房鈺良，李宜雷，劉真真，劉艷飛，朱元祺1,*

(1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部 檢驗(yàn)系，山東 青島266071；2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 青島266003；3.山東省日照市人民醫(yī)院，山東 日照276826)

頭狀葡萄球菌屬于條件致病菌，在自然界中分布廣泛，可引起皮膚軟組織、心內(nèi)膜炎和血流等感染[1-2]。利奈唑胺為惡唑烷酮類抗菌藥物，自2000年上市以來(lái)，國(guó)內(nèi)外陸續(xù)報(bào)道以凝固酶陰性葡萄球菌為主的利奈唑胺耐藥株[3-4]。頭狀葡萄球菌對(duì)利奈唑胺的耐藥機(jī)制有多種。其中，cfr基因(chloramphenicol-florfenicolresistance,氯霉素-氟甲砜霉素耐藥基因)編碼的甲基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的耐藥越來(lái)越引起臨床的重視，因?yàn)樵摶虺３Ｎ挥诳梢苿?dòng)質(zhì)粒上，從而使頭狀葡萄球菌通過接受外來(lái)的耐藥質(zhì)粒而獲得耐藥性[5]。此外，另一個(gè)位于質(zhì)粒上的耐藥optrA基因(編碼ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)也介導(dǎo)利奈唑胺耐藥[3]。到目前為止，關(guān)于ICU患者分離的耐利奈唑胺的頭狀葡萄球菌的報(bào)道相對(duì)較少。因此，本文對(duì)2018年6月-2019年10月分離自某醫(yī)院ICU患者血液標(biāo)本的耐利奈唑胺頭狀葡萄球菌進(jìn)行cfr基因和optrA基因檢測(cè)，并對(duì)這些菌株之間的同源性進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株收集的利奈唑胺耐藥頭狀葡萄球菌是2018年6月-2019年10月分離自某醫(yī)院ICU患者的血液標(biāo)本，共9株，分離自9位患者。沙門菌H9812作為脈沖場(chǎng)電泳分子量標(biāo)記菌，金黃色葡萄球菌ATCC29213為儀器藥敏質(zhì)控菌株，均為本實(shí)驗(yàn)室保存。cfr和optrA基因陽(yáng)性對(duì)照的松鼠葡萄球菌由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)樊老師惠贈(zèng)。

1.2 儀器與試劑VITEK 2 Compact 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)(生物梅里埃公司)。藥敏卡為GP67(梅里埃)，結(jié)果判定依據(jù)CLSI-2019標(biāo)準(zhǔn)[6]。脈沖場(chǎng)電泳系統(tǒng)CHEF-DR II和凝膠成像ChemiDoc XRS(美國(guó)BIO-RAD公司)。其他試劑為寶生物(Takara)公司。

1.3cfr和optrA基因的擴(kuò)增和測(cè)序cfr基因(編碼甲基轉(zhuǎn)移酶)和optrA基因(編碼ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)的擴(kuò)增依據(jù)參考文獻(xiàn)進(jìn)行[5，7]。目的基因的PCR引物合成及擴(kuò)增產(chǎn)物片段的測(cè)序?yàn)樯?上海)生物工程有限公司。

1.4 菌株的Sma I酶切頭狀葡萄球菌基因組脈沖場(chǎng)凝膠電泳脈沖場(chǎng)凝膠電泳具體操作參照文獻(xiàn)改良[8]。電泳參數(shù)：電壓6 V/cm,夾角120°，轉(zhuǎn)角時(shí)間，初始轉(zhuǎn)角4 s，終末轉(zhuǎn)角40 s，電泳時(shí)間19 h。結(jié)果判定依據(jù)Tenover規(guī)則[9]。

1.5 菌株的高通量測(cè)序基于二代Illumina和三代Nanopore測(cè)序平臺(tái)對(duì)代表性頭狀葡萄球菌QD40株進(jìn)行測(cè)序。然后，對(duì)獲得的細(xì)菌基因組和質(zhì)粒序列利用ResFinder等一系列軟件分析菌株的生物信息。

2 結(jié)果

2.1 菌株的藥敏和耐藥基因的擴(kuò)增和測(cè)序結(jié)果

9株頭狀葡萄球菌分離株(QD31-QD37,QD40和QD41)的頭孢西丁篩選實(shí)驗(yàn)都是陽(yáng)性，并對(duì)青霉素、苯唑西林、紅霉素、克林霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星和利奈唑胺耐藥，但對(duì)萬(wàn)古霉素、替加環(huán)素和利福平敏感，詳見表1。

PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物測(cè)序顯示這9株頭狀葡萄球菌都攜帶cfr基因，但未檢測(cè)到optrA基因。cfr基因的PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果見圖1。

表1 頭狀葡萄球菌臨床株的藥敏結(jié)果(μg/mL)

圖1 PCR擴(kuò)增頭狀葡萄球菌cfr基因的產(chǎn)物電泳圖

2.2 Sma I酶切頭狀葡萄球菌基因組脈沖場(chǎng)凝膠電泳

Sma I酶切脈沖場(chǎng)凝膠電泳顯示9株頭狀葡萄球菌的電泳條帶位置大小和數(shù)目完全相同。依據(jù)Tenover規(guī)則[9]，這9株頭狀葡萄球菌屬于相同的基因型，是相同的菌株(Indistinguishable)，即暴發(fā)菌株，表明在ICU患者間存在同一克隆的流行播散。9株頭狀葡萄球菌的脈沖場(chǎng)凝膠電泳結(jié)果見圖2。

