王 磊,賈劍超,宋雙龍,戚曉輝,胡向赟,王 石

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010110；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院 a.臨床醫(yī)學(xué)研究中心;b.肝膽胰脾外科，內(nèi)蒙古 呼和浩特010110)

肝門部膽管癌(HCC)是最常見的膽道惡性腫瘤[1]。由于HCC解剖位置特殊導(dǎo)致手術(shù)難度較高且患者術(shù)后5年生存率僅為30%-40%[2]。波形蛋白(Vimentin，VIM)屬于Ⅲ型中間絲(IF)蛋白的一種類型[3]。最初觀察到VIM主要在增殖細(xì)胞和未分化細(xì)胞中表達(dá)，目前許多研究共同表明VIM在肺癌、乳腺癌、前列腺癌及胃癌的發(fā)生及發(fā)展過程中有重要的作用[4]。干擾短RNA(siRNA)的特異性及穩(wěn)定性較好，目前被廣泛應(yīng)用于沉默特定靶基因表達(dá)的相關(guān)實驗中[5]。本實驗擬構(gòu)建可抑制Vimentin基因表達(dá)的作用于不同位點的3種siRNA，并通過脂質(zhì)體法將siRNA分別瞬時轉(zhuǎn)染進(jìn)入QBC939細(xì)胞，從而對抑制細(xì)胞內(nèi)VIM基因的表達(dá)，為后續(xù)進(jìn)一步研究VIM的生物學(xué)特性及探討對腫瘤增殖、侵襲、遷移及凋亡的影響奠定了基礎(chǔ)。

1 材料及方法

1.1 實驗材料

1.1.1細(xì)胞 人肝門部膽管癌細(xì)胞QBC939(BFB公司)，已采用短串聯(lián)重復(fù)(STR) DNA檢測并成功鑒定。

1.1.2試劑 胎牛血清及DMEM培養(yǎng)基均為BI公司生產(chǎn);PBS、DMSO及青霉素-鏈霉素雙抗購自碧云天;SiRNA序列(S1序列、S2序列及S3序列)及陰性對照序列由吉瑪基因設(shè)計及合成(表1)；VIM、GAPDH引物序列由生工生物公司設(shè)計及合成；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量試劑盒(TaKaRa)；乙醇及異丙醇(富宇試劑)。

表1 siRNA核酸序列

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

QBC939細(xì)胞株的培養(yǎng)使用含10%胎牛血清及1%青霉素-鏈霉素雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于恒溫培養(yǎng)箱(37℃，5% CO2)中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度在85%左右時對QBC939細(xì)胞進(jìn)行一次傳代，并凍存一定量的細(xì)胞備用。

1.3 轉(zhuǎn)染

將轉(zhuǎn)染3種siRNA及陰性對照序列的四組分別命名為T1組(siVIM-1)、T2組(siVIM-2)、T3組(siVIM-3)及NC組(siCtrl)。首先溶解siRNA，根據(jù)說明書6孔板中siRNA的推薦量100 pmol，siRNA優(yōu)化范圍50-200 pmol，培養(yǎng)基最終體積為2 ml進(jìn)行預(yù)實驗，摸索siRNA的最佳轉(zhuǎn)染濃度為100 pmol。配置Opti-MEM與siRNA的混合物即mix①，配置Opti-MEM與RNAi MAX的混合物即mix②，將mix②加入mix①中并室溫孵育5 min，使用移液槍以300 μl/孔分別加入至6孔板中，6 h后更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 轉(zhuǎn)染后提取總RNA制備cDNA

轉(zhuǎn)染24小時后，根據(jù)實驗情況收集細(xì)胞，向裝有細(xì)胞的離心管內(nèi)加Trizol裂解細(xì)胞，加入氯仿靜置5 min。離心機(jī)設(shè)置為：4℃；13 000 rmp；15 min，離心后取上清，將上清轉(zhuǎn)移至EP管中并加入異丙醇，室溫靜置10 min，離心(4℃；13 000 rmp；10 min)，取出離心管并將上清棄去后加75%乙醇，在4℃，7 500 rmp，離心5 min，棄上清，晾干，測RNA濃度。取1 000 ng RNA,配置40 μl反應(yīng)體系，按照Takara反轉(zhuǎn)錄兩步法進(jìn)行RT-PCR來制備cDNA。

