何曉燕 張強(qiáng)弩 宰國(guó)真 楊柳 王桂芝

肝癌是全球發(fā)病率第六位的惡性腫瘤，同時(shí)也是全球第四位的癌癥致死病因[1]。原發(fā)性肝癌的85%～95%是肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，由于起病隱匿加之早期診斷措施不夠完善，HCC中晚期患者的死亡率高達(dá)80%，中位生存期不足1年、5年生存率不足20%[2]。因此，有必要進(jìn)一步探索HCC的分子機(jī)制，找到與HCC相關(guān)的關(guān)鍵分子，從而助力于HCC早期診斷、治療靶點(diǎn)的確定、患者的個(gè)體化治療及預(yù)后判斷。

RNA結(jié)合蛋白(RNA-binding proteins，RBP)是參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控事件的重要蛋白，憑借多變的RNA-binding區(qū)域和靈活的結(jié)構(gòu)，RBP以動(dòng)態(tài)的形式控制了很多RNA的代謝行為，包括RNA的剪接、定位、轉(zhuǎn)運(yùn)及穩(wěn)定性維持[3-4]。目前，已經(jīng)明確RBP可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等作用參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究已經(jīng)證實(shí)，癌組織和癌旁組織中存在一些RBP的表達(dá)差異，并且這種差異表達(dá)與患者的預(yù)后及臨床特征相關(guān)，這些證據(jù)提示RBP可能作為腫瘤治療的重要靶點(diǎn)[5]。切割刺激因子(cleavage stimulation factor 2，CSTF2)是RBP的一種，它可以結(jié)合靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)(3’-UTR)內(nèi)的富含GU的元件，對(duì)3’-UTR進(jìn)行修剪，從而使靶基因的表達(dá)和活性出現(xiàn)變化[6]。但是在HCC中，CSTF2的作用還不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)CSTF2在HCC中呈現(xiàn)高表達(dá)，高表達(dá)的CSTF2預(yù)示著患者的不良預(yù)后。在體外細(xì)胞試驗(yàn)中，筆者對(duì)CSTF2的功能進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)CSTF2在體外具有促癌作用。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)CSTF2與微小染色體維持蛋白6(minichromosome maintenance complex component 6，MCM6)具有表達(dá)上的相關(guān)性，因此在分子機(jī)制方面筆者假設(shè)HCC中CSTF2可能通過(guò)調(diào)控MCM6發(fā)揮作用。體外細(xì)胞試驗(yàn)表明，CSTF2確實(shí)可以增加MCM6表達(dá)，并通過(guò)MCM6促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。綜上，本研究表明CSTF2具有成為HCC分子治療靶點(diǎn)的潛力。

材料和方法

一、主要試劑

Huh7肝癌細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院；胰酶及胎牛血清購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司； Hifair?Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis反轉(zhuǎn)錄試劑盒及Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自上海翊圣生物公司；Lipofectamine 2000及 Lipofectamine RNAiMax購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；CCK-8細(xì)胞活力試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒RIPA裂解液和ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。引物由廣州金唯智公司提供，siRNA-MCM6購(gòu)自由廣州銳博生物公司；siRNA陰性對(duì)照購(gòu)自美國(guó)Qiagen公司。

二、公共數(shù)據(jù)收集

9個(gè)不同中心的HCC隊(duì)列mRNA微芯片數(shù)據(jù)(GSE14520, GSE22058, GSE25097, GSE36376, GSE45436, GSE64041, GSE76427, GSE54236及GSE63898)集通過(guò)Gene Expression Omnibus數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)檢索并下載。2個(gè)中心的HCC隊(duì)列RNA測(cè)序數(shù)據(jù)(TCGA-LIHC及ICGC-LIRI-JP)通過(guò)Integrative Molecular Database of Hepatocellular Carcinoma(HCCDB，http://47.95.203.196/database/hccdb/home.html)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索并下載。各隊(duì)列癌組織和癌周組織的mRNA表達(dá)差異使用R軟件及Limma程序包進(jìn)行分析。

三、臨床樣本和免疫組織化學(xué)染色

收集20例在接受治療并進(jìn)行手術(shù)切除的HCC癌組織和對(duì)應(yīng)癌周組織的石蠟包埋組織樣本。所有病例均經(jīng)過(guò)病理學(xué)確診，其中男性患者15例，女性患者5例。包埋組織切片后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，一抗使用兔抗人多克隆CSTF2抗體(1∶150)，二抗使用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔lgG抗體。辣根過(guò)氧化物酶顯色試劑盒進(jìn)行顯示處理后，評(píng)估癌組織和癌周組織的CSTF2陽(yáng)性率。

