吳婷婷，吳文珊，陳友鈴*，陳小貞，黃 鎮(zhèn)，周蓮香

(1. 福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/福建省發(fā)育與神經(jīng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350117；2. 臺(tái)灣大學(xué)生態(tài)學(xué)與演化生物學(xué)研究所，臺(tái)北 10617)

?？崎艑僦参飷?ài)玉子FicuspumilaL.var.awkeotsang是亞熱帶植物生態(tài)系統(tǒng)的關(guān)鍵樹(shù)種，分布于中國(guó)臺(tái)灣、福建和浙江等地(張嬈挺，1991；中國(guó)植物志編輯委員會(huì)，1998)。愛(ài)玉子瘦果(愛(ài)玉子雌果內(nèi)雌花經(jīng)授粉形成瘦果)水洗可制成風(fēng)味獨(dú)特的涼粉，故愛(ài)玉子從森林副產(chǎn)品轉(zhuǎn)變?yōu)榻?jīng)濟(jì)作物(賴(lài)柏全，2010)，目前在臺(tái)灣和大陸長(zhǎng)江以南地區(qū)作為特種經(jīng)濟(jì)果樹(shù)被廣泛栽培(吳文珊和陳友鈴，2008；2010)。愛(ài)玉子依賴(lài)愛(ài)玉子傳粉榕小蜂Wiebesiapumilae(Hill)Wiebes傳粉才能結(jié)實(shí)，愛(ài)玉子傳粉榕小蜂也必須借助榕果產(chǎn)卵，才可繁育后代，二者彼此依賴(lài)不可或缺 (林贊標(biāo)等，1990；吳文珊和陳友鈴，2008；楊升等，2017)。因此，研究愛(ài)玉子傳粉榕小蜂幼期發(fā)育是愛(ài)玉子栽培的重要技術(shù)環(huán)節(jié)(賴(lài)柏全，2010；楊升，2016)，而幼蟲(chóng)齡數(shù)劃分是昆蟲(chóng)發(fā)育生物學(xué)的重要內(nèi)容(Cazadoetal.，2014；李志文等，2015)。

榕小蜂很難人工繁殖，其幼期階段須生活在封閉的榕果中(Yadav and Borges，2018)，故不能對(duì)小蜂個(gè)體發(fā)育過(guò)程進(jìn)行連續(xù)觀察，無(wú)法根據(jù)幼蟲(chóng)蛻皮情況確定齡數(shù)。目前，榕小蜂幼期發(fā)育的研究報(bào)道極少，多基于形態(tài)特征進(jìn)行齡數(shù)劃分(姚若潔，1998；Jansen-González and Sarmiento，2008；Jansen-Gonzálezetal.，2012;2014；Jiaetal.，2014；Yadav and Borges，2018)。Dyar，Brooks和Crosby等人認(rèn)為：昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)大小隨齡數(shù)增加呈幾何級(jí)數(shù)增長(zhǎng)，且生長(zhǎng)率(也稱(chēng)Brooks指數(shù))恒定(Brooks，1886；Dyar and Rhinebeck，1890；Crosby，1973)。根據(jù)各齡幼蟲(chóng)形態(tài)指標(biāo)測(cè)量值呈正態(tài)分布的假設(shè)，認(rèn)為幼蟲(chóng)形態(tài)指標(biāo)測(cè)量值的頻次分布圖中每一個(gè)峰代表1齡，即可通過(guò)對(duì)幼蟲(chóng)某個(gè)外部形態(tài)指標(biāo)的測(cè)量確定齡數(shù)。頭殼寬、口鉤和頭咽骨等為首選的指標(biāo)，因其骨化程度較高，測(cè)量值具有較高的精確性(李志文等，2015；鄧僑等，2015；賀春玲等，2015；Shietal.，2017)；其次，體長(zhǎng)、體寬、體重等指標(biāo)雖然準(zhǔn)確性低，但因側(cè)量便利，也常作為重要的參考指標(biāo)(賀春玲等，2015；萬(wàn)喻等，2015；王芳等，2016)。為此，本研究以頭殼寬、體長(zhǎng)、第3體節(jié)寬為測(cè)量指標(biāo)，運(yùn)用頻次分布分析確定自然條件下愛(ài)玉子傳粉榕小蜂幼蟲(chóng)齡數(shù)，為幼蟲(chóng)期發(fā)育期長(zhǎng)、體型小、生活場(chǎng)所隱蔽，又無(wú)法離蟲(chóng)癭培養(yǎng)的榕小蜂幼蟲(chóng)建立齡數(shù)劃分的方法和標(biāo)準(zhǔn)，為榕小蜂生物學(xué)研究和保護(hù)資源保護(hù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲(chóng)源

