任文文，孫云澤，李 蓉

(大連工業(yè)大學 生物工程學院，遼寧 大連 116000)

伴隨著經濟的高速發(fā)展，人們對能源的需求也在逐漸增加，可再生資源的利用成為目前研究熱點。木質纖維素作為全球第一大可再生資源，對其進行高效的降解轉化應用一直受到廣泛的關注[1-2]。裂解多糖單加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenases，LPMO)是一類新發(fā)現的銅離子依賴性的氧化酶，可以通過氧化作用切斷結晶纖維素鏈的糖苷鍵，在多糖鏈中產生一個新的斷裂點，使纖維素酶降解纖維素效率提高[3-6]。因此，利用LPMO協(xié)同纖維素酶高效降解纖維素在綠色能源工業(yè)上具有重要應用前景，但由于游離酶進行催化反應存在著不穩(wěn)定、難以重復利用等問題，限制了酶在工業(yè)生產中的應用。為了將酶制劑應用于工業(yè)化生產中，人們將酶固定于不溶于水的載體上，以克服游離酶在應用時所存在的缺陷。

一般情況下，根據酶與載體之間的相互作用，將酶的固定化從大方向上分為2種方法：物理法和化學法。其中物理法中最常見的是包埋法和吸附法，而化學法中最常見的是共價偶聯法和交聯法[7-10]。包埋法將酶包裹在不溶性的載體中，其適用于大多數酶的固定化，但當底物與產物分子量較大時不適用[11-13]；吸附法是一種將載體與酶表面的次級鍵相連接從而實現固定化的方法，該方法具有條件溫和、操作簡單等優(yōu)點，但在高鹽濃度、高底物濃度和高溫下存在易解吸的缺點[14-16]；共價偶聯法將酶的非必需側鏈基團和載體功能基團通過共價鍵連接在一起，具有良好的穩(wěn)定性，但在共價偶聯處理載體時所用的試劑容易使酶變性；交聯法將載體與蛋白質通過化學鍵結合起來形成具有一定結構的高分子，通常為網狀，雖然應用相對廣泛，但酶在交聯過程中與交聯劑是通過化學鍵連接的，因此酶的三級結構容易被破壞，交聯過程中易使酶失活[17]。因此，在對酶的固定化條件進行選擇時需要考慮操作情況、造價以及是否會破壞酶活和穩(wěn)定性等方面。

隨著對固定化技術的不斷研究，一種以酶作為有機部分、金屬磷酸鹽作為無機部分形成“有機-無機”雜化納米花的固定化方法逐漸得到人們的關注[18-20]。Yin等[21]對α-糜蛋白酶使用磷酸鈣作為載體進行固定化，對形成的固定化酶活性進行計算，結果顯示酶活性提高了266%；Ge等[22]首次在較溫和的條件下使用磷酸銅作為載體骨架，將漆酶作為該骨架上的有機組分，合成了納米級晶體，即有機-無機雜化納米花狀粒子，并發(fā)現該結構下的漆酶納米花酶與游離酶相比活性提高了約650%。He等[23]同樣使用磷酸銅作為無機部分，辣根過氧化物酶作為有機部分成功制備了HRP-Cu3(PO4)2雜化納米花。

本文以Cu3(PO4)2作為載體骨架，裂解多糖單加氧酶cx-LPMO-B作為該骨架上的有機組分制備裂解多糖單加氧酶-磷酸銅雜化納米花(cx-LPMO-B-NF)。通過優(yōu)化試驗條件得到最適固定化條件，并對制備的固定化酶酶學性質進行表征鑒定。實驗結果表明本文所制備的固定化酶呈納米級花狀結構且具有較好重復性。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器

MD spectramax paradigm酶標儀(美谷分子儀器(上海)有限公司)；JSM 6460掃描電子顯微鏡、JEM 2100透射電子顯微鏡(日本電子株式會社)；搖床(伊孚森生物技術有限責任公司)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限公司)。

