胡啟豪，戴玉玲，裴夢(mèng)圓，肖妍虹，趙丹琿，余小強(qiáng)，盧玉珍

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東省昆蟲(chóng)發(fā)育生物學(xué)與應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510631)

家蠶是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)益蟲(chóng)，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的馴化和人工育種，目前已經(jīng)培育出大批具備優(yōu)良性狀的家蠶品種。遺傳雜交是人工育種的關(guān)鍵步驟，其中雄性家蠶精子質(zhì)量的高低直接影響著后代的性狀。精巢作為精子發(fā)生的場(chǎng)所，其發(fā)育機(jī)制的研究對(duì)于家蠶遺傳育種有著重要的意義。

Fox家族蛋白存在于植物以外的生物類(lèi)群當(dāng)中，具有一個(gè)約含100個(gè)氨基酸的保守結(jié)構(gòu)域，根據(jù)不同F(xiàn)ox蛋白的保守性，可分為19個(gè)亞族：FoxA～FoxS(Weigeletal., 1989; Kerschneretal., 2014)。不同F(xiàn)ox蛋白已被證明在哺乳動(dòng)物和昆蟲(chóng)的組織發(fā)育和先天免疫等多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在黑腹果蠅Drosophilamelanogaster中，F(xiàn)oxN3(CHES-1-like)的過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致精巢形態(tài)異常，并抑制精子發(fā)生的過(guò)程(Yuetal., 2016)。甜菜夜蛾SpodopteraexiguaSeFox蛋白結(jié)構(gòu)與家蠶BmFoxA相似，并且在精巢中有一定水平的表達(dá)(Zhaoetal., 2014)。家蠶的BmFoxG-1可能通過(guò)調(diào)節(jié)BmCyclinA等細(xì)胞周期基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)家蠶精巢的發(fā)育(胡啟豪等, 2021)。Song等通過(guò)基因芯片(Microarray)的方法分析發(fā)現(xiàn)不同F(xiàn)ox基因在家蠶精巢中都有不同程度的表達(dá)(Songetal., 2015)。這些研究都說(shuō)明Fox基因的功能可能與精巢發(fā)育相關(guān)，但其具體作用機(jī)制仍不清楚。

本研究通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)了不同BmFox基因在家蠶5齡第5天(L5D5)幼蟲(chóng)和預(yù)蛹期精巢中的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BmFoxL2亞族基因在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有高水平表達(dá)。本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)家蠶FoxL2亞族蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，并進(jìn)一步分析BmFoxL2-1和BmFoxL2-2在家蠶不同發(fā)育階段精巢中的表達(dá)情況以及在Bm12中的表達(dá)定位。最后，在家蠶Bm12細(xì)胞中分別過(guò)表達(dá)BmFoxL2-1和BmFoxL2-2蛋白，并分析了BmVasa等生殖和細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)變化。本研究的結(jié)果初步說(shuō)明BmFoxL2亞族蛋白參與了家蠶精巢發(fā)育及精子發(fā)生的過(guò)程。

1 材料與方法

1.1 材料和主要試劑

本研究使用的大造家蠶品種由廣東省蠶業(yè)技術(shù)推廣中心提供，家蠶的培養(yǎng)條件參考的方法胡啟豪等( 2021)。家蠶Bm12細(xì)胞、大腸桿菌DH5α和細(xì)胞過(guò)表達(dá)載體IE1-pEGFP-N1等均為本實(shí)驗(yàn)室保存材料。

Trizol總RNA提取試劑購(gòu)自中國(guó)艾科瑞生物公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和qRT-PCR試劑購(gòu)自康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Qiagen公司；引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成；去內(nèi)毒素質(zhì)粒小量抽提試劑盒購(gòu)自廣州美基生物科技有限公司；實(shí)驗(yàn)所用其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 生物信息學(xué)分析

從家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)SilkDB中獲得BmFoxL2-1(BGIBMGA000635)和BmFoxL2-2(BGIBMGA000838)基因及蛋白質(zhì)序列。蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測(cè)通過(guò)ExPASy進(jìn)行，磷酸化位點(diǎn)及糖基化位點(diǎn)利用Cbs網(wǎng)站進(jìn)行分析，蛋白結(jié)構(gòu)域利用SMART進(jìn)行分析。

