過濾后，離心去上清；使用Anti-mouse CD3-PerCP-eFluor710、Anti-mouse CD4-FITC、Anti-mouse CD8-PE-Cy7流式抗體4 ℃避光孵育30 min，PBS洗滌重懸后，進(jìn)行流式分析T細(xì)胞及亞群的豐度。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有數(shù)據(jù)采用 GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析；組間分析采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常/荷瘤小鼠脾臟中存在相當(dāng)數(shù)量的Treg細(xì)胞

為確定在正常生理與病理(腫瘤)狀態(tài)下Treg細(xì)胞的數(shù)量，本文利用流式細(xì)胞術(shù)分析CD4+CD25+細(xì)胞在正常小鼠與肺癌荷瘤小鼠脾臟中的含量與絕對數(shù)量，結(jié)果如圖1所示。正常和荷瘤小鼠脾臟中，CD4+CD25+細(xì)胞分別約占總細(xì)胞數(shù)的2.39%和1.32%(圖1a)，統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn)兩者之間存在顯著性差異(2.408±0.148 3 vs 1.347±0.187 9,P=0.002 2)(圖1b)。同時，我們發(fā)現(xiàn)腫瘤狀態(tài)下，小鼠脾臟體積明顯增大(圖1c)，隨后對小鼠CD4+CD25+細(xì)胞的絕對數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)荷瘤小鼠脾臟CD4+CD25+細(xì)胞的絕對數(shù)量顯著高于對照組小鼠(8.246±1.018 vs 3.098±0.520 6,P=0.002)(圖1d)。腫瘤發(fā)生中，Treg細(xì)胞數(shù)量明顯上升，揭示了Treg細(xì)胞在腫瘤免疫調(diào)節(jié)(主要是免疫抑制)中的重要性。然而，正常生理狀態(tài)下也存在大量的Treg細(xì)胞，那么正常生理狀態(tài)下Treg細(xì)胞與腫瘤來源的Treg細(xì)胞是否具有同樣的免疫調(diào)節(jié)作用呢？具體見下節(jié)。

*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.000 1，n=5圖1 正常和荷瘤小鼠脾臟大小和CD4+CD25+細(xì)胞的含量比較Fig. 1 Comparison of spleen size and CD4+CD25+ cell content in normal and tumor-bearing mice

2.2 正常來源Treg細(xì)胞較腫瘤來源Treg細(xì)胞具有相反的免疫調(diào)節(jié)作用

為檢測正常生理狀態(tài)下Treg細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用，在小鼠皮下接種LLC細(xì)胞當(dāng)日，尾靜脈注射正?；蚝闪鰜碓吹腃D4+CD25+細(xì)胞，對照組尾靜脈注射等體積PBS，觀察3組小鼠腫瘤的生長情況，并于接種后第5周統(tǒng)計腫瘤質(zhì)量。腫瘤大小直觀圖如圖2a所示。腫瘤大小統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，在接種5周后，移植正常小鼠來源CD4+CD25+細(xì)胞的受體荷瘤小鼠的腫瘤質(zhì)量顯著小于對照組(5.328±0.501 1 vs 7.588±0.655 5,P=0.025 5)，同時也顯著小于移植荷瘤小鼠來源CD4+CD25+細(xì)胞的受體荷瘤小鼠的腫瘤質(zhì)量(5.328±0.501 1 vs 9.580±0.310 1,P<0.000 1)；與之相反，移植腫瘤來源的CD4+CD25+細(xì)胞小鼠的腫瘤質(zhì)量顯著大于對照組(9.580±0.310 1 vs 7.588±0.655 5,P=0.025 2)(圖2b)。

*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.000 1圖2 荷瘤小鼠移植不同來源CD4+CD25+細(xì)胞5周后腫瘤生長情況Fig. 2 Tumor growth of mice after 5 weeks of transplantation of CD4+CD25+ cells from different sources in tumor-bearing mice

2.3 正常來源Treg細(xì)胞延長了荷瘤小鼠生存時間

為檢驗(yàn)正常來源Treg細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)能力，記錄了移植正常來源Treg細(xì)胞和腫瘤來源Treg細(xì)胞的荷瘤小鼠生存情況，結(jié)果如圖3所示。與對照組相比，移植正常來源CD4+CD25+細(xì)胞組小鼠的生存期顯著性增長(P=0.007 6)，而移植荷瘤小鼠來源CD4+CD25+細(xì)胞的受體小鼠的生存期縮短(P=0.026 3)。上述結(jié)果表明，腫瘤來源的Treg細(xì)胞具有免疫抑制作用，而正常來源的Treg細(xì)胞抑制著腫瘤的生長，具有免疫促進(jìn)作用。

