秦旭 侯志云 張松 馬麗 朝浩鵬

研究表明，慢性乙型肝炎后肝硬化及肝癌的發(fā)生與某些基因突變有關[1]。甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)是肝癌診斷中的重要標志物，癌變發(fā)生時癌細胞自身可生成AFP[2]。正五聚蛋白3(pentraxin 3，PTX3)對慢性丙型肝炎患者肝纖維化的發(fā)生起到重要作用[3]。本研究探討慢性乙型肝炎肝硬化患者S基因突變與血清AFP、PTX3表達水平的關系，分析S基因突變對患者的影響，以期為不良預后的早期預測提供參考依據(jù)。

資料與方法

一、一般資料

選取2017年7月至2019年6月于北京市大興區(qū)人民醫(yī)院住院治療的76例慢性乙型肝炎肝硬化患者為研究對象(肝硬化組)，年齡32～68歲；同期選取慢性乙型肝炎患者87例作為對照(肝炎組)，年齡33～70歲。納入標準：①慢性乙型肝炎、慢性乙型肝炎肝硬化的診斷符合相應指南[4,5]；②病例資料齊全者；③經(jīng)本院臨床研究倫理委員會批準，所有研究對象均為自愿參加；④未進行過放療、化療。排除標準：①伴有其他類型病毒性肝炎者；②伴有嚴重腎功能不全者；③進行過肝移植者；④伴有其他血液系統(tǒng)、自身免疫疾病及惡性腫瘤者。查閱門診及住院病歷，收集患者一般資料，包括性別、年齡、體質量指數(shù)(body mass index，BMI)等。

二、主要試劑與儀器

BigDye測序試劑盒購自美國ABI公司；AFP ELISA試劑盒購自上海延慕實業(yè)有限公司；PTX3 ELISA試劑盒購自武漢菲恩生物科技有限公司。全自動生化分析儀購自美國貝克曼庫爾特公司；實時熒光定量PCR儀購自上海普迪生物科技有限公司。

三、研究方法

(一)樣品采集及保存 采集受試者入院第2天晨起空腹靜脈血，3000 r/min離心15 min后收集血清，置于-80℃保存待測。

(二)HBV前S區(qū)基因突變的檢測 采用半套式PCR對HBV S基因編碼區(qū)進行擴增，將擴增產(chǎn)物用測序試劑盒進行純化和測序，當HBV DNA高于104 IU/mL時，滿足擴增及測序條件。將測序結果用Vector NTI Suite 9.0軟件拼接，序列與GenBank數(shù)據(jù)庫的參考序列進行比對分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi)。

(三)血清AFP、PTX3及肝功能指標測定 采用酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測血清AFP、PTX3水平，采用全自動生化分析儀檢測血清總膽紅素(total bilirubin，TBil)、天冬氨酸轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸轉氨酶(alanine transarninase，ALT)水平，操作按照試劑盒說明書進行。

(四)隨訪 慢性乙型肝炎肝硬化患者出院12個月內以電話等方式隨訪，收集了解患者并發(fā)癥及癌變發(fā)生情況，包括肝性腦病、感染、消化道出血、膽結石、電解質紊亂、原發(fā)性肝癌，根據(jù)是否發(fā)生上述事件將慢性乙型肝炎肝硬化患者分為預后良好43例和預后不良33例。

四、統(tǒng)計學分析

結 果

一、肝炎組與肝硬化組一般資料、肝功能指標及S基因突變比較

肝硬化組與肝炎組性別、年齡、BMI比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。肝硬化組TBil水平及S基因突變患者比例高于肝炎組，AST、ALT水平低于肝炎組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

二、慢性乙型肝炎肝硬化患者血清AFP、PTX3表達水平比較

根據(jù)S基因是否發(fā)生突變將慢性乙型肝炎肝硬化患者分為S基因突變組22例和S基因未突變組54例。S基因突變組血清AFP為(5.98±2.01)ng/mL、PTX3為(5.24±1.43)μg/L，高于S基因未突變組的(4.86±1.34)ng/mL、(3.84±1.05)μg/L，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.839、4.729，P<0.05)。