1.3 不同發(fā)育階段家蠶精巢cDNA制備

收集5齡第3天(L5D3)幼蟲(chóng)至成蟲(chóng)第3天的雄性家蠶，在PBS緩沖液中進(jìn)行解剖并取出精巢。采用Trizol法提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照康為世紀(jì)HiFiScript gDNA removal RT Master Mix 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，cDNA保存于-20℃。

1.4 不同F(xiàn)ox基因在家蠶不同發(fā)育階段精巢中的表達(dá)量檢測(cè)

以稀釋后的cDNA為模板，采用qRT-PCR方法分析目標(biāo)基因的表達(dá)情況，以家蠶rp49作為內(nèi)參基因。qRT-PCR循環(huán)條件如下：95°C 5 min；95°C 10 s，60°C 30 s，40個(gè)循環(huán)。本研究所用引物序列見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物的序列

1.5 BmFoxL2-1/-2細(xì)胞過(guò)表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)BmFox2-1/-2的cDNA序列，設(shè)計(jì)上下游引物(表1)，克隆方法參考的方法胡啟豪等(2021)。利用SacⅠ和BamHⅠ對(duì)目的片段及pEGFP-N1-GFP載體進(jìn)行雙酶切，DNA凝膠回收后用T4連接酶將兩者連接構(gòu)建重組載體，經(jīng)PCR與雙酶切驗(yàn)證后轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5α中保存。采用去內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒供轉(zhuǎn)染使用。

1.6 BmFoxL2-1/BmFoxL2-2在 Bm12細(xì)胞株的過(guò)表達(dá)及細(xì)胞定位分析

將Bm12細(xì)胞用新鮮培養(yǎng)基懸浮，分裝至6孔板中，并補(bǔ)足培養(yǎng)基至每孔2 mL，當(dāng)每孔細(xì)胞密度達(dá)到80%以上時(shí)，參考Qiagen轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)的方法將BmFoxL2-1-EGFP和BmFoxL2-2-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Bm12細(xì)胞。

轉(zhuǎn)染48 h后，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適量PBS清洗細(xì)胞。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，用1‰ PBT(含1‰ Triton X-100的PBS)對(duì)固定后的細(xì)胞進(jìn)行通透。往細(xì)胞中加入適量濃度的DAPI對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，結(jié)束后用1‰ PBT清洗多余的DAPI。制片后于激光共聚焦顯微鏡下分析BmFoxL2-1-EGFP和BmFoxL2-2-EGFP在細(xì)胞中的定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同F(xiàn)ox基因在家蠶精巢中的表達(dá)

家蠶存在有核與無(wú)核兩種形態(tài)的精子，分別在幼蟲(chóng)階段和預(yù)蛹期形成，因此本研究收集了5齡第5天(L5D5)幼蟲(chóng)和預(yù)蛹期(PP)家蠶精巢。定量分析顯示，在兩個(gè)時(shí)期的家蠶精巢中，BmFoxL2-2的表達(dá)水平均顯著高于其它BmFox基因，F(xiàn)oxL2亞族的BmFoxL2-1和FoxO亞族的BmFoxO-1/BmFoxO-2的表達(dá)水平次之(圖1)。因此，在后續(xù)的研究中將重點(diǎn)分析BmFoxL2-1和BmFoxL2-2在精巢發(fā)育中的作用。

圖1 不同BmFox基因在幼蟲(chóng)和預(yù)蛹期家蠶精巢中的表達(dá)Fig.1 Expression of different BmFox genes in the testis of Bombyx mori larvae and prepupae注：A，5齡第5天幼蟲(chóng)；B，預(yù)蛹。不同字母表示差異性顯著(單因素方差分析，Turkey多重比較，P<0.05)。Note: A, The day 5 of 5th instar larvae; B, Prepupae. Different letters indicated significant difference between the two groups (One way ANOVA: Tukey’s HSD tests, P<0.05).