圖3 移植不同來源CD4+CD25+細(xì)胞后小鼠生存時間(n=8)Fig. 3 Survival time of mice after transplantation of CD4+CD25+ cells from different sources (n=8)

2.4 正常來源Treg細(xì)胞促進(jìn)了荷瘤小鼠中T細(xì)胞增殖

為探索正常來源的Treg細(xì)胞對T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用，在移植正常/腫瘤來源的CD4+CD25+細(xì)胞5周后，處死小鼠，利用流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠外周血與脾臟中CD3+T細(xì)胞、CD3+CD4+T細(xì)胞和CD3+CD8+T細(xì)胞的豐度，結(jié)果如圖4所示。與對照組相比，移植正常小鼠來源的CD4+CD25+細(xì)胞小鼠的脾臟中，CD3+T細(xì)胞(21.81±0.628 9 vs 18.58±1.312,P=0.043 1)(圖4A)、CD3+CD4+T細(xì)胞(11.24±0.497 1 vs 8.935±0.891 1,P=0.040 1)(圖4B)、CD3+CD8+T細(xì)胞(8.696±0.435 4 vs 7.073±0.543 8,P=0.035 2)(圖4C)的細(xì)胞豐度顯著增加。

在外周血中也呈現(xiàn)相似差異，移植正常小鼠來源CD4+CD25+細(xì)胞小鼠的外周血中，CD3+T細(xì)胞(21.73±1.509 vs 15.78±0.367 3,P=0.001 8)(圖5A)、CD3+CD4+T細(xì)胞(8.811±0.749 9 vs 6.186±0.551 6,P=0.013 6)(圖5B)、CD3+CD8+T細(xì)胞(12.99±0.749 6 vs 9.451±0.782 3,P=0.005 7)(圖5C)的細(xì)胞豐度顯著增加。結(jié)果表明，移植正常來源的Treg細(xì)胞能促進(jìn)T細(xì)胞的增殖，與移植腫瘤來源的Treg細(xì)胞具有相反的調(diào)節(jié)T細(xì)胞增殖的能力。

A1、A2為移植后小鼠脾臟CD3+T細(xì)胞的表達(dá)；B1、B2為移植后小鼠脾臟CD3+CD4+T細(xì)胞的表達(dá)；C1、C2為移植后小鼠脾臟CD3+CD8+T細(xì)胞的表達(dá)。*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.000 1(n=8)圖4 移植不同來源CD4+CD25+細(xì)胞后小鼠脾臟T細(xì)胞及其亞群的表達(dá)情況Fig. 4 Expression of splenic T cells and their subpopulations in mice after transplantation ofCD4+CD25+ cells from different sources

2.5 正常來源Treg細(xì)胞減緩了荷瘤小鼠的腫瘤肺轉(zhuǎn)移癥狀

為檢驗(yàn)正常來源的Treg細(xì)胞在腫瘤轉(zhuǎn)移的免疫調(diào)節(jié)能力，在移植正常/腫瘤來源的CD4+CD25+細(xì)胞5周后，處死小鼠，利用HE組織染色技術(shù)觀察肺部病變情況，見圖6。結(jié)果顯示：對照組小鼠肺表面出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移情況，HE組織染色顯示，肺泡輪廓可見，肺泡壁細(xì)胞壞死，細(xì)胞核形狀出現(xiàn)明顯變化，有炎癥細(xì)胞浸潤。與對照組相比，移植正常小鼠來源的CD4+CD25+細(xì)胞小鼠的肺部外觀正常，無明顯轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，HE組織染色與外觀結(jié)果相符合，無明顯病變；而移植荷瘤小鼠來源的CD4+CD25+細(xì)胞小鼠的肺部外觀出現(xiàn)更明顯的肺轉(zhuǎn)移情況，肺部體積增大，HE組織染色可見彌散的灶性病變，病灶內(nèi)肺組織周圍固有結(jié)構(gòu)被破壞。結(jié)果表明，移植正常來源的Treg細(xì)胞能減緩腫瘤肺轉(zhuǎn)移的速度，有助于維持肺部的正常形態(tài)和功能。

3 討論

正常的免疫應(yīng)答是機(jī)體抵抗腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要因素，其中CD4+CD25+細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答在抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用。大量研究表明，腫瘤患者預(yù)后不良[17]、生存率下降與Treg細(xì)胞高表達(dá)密切相關(guān)，Treg細(xì)胞能夠引發(fā)免疫耐受[18]。但也有研究表明，Treg細(xì)胞對多種炎癥性疾病有治療或預(yù)防效果，例如：小鼠肺纖維化形成之前，移植正常來源CD4+CD25+細(xì)胞能夠有效減輕其肺纖維化程度[19]；白塞病小鼠移植正常來源CD4+CD25+細(xì)胞可改善其感染癥狀[20]。因此，本文利用肺癌皮下移植腫瘤模型小鼠探究正常生理狀態(tài)下Treg細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。