1.2 實驗材料與試劑

裂解多糖單加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenases，LPMO)來源于大連工業(yè)大學微生物資源與催化實驗室的纖維素降解菌Arthrobotryssp. CX1，重組表達菌株pPICZαA-cx-LPMO-B為實驗室前期構建保藏菌。

醋酸銨、硫酸銨、甲醇、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、葡萄糖、3，5-二硝基水楊酸、甘油均購自天津科密歐化學試劑有限責任公司；蛋白胨、酵母浸粉、無氮源酵母浸粉、牛血清蛋白(BSA)、SDS、EDTA、咪唑、β-巰基乙醇等購自生工生物工程(上海)有限公司；五水硫酸銅購自百靈威科技有限公司。以上試劑均為分析純。

2 實驗方法

2.1 cx-LPMO-B的表達純化

重組表達菌pPICZαA-cx-LPMO-B接種到YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將種子液按1∶50的比例擴培到BMGY培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，轉菌到200 mL大體系的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)72 h，期間每隔24 h加體積比1.5%的甲醇至培養(yǎng)基中，最后收取上清。使用Ni柱對其進行純化，得到純化的目的蛋白cx-LPMO-B用于固定化研究。

2.2 cx-LPMO-B酶活的測定

cx-LPMO-B酶活定義：以質量分數1%的PASC(磷酸溶脹纖維素)為底物，1 h內轉化生成1 μmol還原糖所需的酶量定義為1 U。

反應體系：以200 μL的1% PASC作為底物，與200 μL酶液反應，加入6 μL 100 mmol/L的 Vc提供反應所需要電子，補充加入194 μL醋酸銨緩沖溶液，得到總量為600 μL的反應體系，50 ℃下水浴24 h，使用DNS法測定產生的還原糖量，根據產生的還原糖量計算酶活及相對酶活。

2.3 cx-LPMO-B-NF的制備

2.3.1 制備cx-LPMO-B-NF的最適條件

對制備cx-LPMO-B-NF最適條件即室溫下攪拌和靜置條件進行研究。在2 mL濃度為0.01 mol/L的PBS(pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液)中加入0.3 g/L 400 μL cx-LPMO-B，再向溶液中緩慢滴加500 μL濃度為120 mmol/L的CuSO4·5H2O，補充加入1 100 μL超純水至總體積為4 mL。室溫下靜置、攪拌，每組做3個平行實驗。每隔2 h取一次樣，至16 h結束，離心取上清檢測酶含量，計算酶固定率。

固定率的計算方法為

式中：η為固定率；C1為測得上清酶含量；C2為原始酶含量。

2.3.2 制備cx-LPMO-B-NF的最適酶濃度

酶的添加量對納米花的形狀以及大小有著重要的影響，而金屬離子無機載體負載量又是一定的，因此酶的添加對納米花的形成起著重要作用。本文酶以0.2、0.3、0.4、0.5 g/L的添加量加入到固定化體系中，測定其剩余酶濃度，確定最適酶濃度，每組做3個平行實驗。

2.3.3 制備cx-LPMO-B-NF的最適溫度

對制備cx-LPMO-B-NF最適溫度進行研究。在體系為2 mL濃度為0.01 mol/L的PBS(pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液)中加入0.3 g/L 400 μL cx-LPMO-B，再向溶液中緩慢滴加500 μL濃度為120 mmol/L的CuSO4·5H2O，補充加入1 100 μL超純水至總體積為4 mL，每組做3個平行實驗。分別在4、16和25 ℃攪拌反應，攪拌過程中分別在上述固定化條件下每隔2 h取一次樣，直至16 h結束，離心取上清檢測酶含量計算酶固定率。

2.3.4 制備cx-LPMO-B-NF的最適pH

對制備cx-LPMO-B-NF的最適pH進行研究。調固定化所用的磷酸鹽緩沖液的pH分別為6.0、7.4、8.0、9.0，對cx-LPMO-B-NF進行固定化，離心取上清檢測酶含量計算酶固定率。每組做3個平行實驗。