愛(ài)玉子傳粉榕小蜂幼蟲(chóng)采集于福建省泉州市德化縣愛(ài)玉子種植園。根據(jù)多年野外觀察已知福建地區(qū)愛(ài)玉子傳蜂榕小蜂一年有兩代，第一代在5月份上旬產(chǎn)卵，在7月中下旬進(jìn)入蛹期，8月下旬出飛，卵至成蟲(chóng)的發(fā)育期約100 d；第二代在8月下旬產(chǎn)卵，在愛(ài)玉子雄果中越冬，翌年3月中旬進(jìn)入蛹期，5月上旬出飛，卵至成蟲(chóng)的發(fā)育期約256 d(吳文珊和陳友鈴，2008；2010；楊升，2016)。2018年8月15日，通過(guò)套袋放蜂獲得150個(gè)同期進(jìn)蜂的愛(ài)玉子雄果，每周采集3個(gè)被產(chǎn)卵的雄果，帶回實(shí)驗(yàn)室插水保存，每隔1～4 d(為確保采集到1齡幼蟲(chóng)，放蜂后的前兩周每天取樣；第三周開(kāi)始每周取樣兩次)隨機(jī)選取10～20頭幼蟲(chóng)進(jìn)行發(fā)育狀況觀察并測(cè)量。采樣在2019年3月15日結(jié)束，此時(shí)果內(nèi)榕小蜂已全部進(jìn)入蛹期。

1.2 幼蟲(chóng)分齡指標(biāo)的測(cè)量

Dyar法則指出昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)相鄰兩個(gè)齡期某一部位的長(zhǎng)、寬度存在一定的幾何級(jí)數(shù)關(guān)系，據(jù)此可以推斷幼蟲(chóng)的齡數(shù)。由于頭殼是榕小蜂幼蟲(chóng)唯一骨化部分；體長(zhǎng)是最直觀體現(xiàn)榕小蜂個(gè)體大小的參數(shù)；蟲(chóng)體第3體節(jié)寬是榕小蜂幼蟲(chóng)蟲(chóng)體的最寬處(姚若潔，1998；Jiaetal.，2014)，所以選擇頭殼(Y1)、體長(zhǎng)(Y2)、第3體節(jié)寬(Y3)作為幼蟲(chóng)分齡指標(biāo)(圖1)。

在立體顯微鏡(Nikon SMZ1500)下解剖蟲(chóng)癭，將蟲(chóng)癭內(nèi)的幼蟲(chóng)挑出，置于載玻片上。應(yīng)用生物顯微鏡(Olympus BX51)配合成像系統(tǒng)(SteREO Lumar V12)，以及景深擴(kuò)展和測(cè)量軟件(Image-Pro Plus)對(duì)幼蟲(chóng)拍照，并顯微測(cè)量各個(gè)部位。測(cè)量蟲(chóng)體不彎曲幼蟲(chóng)時(shí)，在同一張照片完成測(cè)量(圖1-A)；測(cè)量蟲(chóng)體彎曲的幼蟲(chóng)時(shí)，頭殼(圖1-B)和體長(zhǎng)、第3體節(jié)寬(圖1-C)分別拍照測(cè)量。本研究測(cè)量了763頭愛(ài)玉子傳粉榕小蜂幼蟲(chóng)的3項(xiàng)分齡指標(biāo)，剔除不完整及可疑數(shù)據(jù)后，對(duì)剩余的662頭幼蟲(chóng)的測(cè)量值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。運(yùn)用掃描電子顯微鏡技術(shù)(Jiaetal.，2014)對(duì)幼蟲(chóng)頭部細(xì)節(jié)進(jìn)行觀察。

圖1 愛(ài)子玉傳粉榕小蜂幼蟲(chóng)分齡指標(biāo)測(cè)量示意圖Fig.1 Schematic diagram of the measurements for Wiebesia pumilae larvae注：A，未彎曲的幼蟲(chóng)；B、C，彎曲的幼蟲(chóng)；Y1，頭殼寬；Y2，體長(zhǎng)；Y3，第3體節(jié)寬。Note：A，Stretched larva；B、C，Curved larva；Y1，Head capsule width；Y2，Body length；Y3，Third somite width.