1.5 熒光實時定量PCR檢測QBC939細(xì)胞中VIM的mRNA表達(dá)水平

實驗所需VIM、GAPDH引物序列如下：VIM引物序列正義鏈：5′-TCGTGAATACCAAGACCTGCTCAATG-3′，反義鏈：5′-AATCCTGCTCTCCTCGCCTTCC-3′，堿基數(shù)分別為26、22。GAPDH引物序列正義鏈：5′-CAGATGTGGATCAGCAAG-CAGGAG-3′，反義鏈：5′-GTCAAGAAAGGGTGT-AACGCAACTAAG-3′，堿基數(shù)分別為24、27。PCR的反應(yīng)體系為：TB Green Premix Ex TaqⅡ 12.5 μl；PCR Forward Primer 1 μl；PCR Reverse Primer 1 μl；滅菌水8.5 μl；除此反應(yīng)體系，還需準(zhǔn)備DNA模板2 μl。依次加入DNA模板及上述反應(yīng)體系并混勻。擴(kuò)增條件：95℃，30 min；95℃，5 s，60℃，30 s，40個循環(huán)；95℃，10 min；65℃，5 min；95℃，5 min。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

使用Leica熒光顯微鏡系統(tǒng)觀察到培養(yǎng)皿內(nèi)QBC939細(xì)胞貼壁生長，各細(xì)胞間排列緊密。轉(zhuǎn)染siRNA前后的細(xì)胞生長狀態(tài)如圖1及圖2所示。

2.2 siRNA對QBC939細(xì)胞中VIM的mRNA表達(dá)水平的影響

在使用siRNA對QBC939細(xì)胞干擾48 h后，分別提取實驗組、NC組細(xì)胞中的mRNA,結(jié)果顯示:實驗組VIM的表達(dá)水平較均NC組顯著降低；此外，實驗組中T2組的抑制效果較T1及T3組更明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖3。

圖1 光鏡下(20×)QBC939生長狀態(tài)

圖2 光鏡下(20×)轉(zhuǎn)染siRNA 24 h后QBC939細(xì)胞生長狀態(tài)

圖3 VIM的mRNA表達(dá)量

3 討論

VIM是一種分子量大小為57 kDa蛋白,在哺乳動物中，VIM是表達(dá)最廣泛的IF之一,在人體腦、肺、腎、肝、胰腺、胃腸道等多種細(xì)胞表面表達(dá)[6]。在細(xì)胞水平上，VIM與細(xì)胞分化、黏附、遷移、侵襲及凋亡等多種生物學(xué)特性密切相關(guān)[7]，使癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲及轉(zhuǎn)移能力[3]。在器官水平上，VIM敲除的細(xì)胞功能與傷口愈合能力下降、動脈及血管活動有關(guān)。在機(jī)體水平上，VIM敲除與白內(nèi)障、多動、平衡和(或)協(xié)調(diào)受損、焦慮相關(guān)反應(yīng)增加有關(guān)[4]。

VIM在多種上皮性腫瘤中呈現(xiàn)為過表達(dá)狀態(tài)[8]。VIM可作為胰腺癌、胃癌預(yù)后、結(jié)腸癌及黑色素瘤的潛在生物學(xué)標(biāo)志物[9-11]。本研究前期通過對內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院肝膽胰脾外科收治的60例已行手術(shù)治療的HCC患者的病理切片進(jìn)行免疫組化研究，結(jié)果表明：VIM在癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織[12]。使用RT-PCR及Q-PCR等技術(shù)對人肝門部膽管癌QBC939細(xì)胞及正常的膽管細(xì)胞HiBepic的mRNA表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果表明：QBC939細(xì)胞內(nèi)VIM表達(dá)水高于HiBepic細(xì)胞內(nèi)VIM表達(dá)水平，考慮抑制QBC939中VIM基因的表達(dá)水平可能為HCC的診斷及HCC的治療帶來新的幫助。