2.2 BmFoxL2蛋白的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)分析

為進(jìn)一步了解BmFoxL2的功能，本研究對(duì)BmFoxL2蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示BmFoxL2-1和BmFoxL2-2蛋白的分子量分別為20.35 kDa和24.52 kDa，等電點(diǎn)分別為9.85和5.87，BmFoxL2-1蛋白的磷酸化和糖基化位點(diǎn)都高于BmFoxL2-2(表2)。利用SMART網(wǎng)站對(duì)2個(gè)BmFoxL2亞族蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示均含一個(gè)Forkhead結(jié)構(gòu)域(圖2-A)，并且Forkhead結(jié)構(gòu)域的序列與其它昆蟲(chóng)以及人類(lèi)FoxL2亞族蛋白的高度保守(圖2-B)。

圖2 BmFoxL2-1和BmFoxL2-2蛋白結(jié)構(gòu)、序列和定位分析Fig.2 Structural analysis, sequence aglinment and cellular localization of BmFoxL2-1 and BmFoxL2-2注：A，蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；B，氨基酸序列比對(duì)；C，細(xì)胞定位分析。Note: A, Structural analysis; B, Sequence aglinment; C, Cellular localization.

表2 BmFoxL2-1和BmFoxL2-2蛋白理化性質(zhì)分析

為了進(jìn)一步確認(rèn)BmFoxL2-1/BmFoxL2-2的亞細(xì)胞定位，將構(gòu)建好的BmFoxL2-1-EGFP和BmFoxL2-2-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染家蠶Bm12細(xì)胞株(圖2-C)。結(jié)果顯示BmFoxL2-1定位于細(xì)胞核，BmFoxL2-2在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中都有分布，這可能是由于BmFoxL2-1和BmFoxL2-2上所含的磷酸化和O-糖基化位點(diǎn)數(shù)目不一所導(dǎo)致的。以上結(jié)果說(shuō)明BmFoxL2-1和BmFoxL2-2的功能可能存在差異。

2.3 BmFoxL2亞族基因在精巢中的表達(dá)

為進(jìn)一步分析BmFoxL2亞族基因的功能，本文檢測(cè)了兩個(gè)FoxL2亞族基因在5齡第5天家蠶幼蟲(chóng)精巢和卵巢中的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)BmFoxL2亞族基因在精巢中的表達(dá)均顯著高于卵巢(圖3-A)。由于精巢是精子發(fā)生的主要場(chǎng)所，因此本研究對(duì)5齡第5天家蠶幼蟲(chóng)精巢的精巢膜和精巢內(nèi)容物進(jìn)行分離。對(duì)精巢膜和內(nèi)容物的基因表達(dá)檢測(cè)顯示兩個(gè)BmFoxL2亞族基因在精巢內(nèi)容物中的表達(dá)水平均顯著高于精巢膜(圖3-B)，說(shuō)明BmFoxL2蛋白可能參與精子發(fā)生。

圖3 BmFoxL2-1 和BmFoxL2-2基因在家蠶中的表達(dá)Fig.3 Expression of BmFoxL2-1 and BmFoxL2-2 transcripts in silkworm注：A，BmFoxL2-1和BmFoxL2-2基因在家蠶精巢和卵巢中的表達(dá)；B，BmFoxL2-1和BmFoxL2-2基因在精巢內(nèi)容物與精巢膜中的表達(dá)；C，BmFoxL2-1和BmFoxL2-2基因在不同發(fā)育階段的精巢中的表達(dá)變化。柱上標(biāo)有星號(hào)表示兩組的表達(dá)差異顯著(*，P<0.05；***，P<0.001；t檢驗(yàn))。Note: A, Expression of BmFoxL2-1 and BmFoxL2-2 transcripts in the testis and ovary of silkworm at day 5 of 5th instar larvae; B, Expression of BmFoxL2-1 and BmFoxL2-2 mRNAs in different parts of the testis at day 5 of 5th instar larvae; C, Expression of BmFoxL2-1 and BmFoxL2-2 transcripts in the testis of silkworm at different developmental stages. The asterisk above the column indicated significant difference between the two groups (*, P<0.05; ***, P<0.001; t-test).