2.4 納米花形態(tài)表征

2.4.1 SEM

處理硅片：將硅片切割成約1 cm×1 cm，在無水乙醇中超聲處理20 min除去硅片上的雜質，取出后用超純水沖洗3次，滴加無水乙醇，室溫干燥后即可使用。

處理樣品：將經過液氮冷凍干燥后得到的納米花顆粒使用少量無水乙醇潤濕，緩慢滴加到硅片上，待無水乙醇完全揮發(fā)后，將硅片用導電膠黏到載物臺上。

2.4.2 TEM

樣品處理方法與SEM基本相同。將樣品經過無水乙醇浸潤后滴加到銅網膜上，使用透射電子顯微鏡進行觀察，當找到某一片樣品位置后，將該位置進行放大，觀察其細微結構。

2.5 cx-LPMO-B-NF的酶學性質

2.5.1 cx-LPMO-B-NF的最適溫度

以200 μL 1% PASC作為底物，加入200 μL cx-LPMO-B-NF(使用游離酶做對照組，相同體系)，加入6 μL濃度為100 mmol/L Vc提供反應所需要電子，最后補充194 μL濃度為50 mmol/L的醋酸銨緩沖溶液，得到體積為600 μL的反應體系，于30、40、50、60、70 ℃水浴反應24 h，每組做3個平行實驗。使用DNS法測定產生的還原糖量，測定OD540，根據產生的還原糖量計算酶活以及相對酶活。

2.5.2 cx-LPMO-B-NF的最適pH

以200 μL 1% PASC作為底物，加入200 μL cx-LPMO-B-NF(使用游離酶做對照組，相同體系)、加入6 μL濃度為100 mmol/L Vc提供反應所需要電子，加入pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的50 mmol/L醋酸銨緩沖溶液194 μL，得到不同pH總體積均為600 μL的反應體系，50 ℃水浴反應24 h，每組做3個平行實驗。使用DNS法測定產生的還原糖量，測定OD540，根據產生的還原糖量計算酶活以及相對酶活。

2.5.3 cx-LPMO-B-NF的儲存穩(wěn)定性

將cx-LPMO-B-NF保存于磷酸鹽緩沖溶液中，放置于4 ℃冰箱，每3 d測定一次酶活直至15 d，每組做3個平行實驗。

2.5.4 cx-LPMO-B-NF的循環(huán)使用次數

以200 μL的1% PASC作為底物，加入200 μL cx-LPMO-B-NF，加入6 μL 100 mmol/L Vc提供反應所需要電子，最后補充加入194 μL醋酸銨緩沖溶液，得到總體積為600 μL的反應體系，50 ℃水浴反應24 h，測定的酶活為100%?；厥展潭ɑ覆⑾礈?次，重復反應6次，測定每次固定化酶的殘余酶活力。每組做3個平行實驗。

3 結果與分析

3.1 cx-LPMO-B的表達純化

通過對重組表達菌株pPICZαA-cx-LPMO-B進行表達，得到含有酶的發(fā)酵液，根據基因cxLPMOB片段大小推測酶的相對分子質量理論值為33 kDa，由于蛋白表達翻譯后修飾的原因，酶實際相對分子質量變大，如圖1通過Ni柱純化的方法對酶進行純化，根據電泳結果確定酶相對分子質量大小約為54 kDa。后續(xù)實驗均采用此方法得到純化后的酶。

1. cx-LPMO-B粗酶液原液；2. 過Ni柱穿出液；3. Binding平衡柱子；4. Ni柱純化后酶液-1；5. Ni柱純化后酶液-2；M. Maker圖1 純化結果Fig. 1 Purification results

