李海強，丁瑞豐，阿克旦·吾外士，劉 建，潘洪生，李號賓，王冬梅

(新疆農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，農(nóng)業(yè)部庫爾勒作物有害生物科學觀測實驗站，農(nóng)業(yè)部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室，烏魯木齊 830091)

棉鈴蟲Helicoverpaarmigera是危害棉花的一種重大的致災性害蟲。20世紀90年代曾在我國連年暴發(fā)幾乎對所有化學農(nóng)藥產(chǎn)生抗性(吳孔明, 2005)。蘇云金桿菌Bacillusthurigensis(Bt)產(chǎn)生的δ-內(nèi)毒素對許多鱗翅目害蟲具有很高的殺蟲活性，而對天敵和人畜很安全。自1997年轉(zhuǎn)蘇云金芽孢桿菌(Bt)基因棉花在我國首次商業(yè)化栽培以來，較好地控制了棉鈴蟲的為害，為棉鈴蟲的防控提供了一種安全有效的策略(張洋, 2010)。然而，長期大面積推廣和種植，棉鈴蟲在整個生長期都受到了Bt棉體內(nèi)持續(xù)表達的Bt殺蟲蛋白的高壓選擇，棉鈴蟲將會對Bt棉演化出抗性(葉萱, 2004)。Kranthi(2006)報道從Bt棉花上采集棉鈴蟲種群后用Bt棉花葉片飼養(yǎng)1代，隨后直接用含Bt Cry1Ac的飼料篩選了11代后發(fā)現(xiàn)，棉鈴蟲對Bt Cry1Ac的抗性達到205倍。雖然目前已有多種害蟲檢測到對蛋白產(chǎn)生了不同程度的抗性，但是至今為止，并沒有發(fā)現(xiàn)因為害蟲抗性的產(chǎn)生而導致轉(zhuǎn)基因作物種植失敗的情況，但是抗性演變問題不可忽視。因此，有必要進行棉鈴蟲對Bt的抗性監(jiān)測，為棉鈴蟲的綜合治理提供理論依據(jù)(Luttrell, 2012; Kennedy, 2017; Kukanur, 2018)。

棉鈴蟲對Bt毒蛋白抗性監(jiān)測是一種有效的方法，其目的和意義在于明確Bt棉花是否仍然可以在新疆繼續(xù)種植，并持續(xù)地壓低棉鈴蟲的種群數(shù)量(Burd, 2003; Wu, 2007)。先前的學者已進行了大量的研究。2009-2013年，在長江流域棉區(qū)通過不含Bt毒素的人工飼料和含有1.0 mol/L Cry1A(c)毒素的飼料，共篩選了夏津2 837個棉鈴蟲家系和安次2 055個家系的生長速率，沒有發(fā)現(xiàn)對Bt Cry1A(c)有抗性的棉鈴蟲個體(An, 2015)。2010-2011年利用相同的方法，研究了新疆棉鈴蟲對Bt棉的抗性頻率進行了監(jiān)測，結(jié)果表明新疆地區(qū)棉鈴蟲田間種群的抗性頻率仍處于敏感水平(王冬梅, 2012)。張洋等(2010)利用改進的單雌系F1/F2代法，對黃河流域主要棉區(qū)河南安陽縣、河北威縣、山東武城縣的棉鈴蟲種群進行了系統(tǒng)監(jiān)測，結(jié)果表明，我國黃河流域這3個主要棉區(qū)田間棉鈴蟲種群對Cry1Ac毒素還沒有產(chǎn)生明顯的抗性，抗性基因頻率仍處于正常水平。李國平等(2018)對河南省新鄉(xiāng)市棉鈴蟲種群進行了Bt抗性頻率監(jiān)測，結(jié)果表明新鄉(xiāng)市棉鈴蟲種群對Cry1Ac蛋白的敏感度增加，轉(zhuǎn)Cry1Ac基因棉花仍處于較為敏感階段。

新疆棉區(qū)是我國重要的棉花生產(chǎn)基地，近些年隨著轉(zhuǎn)基因棉花的引進和大面積種植，其對棉鈴蟲產(chǎn)生的抗性也備受關(guān)注。同時，棉鈴蟲對Bt Cry1Ac棉的敏感性的監(jiān)測工作仍然開展較少。因此，有必要對新疆棉區(qū)棉鈴蟲對Cry1Ac毒素抗性進行系統(tǒng)的監(jiān)測。本文采用單雌系F1/F2代診斷劑量法于2013-2019年連續(xù)監(jiān)測了新疆庫爾勒市棉鈴蟲種群對Cry1Ac蛋白的抗性頻率以及種群敏感度的變化。通過這些研究，可以明確上述地區(qū)棉鈴蟲種群對Cry1Ac的敏感程度，以及其抗性的演化過程，為制定切實可行的棉鈴蟲抗性治理措施提供參考，以保障轉(zhuǎn)基因棉花在新疆有效、持久安全的利用。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