四、細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞轉(zhuǎn)染

肝細(xì)胞癌Huh7細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱。培養(yǎng)基采用含10%胎牛血清及1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基。取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。CSTF2的上調(diào)采用體外轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-CSTF2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的方式實(shí)現(xiàn)，同時(shí)采用pcDNA3.1空質(zhì)粒作為陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照。MCM6的下調(diào)采用轉(zhuǎn)染siRNA-MCM6的方式實(shí)現(xiàn)，采用All star?無(wú)關(guān)序列作為陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染采用Lipofectamine 2000試劑，同時(shí)siRNA的轉(zhuǎn)染采用Lipofectamine RNAiMax試劑。

五、CCK-8細(xì)胞活力試驗(yàn)

將轉(zhuǎn)染好的細(xì)胞按照每孔3 000個(gè)的密度種植于96孔板后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后(設(shè)定為0 h點(diǎn))，使用CCK-8細(xì)胞活力試劑盒檢測(cè)0、24、48及72 h各組細(xì)胞的活力變化。檢測(cè)時(shí)棄去培養(yǎng)孔原有培養(yǎng)基，每孔加入100 μL CCK-8試劑(1∶10)，37 ℃放置 1 h后測(cè)量450 nm處吸光度。按照公式(增殖率=其他時(shí)間點(diǎn)吸光度/0時(shí)間點(diǎn)吸光度)計(jì)算各組細(xì)胞的增殖情況。

六、劃痕試驗(yàn)

將轉(zhuǎn)染好的細(xì)胞按照每孔100 000個(gè)的密度種植于12孔板后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后使用無(wú)菌的移液器吸頭進(jìn)行劃痕，劃痕后立即在倒置顯微鏡下進(jìn)行拍照。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后再次進(jìn)行拍照。Image J軟件(版本號(hào)1.53)計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的劃痕面積，比較各組的細(xì)胞遷移速度。

七、實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析(qRT-PCR)

各組樣本的總RNA樣本通過(guò)TRIzol?試劑進(jìn)行提取。使用Hifair?Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)獲取的總RNA樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以獲取cDNA模板。使用Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix熒光定量PCR試劑盒對(duì)獲取的cDNA進(jìn)行定量擴(kuò)增，內(nèi)參使用GAPDH。興趣基因的相對(duì)表達(dá)水平采用2-△△CT法計(jì)算，其中△CT=CT目標(biāo)-CT內(nèi)參。CSTF2的引物序列為上游：5′-TCACTGCGTT-CCGTGTTCG-3′，下游：5′- CCCTTGGGTTTTC-CCGTCTC-3′。MCM6的引物序列為上游：5′-GA-GGAACTGATTCGTCCTGAGA-3′，下游：5′-CA-AGGCCCGACACAGGTAAG-3′。GAPDH的引物序列為上游：5′- TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3′，下游：5′-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3′。

八、Western blot分析

使用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取各組細(xì)胞樣本的總蛋白。BCA蛋白定量試劑盒對(duì)蛋白樣本定量后與5X上樣緩沖液進(jìn)行混合，使用聚丙烯酰胺凝膠對(duì)對(duì)蛋白樣本進(jìn)行電泳分離，將蛋白印跡轉(zhuǎn)移到醋酸纖維薄膜。5% 脫脂奶粉室溫封閉2 h。兔抗人CSTF2、MCM6及GAPDH (內(nèi)參)多克隆抗體進(jìn)行一抗孵育，過(guò)夜后，PBST洗滌膜3遍，進(jìn)行辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔lgG二抗孵育2 h。ECL化學(xué)發(fā)光色后進(jìn)行條帶檢測(cè)。

九、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、CSTF2在肝癌組織中的表達(dá)特點(diǎn)