為了分析BmFoxL2基因在精巢中的表達(dá)模式，本研究在5齡第3天幼蟲(chóng)到成蟲(chóng)第1天的家蠶精巢中通過(guò)qPCR檢測(cè)兩個(gè)BmFoxL2基因的表達(dá)量。結(jié)果顯示，BmFoxL2-1的表達(dá)水平隨著精巢的發(fā)育逐漸升高，但在幼蟲(chóng)階段增速緩慢，而進(jìn)入蛹期后，上升速度開(kāi)始加快。BmFoxL2-2的表達(dá)水平在5齡幼蟲(chóng)末期(L5D5)達(dá)到一個(gè)高峰，在變態(tài)發(fā)育階段逐漸下降(L5D5-PP)，在蛹期階段(P0-P5)緩慢回升，到了成蟲(chóng)階段迅速下降。但BmFoxL2-2在不同發(fā)育階段精巢中的表達(dá)均高于BmFoxL2-1(圖3-C)。該結(jié)果進(jìn)一步暗示BmFoxL2-2可能在有核精子的形成中發(fā)揮作用，而B(niǎo)mFoxL2-1和BmFoxL2都可能與無(wú)核精子的形成相關(guān)。

2.4 BmFoxL2亞族蛋白對(duì)精巢生殖細(xì)胞發(fā)育的影響

細(xì)胞周期蛋白與生殖細(xì)胞有絲分裂和減數(shù)分裂等過(guò)程有著密不可分的關(guān)系。報(bào)道顯示BmFoxG-1可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期等基因的表達(dá)，參與精子發(fā)生過(guò)程。本研究在Bm12細(xì)胞株中過(guò)表達(dá)了BmFoxL2-1基因，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期基因BmCyclinA的表達(dá)顯著上調(diào)，而生殖干細(xì)胞發(fā)育關(guān)鍵基因BmNanos的表達(dá)也發(fā)生了顯著上調(diào)(圖4)。而過(guò)表達(dá)BmFoxL2-2基因后，BmCyclinA、BmCyclinB和BmCyclinB3等細(xì)胞周期基因的表達(dá)顯著上調(diào)，BmNanos和BmVasa等生殖干細(xì)胞發(fā)育關(guān)鍵基因的表達(dá)也發(fā)生了顯著上調(diào)(圖5)。以上結(jié)果說(shuō)明，兩個(gè)BmFoxL2亞族蛋白都可能通過(guò)調(diào)節(jié)生殖干細(xì)胞的發(fā)育及精細(xì)胞分裂等過(guò)程，影響家蠶精子的發(fā)生，而且BmFoxL2-2的調(diào)控功能更加顯著。

圖4 BmFoxL2-1蛋白對(duì)精子發(fā)生相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.4 Effect of BmFoxL2-1 overexpression on the expression of genes related to spermatogenesis注：柱上標(biāo)有星號(hào)表示兩組的表達(dá)差異顯著；NS兩組的表達(dá)差異不顯著(*，P<0.05；**，P<0.01；t檢驗(yàn))。Note: Asterisks above the columns indicated significant difference between the two groups, “NS” indicates non-significant between the two groups (*, P<0.05; **, P < 0.01; t-test).

圖5 BmFoxL2-2蛋白對(duì)精子發(fā)生相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.5 Effect of BmFoxL2-2 overexpression on the expression of genes related to spermatogenesis注：柱上標(biāo)有星號(hào)表示兩組的表達(dá)差異顯著；NS兩組的表達(dá)差異不顯著(*，P<0.05；t檢驗(yàn))。Note: Asterisks above the columns indicated significant difference between the two groups; “NS” indicated non-significant between the two groups (*, P<0.05; t-test).