3.2 cx-LPMO-B-NF的制備條件

3.2.1 制備cx-LPMO-B-NF的最適條件

將納米花的制備條件設為靜止與攪拌2種(在攪拌條件下進行取樣，因過程較劇烈，取樣過程中會存在微量誤差)，計算過程中將最高固定率設為100%。如圖2，在靜止條件下2 h時固定化率約為90%，隨著時間的延長固定化率逐漸降低，在9 h左右固定化率降低至約30%。分析認為是由于靜止條件下滴入Cu2+時cx-LPMO-B-NF迅速產生，或者酶吸附于快速形成的結構上，而有機-無機納米花的形成一般分為3步：首先是核的形成；其次是花的生長；最后是花的完成[17]。靜止條件下由于納米花快速形成，致使形成過程中其結構和致密度不夠，隨著酶的堆積，形成的不太穩(wěn)定的片段結構脫落，從而使固定化率降低。攪拌條件下2 h時固定化率約為65%，隨著時間的延長固定化率逐漸升高，在16 h左右固定化率升至約95%。分析認為當滴加Cu2+時，由于攪拌的原因使反應體系混合均勻，雖然前期酶固定化率低，但形成的納米化結構均勻致密，隨著攪拌時間的延長，滿足了形成納米花的3個步驟，從而酶的固定化率逐漸升高，在16 h時固定化率達到最高95%左右。綜合時間成本考慮，將實驗的條件選為攪拌14 h進行固定化。

圖2 制備Cu3(PO4)2納米花的最適條件Fig. 2 Optimal conditions for preparing Cu3(PO4)2 nanoflowers

3.2.2 制備cx-LPMO-B-NF的最適酶濃度

酶的濃度對所形成的納米花有著重要的影響。如圖3所示，當添加酶濃度為0.3 g/L進行固定化反應時，固定上的酶濃度約為0.19 g/L，約占總酶濃度的66.7%，當添加酶濃度分別為0.4、0.5 g/L時，固定上的酶濃度分別約為0.17、0.16 g/L，隨著酶添加量增多，固載量有微量下降。因此，合適的酶濃度對固定化過程十分重要，本文選取酶濃度為0.3 g/L對其進行固定化。

圖3 制備Cu3(PO4)2納米花的最適酶濃度Fig. 3 Optimal protein concentration for preparing Cu3(PO4)2 nanoflowers

3.2.3 制備cx-LPMO-B-NF的最適溫度和最佳反應時間

制備cx-LPMO-B-NF的固定化率隨溫度的變化如圖4，由圖可見，在25 ℃固定化率最高。圖5為制備Cu2+納米花時固定化率隨時間和溫度變化圖，取最適反應時間14 h為截止點，可以看出不同溫度下隨著制備時間的延長固定化率呈現逐漸上升的趨勢，在25 ℃時固定化率達到最高。通過與25 ℃不添加Cu2+對照，發(fā)現在不添加Cu2+的情況下酶基本維持不變，進一步說明酶是通過形成的Cu2+納米花被固定的。分析認為在溫度較低的情況下，cx-LPMO-B與Cu3(PO4)2結合緩慢，進而成花緩慢，且溫度較低的情況下納米花的粘合度不夠，形成散落的片狀，不能很好地進行組裝，從而使酶在其上的吸附量降低。因此選取25 ℃為最佳固定化溫度。

3.2.4 制備cx-LPMO-B-NF的最適pH

對固定化過程中磷酸鹽緩沖溶液的最適pH進行考察，如圖6所示，發(fā)現在磷酸鹽緩沖溶液pH為7.4時固定化率達到最高35%，而在pH分別為6.0、8.0、9.0時固定化率均達不到25%，這與He等[23]的結果一致。因此在固定化過程中，選擇磷酸鹽緩沖溶液最適pH為7.4進行固定化反應。

圖4 制備Cu3(PO4)2納米花的最適反應溫度Fig. 4 Optimum temperature for preparing Cu3(PO4)2 nanoflowers

圖5 制備Cu3(PO4)2納米花不同溫度下最適反應時間Fig. 5 Optimum time for preparing Cu3(PO4)2 nanoflowers at different temperatures

