呂國達(dá) 魏俏紅 康煒鵬 徐士磊 胡菡│文

1 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蜂產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（北京） 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100193；2 蜜蜂飼養(yǎng)與蜜蜂生物學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì) 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100193；3 遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，興城 125100

前言

蜂王漿（Royal Jelly）又名蜂皇漿，是蜂群中哺育蜂咽下腺和上顎腺分泌的一種乳白色或淡黃色的漿狀物質(zhì)，主要用于飼喂1～3日齡幼蟲和蜂王[1-2]。作為天然的功能性食品，蜂王漿具有免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、抗氧化、抗菌消炎、抗糖尿病、降血脂、抗高血壓、抗腫瘤等生物學(xué)功能，而深受人們的青睞[3-5]。蜂王漿的這些功能來自于其豐富的活性成分，其中含水量約為60%～70%，蛋白質(zhì)9%～18%，糖類7%～18%，脂質(zhì)3%～8%，礦物質(zhì)0.8%～3%，還含有維生素、酚類和氨基酸等物質(zhì)[6-7]。

蜂王漿作為一種功能性食品，深受廣大消費(fèi)者的喜愛。但在生產(chǎn)、儲(chǔ)存和運(yùn)輸投放到市場的過程中，難免會(huì)因?yàn)榇娣艞l件的不合適而導(dǎo)致蜂王漿質(zhì)量下降，有效活性的喪失[8]。因此，蜂王漿新鮮度也是其品質(zhì)的重要指標(biāo)[9]。蜂王漿特有的一種活性物質(zhì)，10-羥基-2-癸烯酸又稱王漿酸（10-HDA），含量為1.4%～2.0%[6-7]，在國際和行業(yè)中通常用來評價(jià)蜂王漿的質(zhì)量。由于其在高溫環(huán)境中也非常穩(wěn)定，盡管能夠在一定程度上反映蜂王漿的質(zhì)量，但不能夠代表蜂王漿的新鮮度[9-10]。

蛋白質(zhì)作為蜂王漿中含量最高的一類活性物質(zhì)，是蜂王漿功能的重要體現(xiàn)[11-12]，會(huì)隨著儲(chǔ)存溫度升高和時(shí)間的延長發(fā)生顯著變化[13-14]。蜂王漿蛋白質(zhì)主要包括水溶性蛋白和非水溶性蛋白，其中水溶性蛋白約占蛋白總量的46%～89%[15]。蜂王漿主蛋白家族（Major Royal Jelly Proteins，MRJPs）占蜂王漿可溶性蛋白質(zhì)含量的 80%以上[16-17]，其中，MRJPl、MRJP2、MRJP3、MRJP4 和MRJP5約占MRJPs總量的82%～90%[18]。研究表明，MRJP3～5在蜂王漿中含量相對較低，且對儲(chǔ)存溫度敏感[13]。我們通過對蜂王漿抗菌性和可溶性蛋白質(zhì)溶液的活性檢測，評價(jià)了不同儲(chǔ)存條件對蜂王漿中多種蛋白質(zhì)含量的影響，發(fā)現(xiàn)蜂王漿中MRJP4含量隨儲(chǔ)存溫度的升高和時(shí)間的延遲而降低，且其含量在一定程度上能夠表征蜂王漿的新鮮度，因此，選取MRJP4作為蜂王漿新鮮度的標(biāo)志物[9]。

為了考察我國蜂王漿生產(chǎn)的整體質(zhì)量水平，以及可溶性蛋白質(zhì)MRJP4含量作為蜂王漿新鮮度評價(jià)指標(biāo)的可行性，本研究采集來自全國14個(gè)省市的不同蜜粉源的151個(gè)新鮮蜂王漿樣品，參考國家標(biāo)準(zhǔn)《蜂王漿》GB 9697-2008檢測蜂王漿樣品中的水分含量，采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法檢測10-HDA含量，考馬斯亮藍(lán)染色法測定可溶性蛋白質(zhì)濃度，以及夾心ELISA法測定MRJP4含量。通過對比不同地區(qū)不同蜜粉源生產(chǎn)蜂王漿的各項(xiàng)指標(biāo)，探討導(dǎo)致蜂王漿理化指標(biāo)不同的原因，以及對蜂王漿MRJP4含量的影響。本研究基于現(xiàn)有蜂王漿質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)，為制定蜂王漿新鮮度評價(jià)指標(biāo)提供理論依據(jù)，這將對我國蜂王漿產(chǎn)業(yè)實(shí)行優(yōu)質(zhì)優(yōu)價(jià)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