筆者首先收集了9個(gè)不同中心HCC隊(duì)列的mRNA微芯片數(shù)據(jù)以及2個(gè)中心HCC隊(duì)列的mRNA測(cè)序數(shù)據(jù)。通過(guò)比較這些數(shù)據(jù)集中癌組織和癌周組織的mRNA表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)在這些隊(duì)列的HCC患者癌組織中CSTF2的mRNA均呈現(xiàn)高表達(dá)(P<0.05)。CSTF2的mRNA在各隊(duì)列中的表達(dá)情況見(jiàn)圖1A。免疫組織化學(xué)提示CSTF2在HCC癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)(圖1B)，其中在癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為75%，在癌周組織中僅為30%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A.CSTF2 mRNA在9個(gè)HCC mRNA芯片數(shù)據(jù)集和2個(gè)測(cè)序數(shù)據(jù)集中的表達(dá)情況；B.免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)CSTF2在HCC患者癌組織和癌周正常組織中的表達(dá)×100

二、CSTF2與肝癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系

接下來(lái)筆者將TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集中的患者以及GSE14520數(shù)據(jù)集中的患者按照CSTF2 mRNA的水平中位值進(jìn)行了分組，并且比較了兩組患者之間的臨床病例特征(表1和表2)。CSTF2表達(dá)水平與HCC患者的腫瘤尺寸、AFP水平、TNM分期、BCLC分期、CLIP分期及侵襲風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)(P<0.05)。在TCGA-LIHC和ICGC-LIRI-JP隊(duì)列中，較高的CSTF2表達(dá)水平(以mRNA水平的中位值為截?cái)嘀?預(yù)示著較差的總體生存率(P<0.05,圖2A-B)。在GSE14520中，可以發(fā)現(xiàn)在早期CSTF2水平似乎與患者生存率無(wú)關(guān)，但是在中晚期，較高CSTF2水平的患者總體生存率較低(圖2C)。在TCGA-LIHC隊(duì)列中較高的CSTF2水平預(yù)示著較低的無(wú)病生存率(圖2D)。

表1 TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集中CSTF2 mRNA水平與患者臨床特征的關(guān)系

表2 GSE14520數(shù)據(jù)集中CSTF2 mRNA水平與患者臨床特征的關(guān)系

三、肝癌細(xì)胞中CSTF2通過(guò)調(diào)控MCM6的表達(dá)發(fā)揮對(duì)HCC細(xì)胞的增殖和遷移促進(jìn)作用

基于HCCDB數(shù)據(jù)庫(kù)的整合，HCC隊(duì)列的共表達(dá)分析提示MCM6與CSTF2存在共表達(dá)關(guān)系(圖3A)。筆者在9個(gè)HCC隊(duì)列的mRNA微芯片數(shù)據(jù)以及2個(gè)中心HCC隊(duì)列的mRNA測(cè)序數(shù)據(jù)中對(duì)CSTF2和MCM6的mRNA表達(dá)情況作了相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除GSE63898外，在其他隊(duì)列的癌組織中CSTF2均與MCM6的表達(dá)存在顯著的正相關(guān)性(圖3B)。

A.TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集中CSTF2 mRNA水平與患者總體生存率的關(guān)系；B.ICGC-LIRI-JP數(shù)據(jù)集中CSTF2 mRNA水平與患者總體生存率的關(guān)系；C.GSE14520數(shù)據(jù)集中CSTF2 mRNA水平與患者總體生存率的關(guān)系；D.TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集中CSTF2 mRNA水平與患者無(wú)病生存率的關(guān)系

A.以CSTF2為核心的的基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)；B.11個(gè)HCC數(shù)據(jù)集中肝癌組織內(nèi)的CSTF2 mRNA水平與MCM6 mRNA水平的相關(guān)性；C.轉(zhuǎn)染CSTF2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的Huh7細(xì)胞中CSTF2及MCM6的mRNA變化；D.轉(zhuǎn)染CSTF2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的Huh7細(xì)胞中CSTF2及MCM6的mRNA變化。*表示與pcDNA3.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，P<0.05

在Huh7細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染表達(dá)pcDNA3.1-CSTF2質(zhì)?？梢杂行岣逤STF2的表達(dá)水平，同時(shí)可以觀察到CSTF2過(guò)表達(dá)后，細(xì)胞MCM6 mRNA和蛋白水平也出現(xiàn)增加(圖3C及圖3D)。過(guò)表達(dá)CSTF2后，筆者發(fā)現(xiàn)Huh7細(xì)胞的增殖加快(圖4A)，同時(shí)轉(zhuǎn)移能力也加強(qiáng)(圖4B)。轉(zhuǎn)染MCM6的siRNA后，可見(jiàn)CSTF2的促增殖和促遷移效果被抵消(圖4A-4B)。siRNA-MCM6效敲減細(xì)胞的MCM6 mRNA及蛋白表達(dá)的效果見(jiàn)圖4C及圖4D。

