賈明月，李 麗，張 馨，劉杜鵑，霍世會(huì)

(1.吉林省人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春130021；2.吉林市化工醫(yī)院 燒傷整形科)

酒文化已然成為人們?cè)谏鐣?huì)交際活動(dòng)中必不可少的一項(xiàng)文化，而因長(zhǎng)期大量飲酒、酗酒、嗜酒所引發(fā)的酒精中毒性疾病也在逐年升高，威脅人們的生命健康及生活質(zhì)量。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，在我國(guó)酒精濫用現(xiàn)象亦呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，酒精中毒的患病率為31.7%，并呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)[1]。本研究通過制備大鼠酒精中毒模型，探討酒精中毒后導(dǎo)致線粒體膜通透性改變的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1動(dòng)物模型制備及分組 成年雄性Wistar大鼠60只，每籠5只分籠飼養(yǎng) ，在穩(wěn)定室溫及濕度條件下，用平衡飼料(吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心提供)喂養(yǎng)，自然飲水；參照賈明月等[2]大鼠酒精中毒模型制備方法，雄性 Wistar大鼠正常喂養(yǎng)1 w后開始造模。酒精中毒組(40只)： 每日每只大鼠分別按 8 ml/kg灌胃2 w，隨后再按照 10 ml/kg灌胃 1 w，按 12 ml/kg灌胃 1 w，共灌胃 4 w。每日灌胃兩次，其間隔均為 6 h。酒精濃度為 50%，是以無水乙醇加等量蒸餾水配置而成。鹽水對(duì)照組(20只)：同時(shí)用等量的生理鹽水進(jìn)行灌胃。

1.1.2腦組織提取 4 w后2組大鼠取腦組織，勻漿后將細(xì)胞懸液移至離心管內(nèi)加入10%DMEM培養(yǎng)基至8 ml，以1 000 rpm離心5 min。棄上清，重懸細(xì)胞后，接種于50 ml塑料培養(yǎng)瓶中，并置于5%CO2、90%濕度、37℃培養(yǎng)箱中培育。2-3天更換10%DMEM培養(yǎng)基一次，2-3次換液。

1.2 方法

1.2.1一般情況 每周測(cè)定大鼠體重變化情況，觀察其毛發(fā)、進(jìn)食量、排尿量、排便量等一般營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)，并觀察是否合并有腦血管意外等神經(jīng)系統(tǒng)損傷的表現(xiàn)，如：偏癱、抽搐發(fā)作等。

1.2.2活性氧(ROS)水平變化檢測(cè) 應(yīng)用熒光試劑DCFH-DA在流式細(xì)胞儀下檢測(cè)ROS生成的相對(duì)量。在流式細(xì)胞儀下，將兩組細(xì)胞按照1×105個(gè)/ml接種于6孔板，每組加入等量DMEM 稀釋的DCFH-DA，其終濃度為 20 nM。在培養(yǎng)箱中孵育30 min，選擇激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm、接收波長(zhǎng)為530 nm，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組熒光強(qiáng)度，獲得ROS生成量。

1.2.3超氧化物歧化酶(SOD)活性變化檢測(cè) 應(yīng)用WST-1的顯色反應(yīng)在分光光度儀下通過比色來檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)SOD活性。按照說明書配制SOD活性測(cè)定儲(chǔ)液，分別將酒精組及對(duì)照組管內(nèi)加入試劑一(雙蒸水)1.0 ml，分別在酒精組管內(nèi)加入上清液0.2 ml，對(duì)照管加入等量蒸餾水；于酒精組管及對(duì)照組管內(nèi)加入試劑二(酶工作液)、試劑三(酶稀釋液)、試劑四(底物應(yīng)用液)各0.1 ml，漩渦混勻器充分混勻，置于37℃恒溫水浴中50 min，后各管待測(cè)樣品均加入2 ml顯色劑；充分混勻，室溫靜置10 min，于波長(zhǎng)550 nm，光徑1 cm測(cè)定各管OD值，按照公式計(jì)算SOD活性。