2 材料與方法

2.1 蜂王漿樣品采集

2020年的3～8月間，共采自全國14個(gè)省市（圖1）不同蜜粉源的新鮮蜂王漿樣品151個(gè)。這14個(gè)省市劃分為：東北及華北地區(qū)，包括黑龍江省、遼寧省、吉林省和北京市；西北地區(qū)包括青海省和新疆維吾爾自治區(qū)；華中及西南地區(qū)包括河南省、湖北省和重慶市；東南部地區(qū)包括安徽省、福建省、江蘇省、江西省和浙江??；各地區(qū)分別采集新鮮蜂王漿樣品50、40、22和41個(gè)，詳細(xì)信息見表1。除個(gè)別樣品外，每個(gè)蜂場或者生產(chǎn)者采集新鮮蜂王漿樣品2管，每管大于30 g，取樣后立刻凍存，放置-20℃保存待測，存放1個(gè)月內(nèi)進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測。

圖1 蜂王漿采樣地區(qū)分布圖

表1 蜂王漿樣品信息

2.2 水分含量的測定

蜂王漿中水分含量測定參考《蜂王漿》國家標(biāo)準(zhǔn)（GB 9697-2008）。精密稱量1 g蜂王漿樣品于干燥至恒量的稱量皿中，放入減壓干燥箱，在75℃，壓力-0.095～-0.10 MPa下干燥4 h，冷卻30 min后稱量，反復(fù)干燥直至前后兩次質(zhì)量差不超過2 mg為恒量。每個(gè)樣品重復(fù)兩次。

2.3 10-羥基-2-癸烯酸含量的測定

蜂王漿中10-HDA含量測定采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定（LC-MS/MS, Thermo QE，美國）[9]。采用正離子模式，挑選10-HDA 的特征離子187.13287 m/z進(jìn)行碎裂，對MS/MS的特征碎片81.07 m/Z峰面積進(jìn)行定量，計(jì)算10-HDA的含量。每個(gè)樣品三個(gè)重復(fù)。

2.4 水溶性蛋白含量的測定

采用考馬斯亮藍(lán)法（G250）測定蜂王漿中可溶性蛋白質(zhì)的含量。取1 g 蜂王漿加蒸餾水充分溶解至20 ml水溶液，4℃超聲10 min，取2 ml樣品，4℃，12,000 rpm離心20 min，取上清為蜂王漿蛋白提取液（S液）；此提取液再稀釋20倍，595 nm波長下，酶標(biāo)儀測量吸光值。標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為0.05～0.3 ng/μl。每個(gè)樣品三個(gè)重復(fù)。

2.5 MRJP4含量的測定

將2.4制得S液再依次稀釋50倍和10倍，一共稀釋10000倍。根據(jù)MRJP4試劑盒說明，用全波長酶標(biāo)儀在450 nm波長，測量各樣品的光密度，并計(jì)算MRJP4的含量。每個(gè)樣品三個(gè)重復(fù)。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析

用單樣本Kolmogorov-Smi rnov檢驗(yàn)對151種蜂王漿理化性質(zhì)的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并確定為正態(tài)分布。本文中蜂王漿理化指標(biāo)均采用軟件SPSS 26.0的單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 總體指標(biāo)分析

2020年3 月至2020年8月期間，在我國14個(gè)省市，收集了不同蜜粉源植物的蜂王漿樣品，共計(jì)151個(gè)。按照樣品采集地區(qū)劃分為東北地區(qū)（三個(gè)天氣較為寒冷的省份）、西北地區(qū)(平均海拔高于海平面，寒冷且干燥)、東南地區(qū)（低海拔省份，天氣溫和且降雨量較多）和中部地區(qū)（天氣較為干燥）。按照不同蜜粉源植物來劃分，將多于5個(gè)蜂場的同一蜜粉源植物為一個(gè)分類，其他均歸為百花蜜粉源，主要采集了油菜、洋槐、茶花、椴樹、橘子花期和百花蜜粉源的蜂王漿樣品。