新疆庫爾勒地區(qū)是新疆Bt棉花集中種植區(qū)之一。2013-2019年7月在新疆庫爾勒地區(qū)利用1 000 W誘蟲燈誘集2代棉鈴蟲成蟲，總計446個棉鈴蟲單雌系作為供試蟲源，用于棉鈴蟲種群對Cry1Ac抗性頻率的監(jiān)測。

1.2 供試Bt Cry1Ac蛋白

含Cry1Ac型Bt ICP 20%的MVPII水劑，由Mycogen公司提供，凍存于-20℃冰箱備用。

1.3 實驗方法

采用F1/F2單雌系法：以Wu(1999)確定的1.0 μg/mL飼料為診斷濃度，并參照Burd(2003)的生物測定方法。在庫爾勒試驗基地誘集棉鈴蟲雌蛾，以10%蜂蜜水飼養(yǎng)在一次性水杯中，單頭飼養(yǎng)后將每個雌蛾所產(chǎn)初孵幼蟲30～35頭接入1.0 μg/mL的Cry1Ac飼料中，以不加Cry1Ac的人工飼料作為對照，在溫度27±2℃，相對濕度60%～70%，光周期14 L ∶10 D下飼養(yǎng)，6 d后觀察幼蟲發(fā)育級別，統(tǒng)計幼蟲的發(fā)育級別。

F1代幼蟲在Cry1Ac飼料上發(fā)育與在正常飼料上發(fā)育較相近的按10%的比例，將各個家系在正常飼料上存活幼蟲分別保存下來，使其羽化，置于養(yǎng)蟲籠中自交，進行F2代幼蟲生物測定，方法同F(xiàn)1代幼蟲生物測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)生物測定結(jié)果，計算每個家系幼蟲在兩種飼料上的相對平均發(fā)育級別，為消除環(huán)境條件的影響，相對平均發(fā)育級別為在Cry1Ac飼料上的平均發(fā)育級別除以在正常飼料上的平均發(fā)育級別。試驗數(shù)據(jù)處理均采用SPSS 17.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行分析。對不同年份的相對發(fā)育級別進行單因素方差分析，相同小寫字母表示差異不顯著，不同小寫字母表示差異顯著。

F2代與F2代對應的F1代的相對平均發(fā)育級別利用單因素方差分析其差異顯著性，F(xiàn)2代與F2代對應的F1代的相對平均發(fā)育級別相關(guān)性分析采用SPSS 17.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 F1代棉鈴蟲種群的敏感性

2013-2019年庫爾勒棉鈴蟲種群各家系在Cry1Ac上的相對平均發(fā)育級別(RADR)分布見圖1。F1代棉鈴蟲中均未觀察到RADR大于0.8的個體，RADR在0.3～0.6之間。

2013-2019年共測試庫爾勒種群分別為60個、38個、48個、53個、59個、83個和105個雌性家系。F1代棉鈴蟲種群的RADRs分別為0.328、0.386、0.539、0.572、0.565、0.542、0.562。RADR從2015年開始明顯的升高(見圖1)，在2016年達到峰值0.572，然后逐漸下降到2019年的0.562，方差分析表明，2015-2019年棉鈴蟲的相對發(fā)育級別顯著高于2013年和2014年(F(6 439)=44.39；P<0.0001)。表明，棉鈴蟲種群對Cry1Ac的RADR升高，抗性增加。

圖1 不同年份F1代庫爾勒棉鈴蟲種群相對發(fā)育級別Fig.1 RADR dynamics for each year in the F1 generation in the Korla populations during 2013-2019注：圖中不同小寫字母a，b代表在0.05水平差異顯著，下同。Note: Different small letters in the figure were significantly at 0.05 level, the same as below.

2.2 F1代棉鈴蟲種群相對平均發(fā)育級別分布頻次

2013-2014年棉鈴蟲F1代幼蟲相對平均發(fā)育級別主要分布在0.2～0.5之間，2015年略有增加，其中相對平均發(fā)育級別為0.6的所占比例最高。至2016-2019年則主要分布在0.3～0.7之間，且相對發(fā)育級別為0.7的個體比例較2016年以前逐漸增加(圖2)。

圖2 棉鈴蟲F1代幼蟲相對平均發(fā)育級別分布圖Fig.2 RADR distribution for six-day-old larvae of Helicoverpa armigera F1 generation female lines on Cry1Ac diets in the Korla population during 2013-2019