A.轉(zhuǎn)染CSTF2及siRNA-MCM6后Huh7細(xì)胞的增殖能力變化；B.轉(zhuǎn)染CSTF2及siRNA-MCM6后Huh7細(xì)胞的遷移能力變化；C.siRNA-MCM6轉(zhuǎn)染有效降低Huh7細(xì)胞的MCM6 mRNA水平D.siRNA-MCM6轉(zhuǎn)染有效降低Huh7細(xì)胞的MCM6 蛋白水平。*表示與陰性轉(zhuǎn)染混合物(pcDNA3.1空質(zhì)粒+Allstar陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照)或Allstar陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照的細(xì)胞相比，P<0.05

討 論

RNA結(jié)合蛋白可以結(jié)合促癌基因或抑癌基因的RNA從而調(diào)控這些基因RNA的剪接、定位、轉(zhuǎn)運(yùn)及穩(wěn)定性，從而參與促癌基因和抑癌基因RNA的動(dòng)態(tài)平衡[7]。RNA結(jié)合蛋白的表達(dá)和功能異常會(huì)打破抑癌基因和促癌基因的動(dòng)態(tài)平衡，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。因此，探討RBP與腫瘤發(fā)生的關(guān)系及其分子作用機(jī)制，對(duì)發(fā)現(xiàn)新的腫瘤標(biāo)志物或者潛在的分子治療靶點(diǎn)意義重大。HCC是全球范圍內(nèi)死亡率極高的惡性腫瘤之一，治療效果及預(yù)后極差。既往的一些研究揭示了RBP與HCC的關(guān)系。比如Zhao等[8]發(fā)現(xiàn)了42個(gè)與HCC進(jìn)展相關(guān)的RBP，其中RPS3在肝癌組織中的豐度較高。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，RPS3可以通過(guò)與SIRT1的RNA結(jié)合，從而穩(wěn)定SIRT1的RNA表達(dá)，而SIRT1具有促癌作用。因此通過(guò)這個(gè)機(jī)制RPS3發(fā)揮促進(jìn)HCC的作用。Yang等[9]報(bào)道了另一個(gè)RBP PTBP3在HCC的作用，他們的研究發(fā)現(xiàn)，PTBP3可以調(diào)控NEAT1和pre-miR-612的RNA剪切平衡從而促進(jìn)HCC的增殖和轉(zhuǎn)移。

然而，大多數(shù)RBP在HCC進(jìn)展中的生物學(xué)功能和機(jī)制尚不清楚，更多與HCC有關(guān)的RBP需要被鑒定并進(jìn)行深入研究?；谶@個(gè)需求，筆者在前期工作中收集了9個(gè)不同中心HCC隊(duì)列的mRNA微芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行了秩聚合算法的整合，共涉及病例1 000余例。通過(guò)對(duì)上述大數(shù)據(jù)的整合和挖掘筆者鑒定到了34個(gè)RBP在肝癌組織和癌周組織間存在顯著的表達(dá)差異，其中包括CSTF2。本研究發(fā)現(xiàn)，CSTF2在11個(gè)中心(9個(gè)芯片數(shù)據(jù)集和2個(gè)測(cè)序數(shù)據(jù)集)的HCC數(shù)據(jù)集中都呈現(xiàn)出在肝癌組織中的過(guò)表達(dá)，提示CSTF2在HCC中可能扮演一定的角色。但是目前還沒(méi)有任何研究報(bào)道CSTF2在HCC中的作用和機(jī)制。不過(guò)已經(jīng)有少量證據(jù)提示CSTF2在其他腫瘤中的作用，并且這些證據(jù)都提示CSTF2具有促癌作用，機(jī)制可能為CSTF2對(duì)其靶基因RNA 3’-UTR的結(jié)合剪切作用使得這些基因的3’-UTR縮短，從而使得靶基因的表達(dá)或活性發(fā)生了變化。比如Chen等[10]發(fā)現(xiàn)膀胱癌細(xì)胞中CSTF2可以與RAC1的3’-UTR結(jié)合，從而導(dǎo)致RAC1的3’-UTR區(qū)域縮短，使得RAC1不能和一些microRNA結(jié)合，間接導(dǎo)致RAC1的mRNA水平增加。通過(guò)這個(gè)機(jī)制CSTF2在膀胱癌發(fā)揮促癌作用，同時(shí)高CSTF2和其引起的一些靶基因的3’-UTR區(qū)域縮短可能成為膀胱癌患者的預(yù)后較差的標(biāo)志物。Akman等[11]的研究指出，在乳腺癌中EGF能夠引起CSTF2的上調(diào)，后者可以引起大量增殖相關(guān)靶基因的3’-UTR縮短事件。