圖6 制備Cu3(PO4)2納米花最適pHFig. 6 Optimum pH for preparing Cu3(PO4)2 nanoflowers

3.3 最適條件制備的cx-LPMO-B-NF酶活的測定

根據前面實驗得到的最適反應條件制備得到cx-LPMO-B-NF，測定其酶活，最高可達28.266 U/mg。圖7為固定化酶與游離酶的酶活，由圖可見，兩者基本相同，但固定化酶由于具有穩(wěn)定性好、可重復使用等優(yōu)點，在工業(yè)生產中更加具有優(yōu)勢。

3.4 納米花形態(tài)表征

通過SEM對最適反應條件制得的cx-LPMO-B-NF結構進行表征，如圖8所示，Cu2+納米花顆粒大小均勻，分散性好，形狀呈盛開狀，花瓣分散狀態(tài)較好，該結構可增加酶固定化的表面積，進而提高酶的固載量，同時花瓣狀的結構可以將酶更好地包裹，使酶不受外界因素的干擾，提高酶的穩(wěn)定性[24]。利用cx-LPMO-B-NF作用底物時可增大酶與底物的接觸面積，從而促進反應的進行。

圖8 SEM表征納米花結構Fig. 8 SEM characterization of nanoflower structure

如圖9所示，通過TEM分析制備得到的cx-LPMO-B-NF，結果發(fā)現“花瓣”狀結構不是緊密連接在一起的，中間存在許多縫隙，可以使其更好地與酶進行結合，提高酶與底物的結合面積，進一步提高酶的催化活性。

圖9 TEM表征納米花結構Fig. 9 TEM characterization of nanoflower structure

3.5 cx-LPMO-B-NF的酶學性質

3.5.1 cx-LPMO-B-NF的最適溫度

固定化技術一般可以增大酶的最適溫度范圍。如圖10所示，游離酶的最適溫度為60～70 ℃，其在40 ℃時相對酶活僅為65%；固定化酶最適溫度為50～60 ℃，其在40 ℃時相對酶活仍達到85%，表明磷酸銅雜化納米花固定化能增大cx-LPMO-B酶的最適溫度范圍。但由于納米材料不耐高溫，當溫度過高時，固定化酶的酶活會快速降低，如在70 ℃時相對酶活迅速降低至55%左右。

圖10 cx-LPMO-B-NF的最適溫度Fig. 10 Optimum temperature for cx-LPMO-B-NF to act on the substrate

3.5.2 cx-LPMO-B-NF的最適pH

cx-LPMO-B-NF在不同pH時的酶活如圖11所示，固定化酶較游離酶的pH穩(wěn)定性窄一些，在pH為4.0時達到最高酶活，隨后迅速降低，在pH為7.0時固定化酶相對酶活降至65%左右。說明pH對納米花的影響較大。

圖11 cx-LPMO-B-NF的最適pHFig. 11 Optimum pH for cx-LPMO-B-NF to act on the substrate

3.5.3 cx-LPMO-B-NF的儲存穩(wěn)定性

如圖12所示，游離酶在放置6 d后只保留50%左右的酶活，9 d后則酶失活。而固定化酶cx-LPMO-B-NF隨著儲存時間的延長酶活有微量增加，可能是由于無機晶體磷酸銅納米花在4 ℃條件下，長時間儲存時有少量固定的cx-LPMO-B酶分子從載體上脫落，造成酶活有所提高。相比較游離酶，cx-LPMO-B-NF具有較好的儲存穩(wěn)定性，儲存15 d后仍表現出較高的酶活，這是由于納米花多孔結構保護了酶分子，使其在儲藏過程中不易發(fā)生結構的改變，從而提高了酶的穩(wěn)定性。

圖12 cx-LPMO-B-NF儲存穩(wěn)定性Fig. 12 cx-LPMO-B-NF storage stability

3.5.4 cx-LPMO-B-NF的循環(huán)使用次數

如圖13所示，隨著循環(huán)次數的增加酶活逐漸降低。第1次使用時，酶活為100%；第2次重復使用后酶活迅速降低，約為75%；而之后的重復使用過程中酶活雖然一直降低，但降低速度比較緩慢。分析認為，在重復使用過程中，由于需要反復沖洗使部分固定不牢固的酶脫落，首次使用后的脫落情況最為嚴重，但剩余納米花上的酶較穩(wěn)定，因此經過6次循環(huán)利用后相對酶活仍然可達到60%左右，具有較高的工業(yè)應用潛力。