1.2.4丙二醛(MDA)含量變化檢測(cè) 應(yīng)用TBA的顯色反應(yīng)在分光光度儀下通過比色來檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MDA含量。按照說明書配制MDA含量測(cè)定儲(chǔ)液，將0.2 ml的10 nmol/ml標(biāo)準(zhǔn)品、無水乙醇、上清液加入測(cè)定管和標(biāo)準(zhǔn)管，在測(cè)定管、對(duì)照管分別加入試劑一(酶標(biāo)工作液)、試劑二(底物顯色液)分別為0.2 ml、3 ml；在各管中加入試劑三(終止液)1 ml，測(cè)定空白管中加入50%冰醋酸1 ml；漩渦混勻，封緊試管口，95℃恒溫水浴40 min，后取出，冷卻。以4 000 rpm離心10 min，提取上清于波長(zhǎng)532 nm，光徑1 cm處測(cè)定OD值。按照公式計(jì)算MDA含量。

1.2.5ATP含量變化測(cè)定 在分光光度儀下通過比色反應(yīng)來檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ATP含量變化。將空白管、標(biāo)準(zhǔn)管各加入1 mmol/L標(biāo)準(zhǔn)液，測(cè)定管及對(duì)照管中分別加入樣本30 μl；在上述各管中加入試劑一(底物液Ⅰ)100 μl、試劑二(底物液Ⅱ)200 μl；在標(biāo)準(zhǔn)管、測(cè)定管中各加入試劑三(促進(jìn)劑)30 μl，在空白管、對(duì)照管中各加入雙蒸水30 μl?；靹蚝笾糜?7℃恒溫水浴30 min，將試劑四(沉淀劑)各50 μl加入各管，混勻，4 000 rpm離心5 min；將試劑五(顯色液)500 μl加入各管中取上清液300 μl，混勻后室溫靜置2 min后，上述各組加入試劑六(終止劑)各500 μl，混勻，室溫靜置5 min，在636 nm處0.5 cm光徑，雙蒸水調(diào)零，測(cè)定各管OD值。按照公式計(jì)算ATP含量。

1.2.6線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)通透性變化檢測(cè) 鈣黃綠素-AM是可進(jìn)入線粒體膜內(nèi)的熒光探針，鈣黃綠素易被線粒體俘獲，在一定條件激發(fā)下呈綠色熒光，一旦線粒體膜通道孔瞬時(shí)開放，鈣黃綠素釋放，可被胞漿中鈷離子淬滅，而綠色熒光減弱或消失，通過熒光標(biāo)記MPTP的方式標(biāo)記線粒體膜通透性開放情況。將酒精組細(xì)胞按照5×104個(gè)/ml接種于24孔板，每孔1.5 ml。分別處理2組細(xì)胞，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，沿著孔壁加入10 μl 37℃預(yù)熱的Reagent A到各組細(xì)胞培養(yǎng)孔，棄去清理液；沿著孔壁加入100 μl GENMED 染色工作液到各組細(xì)胞培養(yǎng)孔，置于 37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育20 min；棄去GENMED染色工作液，沿著孔壁加入500 μl 37℃預(yù)熱的Reagent A到細(xì)胞培養(yǎng)孔。分別在激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，散發(fā)波長(zhǎng)505 nm倒置熒光顯微鏡下觀察、攝片。

2 結(jié)果

2.1 一般情況兩組共60只 Wistar雄性大鼠經(jīng)4 w灌胃造模后，存活56只。其中酒精組40只大鼠經(jīng)4 w不同梯度酒精灌胃后存活38只，死亡率為 20%，無操作不當(dāng)導(dǎo)致死亡。對(duì)照組20只大鼠經(jīng)4w鹽水灌胃后，存活18只，2只因?yàn)椴僮鞑划?dāng)而導(dǎo)致死亡。實(shí)驗(yàn)組大鼠由于酒精刺激作用，并于 1 w后出現(xiàn)毛發(fā)雜亂無光澤、干枯，進(jìn)食量逐漸減少等情況。3 w后實(shí)驗(yàn)組大鼠出現(xiàn) 脫毛、倦怠、消瘦、營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)差，部分出現(xiàn)了腦血管意外等神經(jīng)系統(tǒng)損傷的表現(xiàn)，如：偏側(cè)肢體癱瘓、抽搐發(fā)作等。4 w后，兩組大鼠的體重(g)存在明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異(P<0.01)；對(duì)照組大鼠對(duì)于灌胃操作無明顯不適，體重正常增長(zhǎng)(見表1)。

表1 兩組大鼠體重(g)變化比較

2.2 大鼠慢性酒精中毒后對(duì)SOD酶活性、MDA生成量、ATP含量及ROS生成量的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，酒精組SOD活性明顯降低，MDA的生成量明顯增加，ATP含量明顯降低，ROS的生成量明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2。ROS含量流式測(cè)定分析結(jié)果見圖1。