本研究首先探討了CSTF2的表達(dá)水平和HCC患者預(yù)后及其他臨床特征的關(guān)系?；诠泊髷?shù)據(jù)的mRNA表達(dá)譜及相關(guān)臨床數(shù)據(jù)，筆者發(fā)現(xiàn)較高的CSTF2 mRNA預(yù)示著較差的HCC患者預(yù)后，且較高CSTF2 mRNA水平的HCC患者出現(xiàn)較大腫瘤尺寸、較高AFP水平、較晚TNM分期及血管侵襲的比例較高。在蛋白水平，筆者通過(guò)免疫組化分析發(fā)現(xiàn)CSTF2的蛋白水平在癌組織中明顯升高，來(lái)自human protein atlas數(shù)據(jù)庫(kù)的免疫組化結(jié)果與筆者的數(shù)據(jù)一致，也提示CSTF2在癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)。這些證據(jù)提示CSTF2在HCC中可能發(fā)揮促癌作用。接著在體外細(xì)胞試驗(yàn)中筆者對(duì)CSTF2的功能進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)CSTF2后，肝癌Huh7細(xì)胞的增殖加快且遷移速度加快，這提示CSTF2在HCC中的確具有促癌作用。接著筆者嘗試找到HCC中受CSTF2調(diào)控的靶基因，通過(guò)基于多個(gè)HCC隊(duì)列的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)MCM6與CSTF2在HCC癌組織中具有較強(qiáng)的相關(guān)性，因此MCM6很可能受CSTF2的調(diào)控。MCM6是參與DNA復(fù)制啟動(dòng)的重要因子，它與其他5個(gè)MCM蛋白家族的成員形成聚合物后可以啟動(dòng)DNA的復(fù)制，從而參與腫瘤細(xì)胞的增殖，較高的MCM6表達(dá)提示增殖活躍。MCM6的促癌作用已經(jīng)在HCC得到了報(bào)道，比如Liu等[12]的研究發(fā)現(xiàn)MCM6可以促進(jìn)HCC細(xì)胞的S/G2比例，從而增加增殖，提示患者的不良預(yù)后。另一項(xiàng)研究則表明，MCM6通過(guò)MEK/ERK通路促進(jìn)HCC的轉(zhuǎn)移[13]。但是MCM6的上游調(diào)控機(jī)制還未見(jiàn)有報(bào)道，MCM6在HCC中增高的原因仍然需要探討。在體外細(xì)胞研究中，筆者發(fā)現(xiàn)在高表達(dá)CSTF2后，MCM6的mRNA和蛋白表達(dá)均出現(xiàn)了上調(diào)，提示CSTF2能夠增加MCM6的表達(dá)。在過(guò)表達(dá)CSTF2的同時(shí)敲減MCM6的表達(dá)，可以觀察到CSTF2的促癌作用減弱了，提示CSTF2的促癌作用部分是通過(guò)MCM6實(shí)現(xiàn)的?；诩韧鶊?bào)道的CSTF2 RNA結(jié)合功能，本研究推測(cè)CSTF2可能是通過(guò)縮短MCM6的3’-UTR，從而導(dǎo)致MCM6不被一些microRNA降解，間接引起MCM6的表達(dá)增高。這一假設(shè)需要在后期研究中進(jìn)行驗(yàn)證。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)CSTF2在HCC的癌組織中存在顯著的過(guò)表達(dá)并預(yù)示著患者的不良預(yù)后；CSTF2可能通過(guò)調(diào)控MCM6的表達(dá)來(lái)發(fā)揮促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖和遷移的作用；CSTF2和MCM6有望成為HCC診斷的分子標(biāo)志物或者治療的分子靶點(diǎn)。