遠 方 趙萬超

（遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院住院部腎內(nèi)科，遼寧 沈陽 110032）

目前腎纖維化（腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化）是腎臟在各種急慢性致病因素（包括炎癥、損傷等）作用下的病理改變過程，細胞外基質(zhì)（Extra cellular matrix，ECM）在腎臟過度沉積是其主要病理特征。近年來纖維化相關(guān)細胞因子的發(fā)現(xiàn)及相應抗纖維化方法的提出使現(xiàn)代醫(yī)學抗腎纖維化的研究有了很大進展，但研究表明這些方法臨床治療效果并不理想，而且大多數(shù)實驗仍處于動物實驗階段。從中醫(yī)病機角度分析，腎臟纖維化作為一個過度修復的過程，應該屬于“邪氣實”，因此既往以補益腎氣、活血化瘀、泄?jié)嶙鳛槟I纖維化治療的主要中醫(yī)治療方法。中醫(yī)理論認為腎臟疾病表現(xiàn)為實證時，必定有其正虛的一面，即所謂“邪之所湊，其氣必虛”，瘀血為邪實之首，貫穿于腎纖維化過程中，因此治療上需扶正化瘀，邪正兼顧，使祛邪不傷正，扶正不助邪，方奏捷效。益腎降濁化瘀方是遼寧省中醫(yī)院腎內(nèi)科臨床經(jīng)驗方，以“益氣化瘀泄?jié)岱ā崩碚摓榛A，經(jīng)多年的臨床應用證明，此方可明顯改善早期慢性腎衰竭患者的臨床癥狀[1-3]。因此，本實驗主要研究益腎降濁化瘀方對腎間質(zhì)纖維化模型大鼠腎組織Smad2 及CHIP 的影響，探索益氣化瘀泄?jié)岱鼓I間質(zhì)纖維化的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SPF 級40 只雄性SD 大鼠，體質(zhì)量（180±20）g，均購自遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物中心。此次實驗方案經(jīng)由遼寧中醫(yī)藥大學倫理委員會批準，在遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物中心清潔級動物房飼養(yǎng)及觀察。

1.1.2 實驗藥物 益腎降濁化瘀方由丹參10 g，牡丹皮12 g，牛膝15 g，大黃9 g，黃芪30 g，太子參20 g，砂仁6 g，山萸肉15 g，藿香15 g，佩蘭15 g，清半夏10 g，茯苓15 g，白茅根15 g，菟絲子15 g，14 味中藥組成。購買于遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院門診部草藥局，常規(guī)水煎2 次后合并濾液濃縮成1 g/mL（每毫升含1 g 生藥），放置4 ℃冰箱冷藏備用。尿毒清顆粒購于沈陽市國大藥房（內(nèi)蒙古康臣藥業(yè)有限責任公司，規(guī)格：5 g/袋，國藥準字Z20073256）。

1.1.3 主要試劑和儀器 4%多聚甲醛（國藥集團化學試劑有限公司，20170513A），大鼠Smad2、CHIP 免疫組化試劑盒均（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，GR245116-5、GR32006021-7）?？俁NA 提取物試劑盒購于北京天根生物，引物由上海生物生工提供。全自動生化分析儀（日本東芝），自動平衡離心機（長沙天創(chuàng)儀器制造有限公司），BS-51 型顯微鏡（日本Olympus），電泳槽（北京君意東方電泳設備有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制備及分組 將40 只SPF 級健康SD 雄性大鼠隨機選取10 只作為空白對照組，其余30 只根據(jù)文獻[4]建立腎間質(zhì)纖維化大鼠模型。按200 mg/kg 劑量給予2.0%的腺嘌呤混懸液，每日定時給藥，前12 d 每日給藥1 次，第13 天開始，隔日給藥1 次，動物造模過程28 d。造模結(jié)束后隨機分為模型組、尿毒清組、益腎降濁化瘀方組。

1.2.2 給藥方案 模型制備成功后，益腎降濁化瘀方組以20.2 g/kg 灌胃給藥，尿毒清組予尿毒清顆粒混懸液2.5g/kg 灌胃。模型組、空白對照組給予等體積純凈水，1 次/d，均于每日上午8：30—9：30 灌胃1 次，連續(xù)給藥28 d。