2.3 菌株的高通量測(cè)序結(jié)果

基于高通量測(cè)序平臺(tái)，獲得了頭狀葡萄球菌QD40株的染色質(zhì)(命名為QD40-chr)和攜帶的3個(gè)質(zhì)粒(分別命名為pQD40-1 ，pQD40-2和pQD40-3)的全序列。經(jīng)軟件分析顯示：染色質(zhì)QD40-chr攜帶了erm(A),aac(6′)-aph(2″),aadD,ant(9)-Ia和mecA耐藥基因；頭狀葡萄球菌QD40株攜帶3個(gè)質(zhì)粒，其中質(zhì)粒pQD40-3大小為39 504 bp，攜帶了cfr基因。菌株的高通量測(cè)序分析結(jié)果詳見表2。

3 討論

隨著利奈唑胺在臨床感染治療中的應(yīng)用，對(duì)利奈唑胺耐藥病原菌的報(bào)道越來(lái)越多，并以凝固酶陰性葡萄球菌為主[1,3]。對(duì)利奈唑胺耐藥的機(jī)制為：①23S rRNA V區(qū)基因突變；②核糖體蛋白L3和L4突變；③甲基轉(zhuǎn)移酶(由cfr基因編碼)介導(dǎo)的耐藥;④ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette transporter，ABC,由optrA基因編碼)介導(dǎo)的耐藥[10]。

圖2 Sma I酶切頭狀葡萄球菌基因組脈沖場(chǎng)凝膠電泳

表2 頭狀葡萄球菌QD40株的染色質(zhì)和攜帶質(zhì)粒的生物信息分析

本研究中，9株頭狀葡萄球菌經(jīng)PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物測(cè)序顯示都攜帶cfr基因，而且高通量測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證在頭狀葡萄球菌QD40中，該基因位于大小為39 504bp的質(zhì)粒pQD40-3上，而且該質(zhì)粒同時(shí)攜帶aac(6′)-aph(2″)基因。另外，在頭狀葡萄球菌QD40中，染色質(zhì)QD40-chr上攜帶了erm(A)、 aac(6′)-aph(2″)、 aadD、ant(9)-Ia和mecA耐藥基因，而質(zhì)粒pQD40-1和pQD40-2分別攜帶qacA基因和blaZ基因。此外，這些菌株的藥敏實(shí)驗(yàn)顯示頭孢西丁篩選實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，并對(duì)青霉素、苯唑西林、大環(huán)內(nèi)酯類和喹諾酮類耐藥。以上結(jié)果表明，這9株頭狀葡萄球菌的耐藥表型與基因型相一致，即菌株呈現(xiàn)的多重耐藥表型與其攜帶的耐藥基因相符合。

來(lái)自牛體內(nèi)的松鼠葡萄球菌分離株攜帶的cfr基因是2000年由Schwarz首先報(bào)道[11]。而位于腸球菌屬質(zhì)粒上的optrA基因最初是Wang等[7]于2015年報(bào)道。由于cfr基因和optrA基因常常位于質(zhì)粒上，使病原菌容易獲得性耐藥，并導(dǎo)致醫(yī)院感染的流行或暴發(fā)[10]。依據(jù)Tenover規(guī)則[9]，本研究的9株頭狀葡萄球菌有相同的PFGE圖，提示這些菌屬于相同的基因型，是相同的菌株(Indistinguishable)，即暴發(fā)菌株，這表明在ICU患者之間存在相同克隆的暴發(fā)流行。此外，不同種的葡萄球菌也可對(duì)利奈唑胺耐藥，也可引起醫(yī)院感染暴發(fā)。如，García報(bào)道了由利奈唑胺耐藥的金黃色葡萄球菌引起的ICU患者之間的醫(yī)院感染暴發(fā)流行[12]，而Kelly則報(bào)道由利奈唑胺耐藥的表皮葡萄球菌在ICU導(dǎo)致的克隆暴發(fā)[13]。因此，質(zhì)粒攜帶cfr基因的葡萄球菌容易在住院患者之間傳播，引起醫(yī)院感染暴發(fā)流行，這應(yīng)引起臨床重視。

有研究表明，細(xì)菌對(duì)利奈唑胺耐藥與長(zhǎng)期使用該藥引發(fā)選擇性壓力下的耐藥有關(guān)[10]。通過回顧性分析9株頭狀葡萄球菌分離株來(lái)源患者的臨床資料，發(fā)現(xiàn)這些患者都曾經(jīng)接受利奈唑胺的抗感染治療。與我們研究相同的是，Yang于2013年報(bào)道[14]在兩所醫(yī)院出現(xiàn)攜帶cfr基因的對(duì)利奈唑胺耐藥凝固酶陰性葡萄球菌，也是因?yàn)檫@些患者接受了利奈唑胺的治療。同樣，楊洋于2017年也報(bào)道2例患者在使用利奈唑胺治療2 周期間出現(xiàn)了頭狀葡萄球菌耐藥株[15]。因此，臨床在使用利奈唑胺治療時(shí)，需要謹(jǐn)慎延長(zhǎng)治療時(shí)間并要?jiǎng)討B(tài)監(jiān)測(cè)菌株的耐藥性。

optrA基因編碼的ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可介導(dǎo)噁唑烷酮類耐藥或MIC升高[7，10]。有研究顯示，optrA基因可以在腸球菌屬之間傳遞，甚至在體外實(shí)驗(yàn)中可以傳遞到金黃色葡萄球菌，但是，關(guān)于葡萄球菌臨床株攜帶oprtA基因的報(bào)道非常少。在本研究中，也未發(fā)現(xiàn)這9株頭狀葡萄球菌攜帶optrA基因。

總之，攜帶cfr基因的頭狀葡萄球菌容易引起醫(yī)院感染的暴發(fā)流行，在臨床抗感染治療時(shí)尤其要注意利奈唑胺使用的療程，并要?jiǎng)討B(tài)監(jiān)測(cè)耐藥性的發(fā)展。