圖13 cx-LPMO-B-NF的循環(huán)使用次數Fig. 13 Number of cycles of cx-LPMO-B-NF

4 討論

自2021年LPMO被發(fā)現以來，研究人員一直圍繞著開發(fā)新來源酶以及研究其協(xié)同降解纖維素的作用機制進行研究，但目前很少有針對LPMO固定化的報道。本文首次利用金屬離子在鹽溶液中配位沉淀一步制得酶無機雜化納米花的方法，將LPMO固定于無機載體Cu3(PO4)2上形成雜化納米花固定化酶，從而解決酶的重復利用率低、難以回收等問題，使該酶制劑應用于工業(yè)生產中成為可能。同時該方法制備過程簡單易操作、綠色環(huán)保且耗能低，更有利于在工業(yè)中生產固定化酶[25]。

利用納米花狀粒子作為載體固定酶分子，其比表面積大，有利于吸附更多酶分子，并可提高其固定化酶的酶活，同時花瓣狀結構對固定上的酶有很好的保護，提高固定化酶的穩(wěn)定性及重復利用性。本文研究中固定化酶量隨著酶濃度增加而增加，但當飽和后固定化酶量則會有少量的下降。酶濃度對無機雜化納米花固定化過程十分重要，Wang等[26]研究發(fā)現加入不同淀粉酶量，對固定化酶納米花生成形態(tài)有影響，酶濃度為0.2 g/L時，固定化酶呈現納米花狀，但當酶濃度為2 g/L時，固定化酶的形態(tài)則呈平行六面體狀；王宏[27]對二鳥苷酸環(huán)化酶進行固定化研究發(fā)現，當固定酶量未達到載體的飽和量時，固定化酶量隨著酶量的增加而增加，但是當酶量達到載體的飽和量時，結合位點飽和，繼續(xù)增加酶量會導致酶與載體親和力下降，影響酶與載體的有效結合。朱衡等[28]使用羧基載體 LX-1000IDA對脂肪酶進行固定化，在重復催化4次后剩余50%左右的酶活。彭開敏等[29]以豬肝酯酶作為有機部分，以磷酸鈣作為固定化載體進行固定化，所得固定化酶重復使用6次后其活性僅為10%左右，重復利用性大大低于本文制備的固定化酶。由此可見，“有機-無機”雜化納米花的固定化方法可作為一種綠色易操作的固定化方法進行酶的工業(yè)固定化，同時通過此固定化方法固定LPMO，可提高其重復利用性，為LPMO在工業(yè)生產中的應用提供更多的可能性。

5 結論

本實驗通過向含有裂解多糖單加氧酶cx-LPMO-B的磷酸鹽緩沖溶液中滴加金屬離子制備得到雜化cx-LPMO-B-金屬納米花固定化酶。最佳制備條件為：pH 7.4的磷酸緩沖液、25 ℃、攪拌反應14 h、蛋白酶添加量為0.3 g/L，所制備的裂解多糖單加氧酶cx-LPMO-B-NF活性最高。對納米花進行SEM掃描電子顯微鏡以及TEM透射電子顯微鏡觀察發(fā)現，納米花結構為盛開的花朵狀，花朵之間留有縫隙，并非緊密地包裹在一起，為酶的固定化留有空間。固定化酶最適反應pH為4.0，最佳反應溫度為50 ℃。cx-LPMO-B-NF具有一定的儲存穩(wěn)定性，但較長時間儲存過程中存在酶輕微脫落的現象，原因有待進一步研究。在經過6次重復利用后相對酶活仍可達到60%左右，因此在進一步提高重復利用性以及儲存穩(wěn)定性后，其在工業(yè)應用上具有巨大潛力。