采集的151個(gè)蜂王漿樣品的水分、10-HDA含量、可溶性蛋白質(zhì)含量和MRJP4含量的平均值分別為62.04%、1.72%、11.99 g/100g和447.38 μg/100g蜂王漿（表2）。世界其他國家也開展了蜂王漿生產(chǎn)的研究。伊朗三個(gè)不同地區(qū)代表性氣候的生產(chǎn)的蜂王漿樣品，蜂王漿總蛋白含量為11.5%～14.5%，10-HDA含量為0.676%～ 2.443%[19]。歐洲采自摩洛哥、葡萄牙和西班牙的6個(gè)蜂王漿樣品，它們的總酚含量在3～9 mg/g蜂王漿，黃銅/黃酮醇含量為0.1～0.5 mg/g蜂王漿，10-HDA含量為0.9%～1.2%，總蛋白含量為5.5%～29.7%[20]。由此比較可見，我國蜂王漿整體質(zhì)量水平較高，在生產(chǎn)上并未因?yàn)楫a(chǎn)量的提高而降低品質(zhì)。

表2 蜂王漿的理化指標(biāo)結(jié)果 (mean±sem)

按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB9697-2008要求進(jìn)行劃分，采集的151個(gè)蜂王漿樣品的水分含量均達(dá)到優(yōu)等品標(biāo)準(zhǔn)（含水≤67.5%）。而10-HDA的含量均值為1.72%；151個(gè)蜂王漿樣品中優(yōu)等品（含量>1.8%）60個(gè)，占總數(shù)量的39.74%；合格品（1.4%～1.8%）65個(gè)，占總數(shù)量的43.05%。就這兩項(xiàng)來說，本研究采集的我國大部分蜂王漿產(chǎn)品質(zhì)量較好。

蜂王漿中10-HDA含量一直是蜂王漿生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)中衡量蜂王漿質(zhì)量的一項(xiàng)重要指標(biāo)。在以往的研究中，在浙江省開展的兩項(xiàng)研究中，實(shí)驗(yàn)分別測得蜂王漿樣品中10-HDA含量在1.27%～1.44%和1.82%～2.10%[21]。而在云南省西方蜜蜂蜂王漿中10-HDA含量為2.33%～2.43%[22]。本研究中151個(gè)蜂王漿樣品中10-HDA含量分布在0.98%～3.57%，測定值分布范圍寬主要是由于采集樣品的范圍較廣，地域、蜜粉源植物和生產(chǎn)管理模式都是影響因素。

MRJP4作為一項(xiàng)新的檢測指標(biāo)提出用于評價(jià)蜂王漿的新鮮度[9,23]。因此，本研究采集了不同地區(qū)、不同蜜粉源和不同蜂種生產(chǎn)的蜂王漿來考察我國蜂王漿中MRJP4含量的范圍，為今后將MRJP4作為蜂王漿新鮮度評價(jià)指標(biāo)提供理論基礎(chǔ)。在151個(gè)樣品中，以本實(shí)驗(yàn)操作進(jìn)行檢測，MRJP4的最低含量為24.73 μg/100g，低于100 μg/100g的樣品一共有17個(gè)（占11.3%）；含量在100～500 μg/100g的樣品有78個(gè)（占51.7%）；含量在500～1000 μg/100g的樣品有33個(gè)（占21.9%），超出1000 μg/100g檢出限的樣品有23個(gè)（占15.2%），因此，含量在500 μg/100g以上的樣品占了37.1%。這151個(gè)蜂王漿樣品中MRJP4含量測定值范圍包含了2016年和2017年在北京蜂場生產(chǎn)的新鮮蜂王漿實(shí)驗(yàn)檢測值（約0.2 mg/100g）[24]。

（未完待續(xù)）