李 杉，林 丹，張 潔，曾海生，馬秀梅

(1 廣西壯族自治區(qū)食品藥品審評查驗中心，廣西 南寧 530029；2 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西 百色 533000)

桂枝(Rimuluscinnamon)為樟科植物肉桂(CinnamonumcassiaPresl.)的干燥嫩枝，是臨床上常用的解表藥之一，主產(chǎn)于廣西、廣東等地[1]。桂枝味辛、甘，性溫，具有散寒解表、溫通經(jīng)脈的功效，主含揮發(fā)油類、有機酸類、黃酮類等成分[2-3]。常用于風(fēng)寒感冒、脘腹冷痛等疾病，具有緩和腸胃刺激、改善微循環(huán)等作用[4]。本研究以總黃酮含量為提取指標，采用單因素試驗考察提取方法、提取溶劑、提取體積、提取時間對總黃酮提取的影響，再采用正交試驗進一步優(yōu)選最佳提取工藝，為進一步研究桂枝的質(zhì)量標準提供一定的參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

島津UV1780型紫外-可見分光光度計；十萬分之一天平(XS105D),梅特勒-托利多稱重設(shè)備系統(tǒng)有限公司。

1.2 試 藥

蘆丁(批號：195128)，純度>98%，購于上海融禾醫(yī)藥科技有限公司；其余實驗所用試劑均為分析純。桂枝購買于廣西百色濟民藥店，桂枝經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥學(xué)部曾海生副主任藥師鑒定為樟科植物肉桂CinnamomumcassiaPresl的干燥嫩枝。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取蘆丁對照品適量，加75%乙醇溶解，定容至 25 mL容量瓶中，搖勻，制成濃度為0.43 mg/mL的對照品溶液。

2.2 供試品溶液制備

取桂枝藥材粉末精密稱定1.0 g，置提取容器中，加體積分數(shù)75%的乙醇25 mL稱定重量，回流提取1.0 h，再稱定重量，用75%乙醇補足減失的重量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液2.0 mL置50 mL量瓶中，照標準曲線制備項下的方法，依法測定吸光度，再用回歸方程求出供試品溶液中總黃酮的含量(mg/g)，即得。

2.3 線性方程的制定

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗

精密稱取桂枝藥材粉末約1.0 g，按“2.2”項下操作步驟制備供試品，按“2.3”項下的方法顯色測定。于512 nm波長處連續(xù)6次測定其吸光度，結(jié)果RSD為1.42%，小于3.0%，該方法精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗

精密稱取桂枝藥材粉末約1.0 g，按“2.2”項下操作步驟制備供試品，按“2.3”項下的方法顯色測定，測定同一供試液在不同時間下的吸光度，于512 nm波長處分別在0 min， 10 min，20 min，40 min，60 min，90 min，120 min測定吸光度，計算藥材吸光度的RSD值為2.16%，小于3.0%，結(jié)果表明，吸光度值在120 min內(nèi)基本不變?？梢姌悠吩?20 min內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗

精密稱取桂枝藥材粉末樣品6份，每份藥材粉末約1.0 g，按“2.2”項下操作步驟制備供試品，按“2.3”項下的方法顯色測定。于512 nm波長處平行測定其吸光度，計算桂枝藥材的平均含量為26.35 mg/g；RSD值為2.68%，小于3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4 加樣回收率試驗

精密稱取同一批次已知總黃酮含量的桂枝藥材粉末0.5 g，精密稱定，共9份，分成3組，即低、中、高三組(分別為0.5 g藥材總黃酮含量的80%、100%和120%加樣)，按“2.2”項下操作步驟制備供試品，按“2.3”項下的方法顯色測定。于512 nm波長處平行測定吸光度，計算總黃酮的含量。桂枝低、中、高加樣組總黃酮的平均回收率分別為100.06%、98.97%、100.24%，其RSD值分別為2.41%、2.10%、1.29%(n=3)，表明該方法準確性良好。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率實驗(n=9)Table 1 Sample recovery experiment(n=9)

續(xù)表1

2.5 單因素考察

2.5.1 提取方法考察

取桂枝藥材粉末約1.0 g，精密稱定，置錐形瓶中，提取時間1 h、25 mL、75%乙醇為提取條件，分別采用浸漬法、超聲法和回流法對藥材總黃酮提取，按“2.2”項下操作步驟制備供試品，按“2.3”項下的方法顯色測定，結(jié)果顯示，回流法的提取率最高，故而選擇回流提取。見圖1。