1.2.3 腎組織標本制備 標本采集于29 d 上午，將SD雄性大鼠稱重，用10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，處死SD 大鼠，取出腎臟，取部分腎臟組織置于4%的多聚甲醛溶液中固定保存用于免疫組化檢測，余下組織保存于-80 ℃冰箱用于Western blot 檢測。

1.2.4 免疫組織化學檢測 常規(guī)固定、脫水、石蠟包埋、切片（厚度為4 μm），置于防脫片載玻片上，撈片后入烤箱烘烤（58～60 ℃）50 min，使切片緊密黏附；PBS 緩沖液沖洗5 min 2 次；新配制的3%雙氧水與蒸餾水按1∶10 混合于室溫條件下10 min 以滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水洗2 min 3 次；0.01 mol/L 枸櫞酸鹽（pH 6.0）浸漬切片，電磁爐煮沸后斷電，每10 min 重復1 次，冷卻后用PBS（pH 7.2～7.6）洗滌2 次，室溫下5 min 左右，PBS（pH 7.2～7.6）洗3 次；滴加5%BSA 封閉液，室溫條件下20 min 后切片上多余液體蒸發(fā)干凈；滴加適當稀釋的兔抗鼠Ⅲ型膠原（ColⅢ）抗體、兔抗鼠Ⅳ型膠原（ColⅣ）抗體（一抗）37 ℃孵育1 h，PBS（pH 7.2～7.6）洗2～3 次；滴加生物素標記兔抗大鼠IgG（二抗），37 ℃孵育20 min，PBS（pH 7.2～7.6）洗5 min 4 次；蒸餾水1 mL 分別加入到DAB 試劑盒A、B、C 試劑中各1 滴，混合均勻后加至切片37 ℃反應30 min；蒸餾水洗，脫水，透明，樹脂膠封片；奧林巴斯BS-51 顯微鏡觀察；以細胞質(zhì)或細胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒作為陽性表達標準，以不著色為陰性標準。采用JD801 數(shù)碼顯微圖像分析系統(tǒng)軟件分析，在200 倍光鏡下每張切片隨機選取5 個視野拍照，測量積分光密度值（積分光密度=平均光密度×選定對象面積），取其平均值進行分析，比較各組Smad2 及CHIP 陽性表達差異。

1.2.5 蛋白免疫印跡（Western Blot，WB）檢測大鼠腎組織中Smad2 及CHIP 相關(guān)蛋白表達情況，將100 mg 大鼠腎臟組織剪碎，其后使用磷酸鹽緩沖液（PBS）反復沖洗，進行離心，離心后加入裂解液，冰水浴當中進行勻漿，其后再次離心10 min 取上清液，再應用BCA 法測定蛋白濃度調(diào)平，調(diào)平后使用SDS-PAGE 凝膠電泳，完成后使其轉(zhuǎn)移至PVDF 膜（0.45 μm）上，其后使用5%脫脂奶粉封閉2 h，于冰箱調(diào)至4 ℃與一抗溫育過夜。隔日滴加二抗于室溫孵育1 h，其后使用顯色液顯色，暗室曝光下應用全自動化學發(fā)光圖像分析儀掃描樣本光密度，并收集樣本圖像以行灰度分析，以β-actin 為參照。

1.3 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)處理采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以（）表示，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，各組兩兩比較用LSD 法。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化檢測結(jié)果 腎組織Smad2 及CHIP 表達半定量分析免疫組化結(jié)果表明，經(jīng)藥物干預后，Smad2 及CHIP 在尿毒清組及益腎降濁化瘀方組蛋白水平表達較模型組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）；益腎降濁化瘀方組與尿毒清組比較無差異統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。提示益腎降濁化瘀方對SD 大鼠腎組織Smad2、CHIP 蛋白水平的表達具有抑制作用。見表1。