三、S基因突變慢性乙型肝炎肝硬化患者血清AFP、PTX3水平與肝功能指標相關性

Pearson法分析結果顯示，S基因突變慢性乙型肝炎肝硬化患者血清中AFP、PTX3水平與TBil均呈正相關(r=0.502、0.479，P=0.004、0.009)，與AST(r=-0.492、-0.513，P=0.007、0.002)、ALT(r=-0.487、-0.494，P=0.006、0.008)均呈負相關。

四、S基因突變與慢性乙型肝炎肝硬化患者預后的相關性

S基因突變與慢性乙型肝炎肝硬化患者預后有關(r=0.553，P<0.05)，且發(fā)生S基因突變的慢性乙型肝炎肝硬化患者中預后不良比例高于預后良好(86.36%比13.64%)。

五、影響慢性乙型肝炎肝硬化患者預后的多因素logistic回歸分析

將慢性乙型肝炎肝硬化患者是否發(fā)生不良預后作為因變量，以S基因突變、AFP、PTX3、AST、ALT、TBil為自變量進行l(wèi)ogistic回歸分析，結果顯示S基因突變、AFP是影響慢性乙型肝炎肝硬化患者發(fā)生不良預后的獨立危險因素(P<0.05)。見表2。

討 論

慢性乙型肝炎肝硬化進一步發(fā)展可能會出現(xiàn)肝性腦病、電解質紊亂以及肝癌等并發(fā)癥[6,7]。但慢性乙型肝炎肝硬化發(fā)病機制較復雜，以往研究顯示S基因突變可能影響慢性乙型肝炎肝硬化的發(fā)生、發(fā)展，且S基因突變可能與體內血清因子表達有關[8]。因此，探究慢性乙型肝炎肝硬化患者S基因突變與預后的關系，可能對個體化治療方案的選取及預后改善有重要意義。

金子錚等[9]研究發(fā)現(xiàn)，HBV DNA前S區(qū)缺失突變檢測對肝病進展風險及預后評估有一定價值。本研究結果顯示，肝硬化組中S基因突變患者比例高于肝炎組，S基因突變與慢性乙型肝炎肝硬化患者預后有關，是患者發(fā)生不良預后的獨立危險因素，與上述研究結果基本一致。提示S基因突變可能是導致HBV感染相關肝臟疾病加重的重要因素。AFP主要在胎兒肝臟中合成，是一種肝腫瘤的標志物[10,11]。PTX3與炎癥反應及胰島素抵抗有關，且參與肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展[12,13]。本研究中，發(fā)生S基因突變的慢性乙型肝炎肝硬化患者血清AFP、PTX3水平高于未發(fā)生S基因突變的患者。提示S基因突變可能與患者血清AFP、PTX3水平的升高有密切聯(lián)系，推測HBV S基因發(fā)生突變后，使得蛋白質的生物學作用改變，病毒的復制能力及對肝臟的損傷能力增強，血清標志物AFP、PTX3表達水平上升。此外，本研究中S基因突變慢性乙型肝炎肝硬化患者血清中AFP、PTX3水平與肝功能指標AST、ALT、TBil均呈一定的相關性。進一步提示HBV S基因突變可引起患者肝臟損傷，造成其肝臟指標及血清標志物水平上升，密切監(jiān)測各指標水平的變化，可能對臨床改善患者預后有重要指導意義。

表1 肝炎組與肝硬化組一般資料、肝功能指標及S基因突變比較(±s)

表2 影響慢性乙型肝炎肝硬化患者預后的多因素logistic回歸分析

綜上所述，HBV S基因突變可能導致慢性乙型肝炎肝硬化患者血清AFP、PTX3水平升高，與預后有重要聯(lián)系，但作用機制仍需深入探究，還需進一步探索S基因突變和血清AFP、PTX3在慢性乙型肝炎肝硬化預后中的實際應用價值。