表2 兩組SOD、MDA、ATP、ROS含量變化

圖1 ROS含量流式測(cè)定分析(A:對(duì)照組； B:酒精組)

2.3 大鼠慢性酒精中毒對(duì)線粒體膜通透性影響

在倒置熒光相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：對(duì)照組細(xì)胞可見細(xì)胞形態(tài)較好，顯示綠色熒光較亮，而酒精組熒光強(qiáng)度明顯減弱，考慮為MPTP開放后大量鈣黃綠素外流被鈷離子淬滅所致，提示MPTP通透性增大，酒精中毒損傷了細(xì)胞線粒體的膜通道穩(wěn)定性。見圖2。

圖2 MPTP熒光顯微鏡下攝片(×200)

3 討論

研究證實(shí)慢性酒精中毒可導(dǎo)致大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，出現(xiàn)相對(duì)應(yīng)部位神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的發(fā)生，啟動(dòng)神經(jīng)元凋亡啟動(dòng)子，誘導(dǎo)病理性凋亡途徑的過度發(fā)生、發(fā)展[2]。另外，有研究通過活體取腦測(cè)定慢性酒精中毒后大鼠腦組織Ca2+的含量明顯增高，與鈣神經(jīng)素(CaN)的表達(dá)增多共同證實(shí)慢性酒精中毒后存在Ca2+異常轉(zhuǎn)運(yùn)，并出現(xiàn)鈣超載，與CaN異常表達(dá)共同作用，介導(dǎo)慢性酒精中毒性腦病的發(fā)生。由此證實(shí)了慢性酒精中毒可導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)損害、離子代謝紊亂、鈣超載等改變[3]。而線粒體的氧化磷酸化過程是細(xì)胞高效產(chǎn)能過程，在此期間，伴隨大量ROS 的釋放，過量的ROS會(huì)引起線粒體損傷,釋放促凋亡因子,引起細(xì)胞死亡[4]。

在生理?xiàng)l件下，線粒體MPTP直徑約為0.2-0.3 μm，僅允許小分子量的溶質(zhì)通過。在Ca2+、磷酸、ADP和ATP等作用下，MPTP呈現(xiàn)開關(guān)交替的狀態(tài)，可能起著調(diào)節(jié)線粒體和胞漿之間物質(zhì)流動(dòng)的作用[5-6]。但在病理?xiàng)l件如氧化劑、ANT配體、Bax、Ca2+等物質(zhì)誘導(dǎo)下，以ANT-VDAC-CyP-D為核心[4]的MPTP孔徑明顯增大，達(dá)到1.8-2.6 μm，MPTP大量開放，而且呈持續(xù)狀態(tài)，從而造成線粒體內(nèi)分子量低于1.5 kD的溶質(zhì)通過MPTP流入胞漿，引起線粒體腫脹、內(nèi)膜電位喪失[7]、壞死。

本次研究發(fā)現(xiàn)的線粒體損傷途徑靶點(diǎn)，線粒體在以ANT-VDAC-CyP-D為核心的MPTP調(diào)控下，完成生物膜功能及離子等小分子轉(zhuǎn)運(yùn)。本研究發(fā)現(xiàn)在病理性刺激作用時(shí)，比如酒精中毒的長(zhǎng)期、慢性刺激，使得細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量氧自由基，而抗氧化劑物質(zhì)用于清除氧自由基時(shí)被大量消耗，使得機(jī)體穩(wěn)態(tài)失衡，導(dǎo)致MPTP異常開放，線粒體發(fā)生代謝障礙。本研究發(fā)現(xiàn)酒精組ROS生成量明顯高于對(duì)照組，推測(cè)ROS的過度生成是導(dǎo)致MPTP異常開放的誘因。并且發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生的自由基也可使線粒體內(nèi)的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生MDA與膜蛋白的游離氨基酸或磷脂分子縮合生成無生物活性的大分子產(chǎn)物，使膜流動(dòng)性進(jìn)一步下降，通透性增加，惡性循環(huán)，導(dǎo)致線粒體腫脹、功能障礙。本研究中亦發(fā)現(xiàn)酒精組的SOD產(chǎn)生較對(duì)照組明顯減少，而酒精組的MDA含量明顯較對(duì)照組增多，驗(yàn)證慢性酒精中毒后線粒體內(nèi)MPTP的改變與SOD、MDA、ROS含量變化的重要關(guān)系，說明線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)通道的改變是慢性酒精中毒后中樞神經(jīng)細(xì)胞損傷機(jī)制和途徑。