RNA干擾(RNA Interference，RNAi)又稱基因沉默(gene silencing)，是在某些疾病中阻止基因表達(dá)的一種生物學(xué)過程[13]。siRNA是RNAi過程中的重要產(chǎn)物[14]，也是一種雙鏈非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)[15]。siRNA被裝載在RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體上用于在基因翻譯以前降解和切割mRNA[16]。siRNA因具有高度的特異性及級聯(lián)放大等特點而被廣泛應(yīng)用于臨床治療及基因組學(xué)相關(guān)實驗的研究。siRNA在臨床給藥中主要應(yīng)用偶聯(lián)介導(dǎo)以保證siRNA的化學(xué)穩(wěn)定性，因為未經(jīng)修飾的siRNA會被腎臟過濾快速降解并從循環(huán)中清除，導(dǎo)致組織中的生物利用度極低[17]。siRNA以各種細(xì)胞類型中的致病基因為靶點，在不破壞內(nèi)源性miRNA的情況下實現(xiàn)對目的基因的沉默。siRNA具有高度序列特異性及治療靶點上的廣譜性，目前已被廣泛應(yīng)用于基因組學(xué)相關(guān)實驗[18]。

siRNA的臨床治療及基因組學(xué)的實驗應(yīng)用中同時也受到siRNA本身固有的理化特性的嚴(yán)重阻礙，例如低電荷密度、高結(jié)構(gòu)剛度和快速酶降解。且部分基因mRNA靶序列常包埋在RNA分子的二級結(jié)構(gòu)及高度折疊的區(qū)域中，且siRNA無法接近并識別靶序列，因此無法切割mRNA。此外，當(dāng)靶基因發(fā)生基因突變時而產(chǎn)生新的siRNA時，也會影響siRNA抑制靶基因的效率。因此常規(guī)的siRNA中，可發(fā)揮沉默效應(yīng)的siRNA僅有60%-70%[19]。建立高效、穩(wěn)定的siRNA既是將其用于基因組學(xué)相關(guān)實驗的必要前提，又是用于臨床治療的堅實基礎(chǔ)，本實驗在設(shè)計與合成siRNA時應(yīng)注意RNA內(nèi)的修飾位置與修飾的化學(xué)類型，以防止siRNA沉默效應(yīng)受到干擾及脫靶效應(yīng)的發(fā)生[20]。因此本實驗根據(jù)前期VIM在肝門部膽管癌細(xì)胞株QBC939中表達(dá)較高的研究基礎(chǔ)，設(shè)計并合成三條VIM-siRNA序列及一條陰性對照序列，分別命名為S1、S2、S3及siRNA陰性對照序列，將三條序列及陰性對照序列分別用脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染進(jìn)入QBC939細(xì)胞中，根據(jù)RT-PCR及Western-Blot實驗結(jié)果可知：3組siRNA均已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)且成功抑制QBC939細(xì)胞內(nèi)VIM的表達(dá)。但是三條VIM-siRNA序列沉默效果不一，S2的沉默效果較S1及S3好，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。再次表明此類實驗僅設(shè)計合成單條VIM-siRNA可能存在一定的局限性。后續(xù)本團(tuán)隊將繼續(xù)探討并研究抑制VIM對QBC939細(xì)胞株增殖、侵襲及遷移中的影響及在成瘤裸鼠體內(nèi)中的作用，從體內(nèi)及體外等實驗綜合研究VIM與QBC939細(xì)胞的生物學(xué)行為間關(guān)系。

致謝：本文作者感謝內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心提供的實驗平臺及臨床醫(yī)學(xué)研究中心王敏老師在相關(guān)實驗操作上的指導(dǎo)。