A1、A2為移植后小鼠外周血CD3+T細(xì)胞的表達(dá)；B1、B2為移植后小鼠外周血CD3+CD4+T細(xì)胞的表達(dá)；C1、C2為移植后小鼠外周血CD3+CD8+T細(xì)胞的表達(dá)。*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.000 1(n=8)圖5 移植不同來源CD4+CD25+細(xì)胞后小鼠外周血T細(xì)胞及其亞群的表達(dá)情況Fig. 5 Expression of peripheral blood T cells and their subpopulations in mice after transplantation of CD4+CD25+ cells from different sources

圖6 移植不同來源CD4+CD25+細(xì)胞后小鼠肺部組織及HE組織染色切片F(xiàn)ig. 6 Lung tissue and HE tissue staining sections of mice after transplantation of CD4+CD25+ cells from different sources

結(jié)果顯示：與對照組荷瘤小鼠相比，移植正常小鼠來源CD4+CD25+細(xì)胞的荷瘤小鼠，腫瘤增長速度較緩，移植第5周時，腫瘤質(zhì)量顯著性減小，小鼠生存期顯著性增長，T細(xì)胞及其亞群的細(xì)胞豐度有所增加，肺組織無明顯病變；移植荷瘤小鼠來源CD4+CD25+細(xì)胞的荷瘤小鼠，腫瘤體積增長速度較快，腫瘤質(zhì)量顯著性增大，小鼠生存期縮短，T細(xì)胞及其亞群的細(xì)胞豐度減小，肺組織兆性病變。值得一提的是，實(shí)驗(yàn)組間對比顯示，移植正常小鼠來源CD4+CD25+細(xì)胞的小鼠T細(xì)胞及其亞群的細(xì)胞豐度顯著性高于移植荷瘤小鼠來源CD4+CD25+細(xì)胞的小鼠。此外，有研究表明，肺癌小鼠移植荷瘤來源CD4+CD25+細(xì)胞后，CD4+CD25+細(xì)胞以非直接作用于腫瘤細(xì)胞的方式促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[21]，但也有研究表明白塞病小鼠移植正常來源CD4+CD25+細(xì)胞后，CD4+CD25+細(xì)胞介導(dǎo)的對炎癥有抑制作用的細(xì)胞因子IL-10、TGF-β表達(dá)上調(diào)，而在炎癥疾病中過表達(dá)的細(xì)胞因子IFN-α、IL-6、IL-17表達(dá)下調(diào)[20]。這些結(jié)果提示，CD4+CD25+細(xì)胞能夠參與腫瘤發(fā)展與進(jìn)程，正常來源的CD4+CD25+細(xì)胞有助于減緩肺癌發(fā)展速度，延長生存期，而荷瘤來源的CD4+CD25+細(xì)胞加速肺癌進(jìn)程，縮短生存期。

Treg細(xì)胞對炎癥、腫瘤等疾病具有治療效果，這種機(jī)制還尚未得到闡明。Treg細(xì)胞的免疫抑制核心是Foxp3，F(xiàn)oxp3的穩(wěn)定對于治療自身免疫性疾病和移植排斥的過繼細(xì)胞治療非常重要，F(xiàn)oxp3的不穩(wěn)定可能對治療癌癥和傳染病有益。有研究表明，天然Treg細(xì)胞在炎癥微環(huán)境中表現(xiàn)出表型和功能的可塑性，CD4+CD25+細(xì)胞能夠再編程分化成為效應(yīng)性T細(xì)胞，增強(qiáng)腫瘤免疫應(yīng)答，抑制腫瘤的發(fā)展[22-23]。本文結(jié)果顯示，與對照組相比，移植正常來源的Treg細(xì)胞后，CD3+T細(xì)胞及其亞群T細(xì)胞能檢測出較對照更豐富的T細(xì)胞存在。綜上所述，CD4+CD25+細(xì)胞在肺癌的進(jìn)程中起重要作用，正常鼠脾臟來源的CD4+CD25+細(xì)胞減緩了肺癌模型小鼠的腫瘤進(jìn)程，其結(jié)果可能為肺癌的發(fā)病機(jī)制以及免疫防治提供思路。

4 結(jié)語

荷瘤小鼠移植正常小鼠來源的CD4+CD25+細(xì)胞后，生存期延長、腫瘤生長緩慢、外周血與脾臟中T細(xì)胞及其亞群含量增加，減緩了肺癌小鼠腫瘤發(fā)展進(jìn)程，而移植荷瘤小鼠來源的CD4+CD25+細(xì)胞后，生存期縮短、腫瘤生長較快、外周血與脾臟中T細(xì)胞及其亞群含量顯著下降，促進(jìn)了肺癌模型鼠腫瘤進(jìn)程。