表1 各組大鼠Smad2、CHIP 積分光密度值比較 （，μg/L）

表1 各組大鼠Smad2、CHIP 積分光密度值比較 （，μg/L）

注：與正常組比較，※P<0.05；與模型組比較，●P<0.05；與尿毒清組比較，○P＞0.05。

2.2 Western Blot 檢測結(jié)果 與正常組比較尿毒清組和益腎降濁化瘀方組Smad2、CHIP 蛋白表達顯著上升，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）；與模型組比較，各給藥組Smad2、CHIP 蛋白表達均有不同程度顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）；尿毒清組和益腎降濁化瘀方組差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見圖1，表2。

圖1 各組大鼠腎組織Smad2、CHIP 蛋白表達條帶圖

表2 各組大鼠腎組織Smad2、CHIP 蛋白表達（）

表2 各組大鼠腎組織Smad2、CHIP 蛋白表達（）

注：與正常組比較，※P<0.05；與模型組比較，●P<0.05；與尿毒清組比較，○P＞0.05。

3 討論

各種慢性腎臟病是進展到終末期腎病的共同轉(zhuǎn)歸，從世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計數(shù)據(jù)中可見2012 年全球慢性腎臟病所致死亡人數(shù)已達全球總體死亡人數(shù)的1.5%[5]；我國有關(guān)慢性腎臟病的統(tǒng)計中，其患病率大約占致13%，與2012 年數(shù)據(jù)相比，已上升了近3%[6]。全球及我國的統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，慢性腎臟病與日俱增的發(fā)病率并且嚴重危害患者生命健康。其主要病理學特征為腎間質(zhì)纖維化。腎間質(zhì)纖維化發(fā)生機制是由炎癥細胞、細胞因子和炎癥介質(zhì)等多種作用因素導致腎臟組織中間質(zhì)細胞增多，進而形成纖維組織，導致腎臟結(jié)構(gòu)受到損傷?，F(xiàn)代醫(yī)學對于慢性腎臟病的治療用藥較多，但仍以控制飲食、對癥控制血壓、血糖、糾正離子及代謝紊亂等為主，因個體原發(fā)病差異較大，治療效果并不明顯。中醫(yī)學對于慢性腎臟病的治療，特別在延緩腎功能進展方面均取得了較好的效果。遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院腎內(nèi)科臨床應用多年的益腎降濁化瘀方以“補腎益氣、降濁化瘀”的思路為辨證指導，通過中藥各藥物間的配伍從而達到多靶點、多途徑的治療目標，對于延緩慢性腎臟病、改善腎間質(zhì)纖維化均取得了較好的臨床效果[7-9]。

該方由菟絲子、牛膝、太子參、山萸肉、茯苓、黃芪、丹參、砂仁、牡丹皮、大黃、藿香、佩蘭、清半夏、白茅根14 味中藥組成，為腎內(nèi)科名老中醫(yī)治療氣虛濕濁瘀阻所致慢性腎衰之精煉組方。具有補腎益氣、活血化瘀、化濕泄?jié)岬墓π?。方中重用黃芪、太子參及菟絲子為君藥補腎益氣，輔以丹參、牛膝、大黃、砂仁、藿香等臣藥共奏活血化瘀通絡、化濕泄?jié)嶂Α?/p>

既往有學者研究表明，TGF-β 1 作為一種強效的致纖維化因子，為腎纖維化發(fā)生、發(fā)展過程中重要的作用因子，而Smad2 是完成TGF-β 1 致纖維化信號傳導作用的重要下游遞質(zhì)，主要作用于促進細胞外基質(zhì)腎臟纖維化的形成[6]。CHIP 作為泛素E3 連接酶介導Smad 蛋白的降解，對于Smad 家族起著必不可少的調(diào)配作用。因此，干預CHIP 的異常表達成為研究腎間質(zhì)纖維化的重要靶點之一。

結(jié)果說明，益腎降濁化瘀方能有效延緩CRF 腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展，其機制可能與抑制CHIP 及Smad2 等因子的表達有關(guān)。而益腎降濁化瘀法中藥復方治療慢性腎臟病具有多靶點、多調(diào)控機制的作用，但其內(nèi)在作用機制及調(diào)控靶點仍需要進一步研究。