3 結(jié)論與討論

FoxL2為Fox家族蛋白的一員，被認(rèn)為是動(dòng)物性別分化的關(guān)鍵因子。在小鼠中，F(xiàn)oxL2純合突變可以導(dǎo)致次級(jí)卵泡的缺失和卵母細(xì)胞的閉鎖(Uhlenhautetal., 2009)。在褐飛虱Nilaparvatalugens和沙漠飛蝗Schistocercagregaria中也發(fā)現(xiàn)FoxL2在卵巢中有較高水平的表達(dá)，并影響卵巢的發(fā)育(De Loofetal., 2010; Yeetal., 2017)。盡管也有研究顯示FoxL2在泥蟹Scyllaparamamosain等動(dòng)物精巢中的表達(dá)高于卵巢，家蠶Microarray數(shù)據(jù)也顯示FoxL2-2基因在精巢中的表達(dá)高于卵巢，但FoxL2蛋白在精巢中的功能仍不清楚(Songetal., 2015; Wanetal., 2021)。本研究通過(guò)qRT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)家蠶BmFoxL2基因在精巢中的表達(dá)水平顯著高于卵巢，并且主要在精巢內(nèi)容物中表達(dá)。

在家蠶精子發(fā)生過(guò)程中，精原細(xì)胞可以分化為有核精子與無(wú)核精子。在無(wú)核精子的輔助下，有核精子與家蠶卵結(jié)合形成受精卵(Sahara and Kawamura, 2002; Pereira and Santos, 2015)。家蠶精子的二型分化具有嚴(yán)格的時(shí)期特異性，即有核精子在幼蟲(chóng)階段開(kāi)始發(fā)生，而無(wú)核精子的發(fā)生則要到預(yù)蛹期(PP)才能開(kāi)始，這些過(guò)程受到不同基因的嚴(yán)格調(diào)控(Sahara and Kawamura, 2002)。本研究分析了BmFoxL2-1和BmFoxL2-2在不同發(fā)育階段家蠶精巢中的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BmFoxL2-1在幼蟲(chóng)精巢中的表達(dá)水平較低，在預(yù)蛹期開(kāi)始上升；而B(niǎo)mFoxL2-2的表達(dá)在5齡幼蟲(chóng)末期達(dá)到高峰后開(kāi)始下降，到了預(yù)蛹期后逐漸上升。這些表達(dá)變化與二型精子發(fā)生的時(shí)期相近，推測(cè)兩個(gè)BmFoxL2亞族基因的功能可能與家蠶精子的二型分化相關(guān)。

精子發(fā)生的過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜且精細(xì)的過(guò)程，在黑腹果蠅中，生殖干細(xì)胞通過(guò)增殖與分化首先形成性原細(xì)胞。一個(gè)性原細(xì)胞經(jīng)歷有絲分裂和減數(shù)分裂后形成64個(gè)精細(xì)胞，這些過(guò)程受到Vasa、Nanos以及細(xì)胞周期相關(guān)基因的調(diào)控(Fabian and Brill, 2012; Fairchildetal., 2016)。研究顯示，與黑腹果蠅相似，家蠶生殖干細(xì)胞增殖與分化的過(guò)程同樣需要Vasa和細(xì)胞周期等基因的參與(賀真等, 2020)。本研究的結(jié)果顯示，在Bm12細(xì)胞中過(guò)表達(dá)BmFoxL2-2蛋白可以顯著上調(diào)細(xì)胞周期基因BmCyclinA、BmCyclinB、BmCyclinB3和BmCyclinA，以及生殖干細(xì)胞發(fā)育關(guān)鍵基因BmNanos和BmVasa的表達(dá)(圖5)。另外，過(guò)表達(dá)BmFoxL2-1蛋白也可以上調(diào)BmCyclinA和BmNanos的表達(dá)，但效果不如BmFoxL2-2的顯著(圖4)。由此推測(cè)家蠶FoxL2亞族蛋白都可以參與精子發(fā)生過(guò)程。但由于BmFoxL2-1和BmFoxL2-2蛋白的理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位均存在差異(圖2)，導(dǎo)致了兩者對(duì)精子發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控存在差異。

綜上，本研究結(jié)果說(shuō)明BmFoxL2亞族蛋白的功能與精子發(fā)生過(guò)程相關(guān)。以上結(jié)果完善了FoxL2亞族基因在雄性生殖系統(tǒng)發(fā)育中的功能，同時(shí)也為研發(fā)通過(guò)提高精子質(zhì)量?jī)?yōu)化家蠶性狀的技術(shù)提供理論依據(jù)。