圖1 提取方法考察結(jié)果Fig.1 Results of the investigation of extraction methods

2.5.2 乙醇溶劑濃度考察

取藥材粉末約1.0 g，精密稱定，置錐形瓶中，提取時間 1 h、25 mL不同濃度的乙醇溶劑為提取條件，采用回流提取法，以乙醇溶劑不同濃度對藥材總黃酮得率做單因素試驗，設(shè)計乙醇濃度都為35%、55%、75%、85%和95%，按“2.2”項下操作步驟制備供試品，按“2.3”項下的方法顯色測定，結(jié)果顯示，75%乙醇回流提取桂枝藥材總黃酮的提取率最高。見 圖2。

圖2 乙醇濃度考察結(jié)果Fig.2 Investigation results of ethanol concentration

2.5.3 提取時間考察

取藥材粉末約1.0 g，精密稱定，置錐形瓶中，以75%乙醇25 mL為提取條件，采用回流提取法，以提取時間對藥材總黃酮得率做單因素試驗，設(shè)提取時間為20 min，40 min， 60 min，80 min，100 min，按“2.2”項下操作步驟制備供試品，按“2.3”項下的方法顯色測定，結(jié)果顯示提取時間為 60 min的提取率較高,見圖3。

圖3 取時間考察結(jié)果Fig.3 Time-based inspection results

2.5.4 提取體積考察

取藥材粉末約1.0 g，精密稱定，置提取容器中，提取時間60 min、75%乙醇為提取條件，采用回流法，以不同體積的70%乙醇對藥材總黃酮得率做單因素試驗，設(shè)75%乙醇體積分別為20 mL、30 mL、40 mL、50 mL、60 mL，按“2.2”項下操作步驟制備供試品，按“2.3”項下的顯色方法測定，結(jié)果：提取體積40 mL的提取率最高。見圖4。

圖4 提取體積考察結(jié)果Fig.4 Investigation results of extraction volume

2.6 正交實驗設(shè)計[5]

根據(jù)單因素考察結(jié)果分析，設(shè)置乙醇濃度為55%乙醇、75%乙醇、95%乙醇，料液比為1:30、1:40、1:50，提取時間為40 min、60 min、80 min。根據(jù)正交設(shè)計軟件，選用 L9(34)正交實驗設(shè)計，見表2。

表2 L9(34)正交試驗因素水平表Table 2 L9(34)orthogonal test factor level table

2.7 正交實驗與結(jié)果分析

乙醇濃度和料液比都具有顯著性，而提取時間無顯著性，且各影響因素的強弱：乙醇濃度(A)>料液比(B)>提取時間(C)，考慮實驗效率、時間及成本，故而選擇提取時間為 60 min，因此本實驗最理想的提取方案是A2B2C2，即乙醇濃度是75%，料液比是1:40，回流提取時間是60 min，此提取效果最佳。

表3 L9(34)正交實驗表Table 3 L9(34)orthogonal experiment table

表4 正交實驗方差分析Table 4 Analysis of variance of orthogonal experiment

3 樣品含量測定

精密稱取桂枝藥材粉末6份，每份約1.0 g，置提取容器中，按“2.2”項下操作步驟制備供試品，按“2.3”項下的方法顯色測定其總黃酮的含量，結(jié)果見表5。

表5 桂枝總黃酮含量測定結(jié)果Table 5 Determination results of total flavonoids in Rimulus cinnamon

4 結(jié) 論

本實驗以桂枝藥材為研究對象，考察乙醇濃度、提取體積和提取時間三個影響因素，采用回流法提取桂枝總黃酮，利用正交實驗的方法優(yōu)選桂枝總黃酮的最佳提取工藝。根據(jù)相關(guān)文獻，確定桂枝總黃酮提取工藝的主要因素是溶劑濃度、提取體積和提取時間等，根據(jù)影響因素的考察，本實驗采用L9(34)正交實驗，結(jié)果表明桂枝總黃酮的最佳提取工藝，即回流提取，乙醇濃度75%，料液比1:40，提取時間是60 min，此提取效果最佳。

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過正交試驗，建立了桂枝總黃酮提取率的工藝優(yōu)化。方差分析具有顯著性，方程對試驗較好，各因子對總黃酮提取率影響大小依次為乙醇濃度A(%)>料液比B(g/mL)>提取時間C(min)。