2.3 F2代棉鈴蟲種群的敏感性

2013-2019年進行了F2棉鈴蟲種群的Bt Cry1Ac毒素的抗性的生物測定。結(jié)果表明，F(xiàn)2代棉鈴蟲種群相對平均發(fā)育級別為0.419～0.621，與其對應的F1代棉鈴蟲種群相比，除了2013年和2019年有明顯差異，其余年份無差異(見表1)。在供試的F2代家系中，沒有任何1個家系的相對平均發(fā)育級別達到0.8。

表1 庫爾勒棉鈴蟲種群F1和F2代幼蟲的相對平均發(fā)育級別

續(xù)表1 Continued table 1

相關(guān)性分析表明，F(xiàn)2代與F2代對應的F1代的相對平均發(fā)育級別間無明顯相關(guān)性(R=0.229,P=0.084)，表明F2代棉鈴蟲種群的變化沒有遺傳。

3 結(jié)論與討論

本文利用單雌系F1/F2代診斷法從2013-2019年連續(xù)對新疆庫爾勒棉區(qū)棉鈴蟲種群對Cry1Ac蛋白的抗性頻率進行了監(jiān)測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)庫爾勒F1代和F2代棉鈴蟲均未發(fā)現(xiàn)相對平均發(fā)育級別大于0.8的個體，說明沒有出現(xiàn)耐Cry1Ac蛋白的棉鈴蟲個體。這表明庫爾勒地區(qū)棉鈴蟲種群仍處于敏感水平，抗性水平較低。Lietal.(2010年)在2005年、2006年和2009年對新疆庫爾勒棉鈴蟲對Cry1Ac進行了抗性頻率監(jiān)測，結(jié)果表明，F(xiàn)1代的相對平均發(fā)育級別分別為0.31，0.32和0.49，棉鈴蟲種群仍處于敏感水平。Zhangetal.(2018)發(fā)現(xiàn)新疆棉鈴蟲對Cry1Ac的敏感性高于黃河流域和長江流域棉區(qū)。這些結(jié)果表明，新疆南疆地區(qū)棉鈴蟲種群的抗性頻率較低，仍然處于對Cry1Ac蛋白敏感的階段，這與本研究結(jié)果一致。

棉鈴蟲對Bt抗性是否形成取決于多種因素，如不同棉鈴蟲地理種群的密度、時空分布、Bt基因漂移等(Wu, 2007)。Liuetal.(2008)報道，2003年至2007年，在河北省邱縣對棉鈴蟲抗性頻率進行了抗性監(jiān)測，結(jié)果表明，田間棉鈴蟲種群較實驗室棉鈴蟲種群Cry1Ac產(chǎn)生抗性的等位基因的頻率增加了12倍，密集種植含Bt Cry1Ac蛋白的棉花引起了棉鈴蟲抗性的增加(何丹軍和劉鳳沂等, 2001; Xuetal., 2009)。這可能是由于河北邱縣自2001年以來Bt基因棉占總作物種植面積的85%以上造成的(潘利東等, 2013)。

棉花是新疆南部、北部和東部地區(qū)的主要作物，是農(nóng)民的主要收入來源。然而，由于近年來作物結(jié)構(gòu)的調(diào)整，棉花種植面積在減少，而其它經(jīng)濟作物種植面積在擴大。在莎車、阿克蘇、哈密、伯樂、昌吉等地形成了多種農(nóng)作物種植模式，各地棉花種植比重不斷下降。多種作物的分布為棉鈴蟲提供了豐富的食物來源，還可以提供庇護所，進而減緩棉鈴蟲對Bt蛋白抗藥性的發(fā)展速度(Wan P, 2012; Wang, 2018)。因此，天然避難所在棉鈴蟲的抗性管理中起著非常重要的作用(Jinetal., 2015; Takahashietal., 2016)。

轉(zhuǎn)Cry1Ac基因棉對棉鈴蟲存在明顯控制效果，目前種植轉(zhuǎn)基因棉大多數(shù)為轉(zhuǎn)單價基因品種，因此棉鈴蟲對轉(zhuǎn)基因棉比對常規(guī)棉田化學農(nóng)藥更易產(chǎn)生抗性。一旦棉鈴蟲對轉(zhuǎn)基因棉產(chǎn)生抗性，轉(zhuǎn)基因抗蟲棉就會失去價值。新疆庫爾勒地區(qū)當?shù)刂饕苑N植棉花為主，棉花栽培面積較大，且連年種植很有可能導致棉鈴蟲對Bt蛋白的敏感性下降。因此，為了確保Bt棉花能夠在新疆可持續(xù)安全種植仍需繼續(xù)監(jiān)測棉鈴蟲對Bt棉花的抗性變化，為棉鈴蟲的綜合治理提供理論依據(jù)。