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

對(duì)各項(xiàng)分齡指標(biāo)進(jìn)行測(cè)量，記錄各分齡指標(biāo)測(cè)量值的最小值、最大值，計(jì)算出極差，確定最佳組數(shù)、組距和錨值(即第一組的下限，設(shè)定為最小值外擴(kuò)1個(gè)組距之內(nèi)的某個(gè)整數(shù))。根據(jù)組距和錨值，利用SPSS 17.0軟件對(duì)測(cè)量的各項(xiàng)指標(biāo)值分別進(jìn)行頻次分布分析，通過(guò)變異系數(shù)(變異系數(shù)應(yīng)小于20%)、Brooks指數(shù)、Crosby指數(shù)(Crosby指數(shù)大于10%時(shí)，劃分的齡期數(shù)不合理)等指標(biāo)驗(yàn)證幼蟲(chóng)分組和分齡的合理性(李志文等，2015；朱利明，2017；崔小林，2020)，結(jié)合線性回歸，以及利用最小顯著差法對(duì)測(cè)量值進(jìn)行多重比較差異顯著度分析，篩選最合適的分齡指標(biāo)。

確定愛(ài)玉子傳粉榕小蜂的齡數(shù)之后，參考王芳等(2016)的方法統(tǒng)計(jì)，依據(jù)每個(gè)樣本的齡數(shù)與日齡(發(fā)育天數(shù))的關(guān)系，計(jì)算出各齡幼蟲(chóng)的齡期。

2 結(jié)果與分析

2.1 愛(ài)玉子傳粉榕小蜂幼蟲(chóng)的齡數(shù)劃分

頭殼寬、體長(zhǎng)、第3體節(jié)寬等測(cè)量指標(biāo)值的頻次分布圖(圖2)均顯示無(wú)明顯的分布聚集區(qū)(即無(wú)間隔聚集分布)，只能依據(jù)波峰與波谷的分布規(guī)律，將連續(xù)的分布區(qū)分出區(qū)間，每個(gè)區(qū)間代表1齡。以頭殼寬和體長(zhǎng)為分齡指標(biāo)的頻次分布圖呈明顯的4個(gè)區(qū)間，但若分4齡，由于1齡幼蟲(chóng)的變異系數(shù)大于30%，即1齡的數(shù)據(jù)離散程度太大，表明分為4齡不合理。依此，必須對(duì)第1區(qū)間重新劃分，發(fā)現(xiàn)以頭殼寬為分齡指標(biāo)的頻次分布第1區(qū)間存在極窄的波谷(僅1個(gè)低頻峰柱)，即分為5齡；但以體長(zhǎng)為分齡指標(biāo)的頻次分布第1區(qū)間不存在波谷(即兩波峰柱相鄰將波谷峰隱藏)；以第3體節(jié)寬為分齡指標(biāo)的頻次分布圖缺乏波峰波谷的分布規(guī)律。因此，通過(guò)增加分組數(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)疊加峰柱的拆分。圖2為分組數(shù)為60組的頻次分布圖，頭殼寬、體長(zhǎng)和第3體節(jié)寬測(cè)量值的頻次分布圖中均能將連續(xù)的分布區(qū)分出5個(gè)區(qū)間，即分為5齡。各分齡指標(biāo)的數(shù)據(jù)處理結(jié)果 (表1)顯示每項(xiàng)均通過(guò)變異系數(shù) (除體長(zhǎng)4齡的變異系數(shù)偏大)、Brooks指數(shù)和Crosby指數(shù)的檢驗(yàn)，且頭殼寬、體長(zhǎng)均值在各齡間存在顯著差異(P<0.05)，表明將愛(ài)玉子傳粉榕小蜂幼蟲(chóng)分為5齡期是合理的，頭殼寬為最佳的分齡指標(biāo)，體長(zhǎng)和第3體節(jié)寬可作為輔助的分齡指標(biāo)。

圖2 愛(ài)玉子傳粉榕小蜂各齡幼蟲(chóng)頻次分布圖Fig.2 Frequency histograms of Wiebesia pumilae larvae注：A，頭殼寬；B，體長(zhǎng)；C，第3體節(jié)寬。Note：A，Head capsule width；B，Body length；C，Third somite width.

2.2 分齡指標(biāo)測(cè)量值與齡數(shù)之間的回歸分析

對(duì)愛(ài)玉子傳粉榕小蜂不同蟲(chóng)齡幼蟲(chóng)的頭殼寬、體長(zhǎng)、第3體節(jié)寬的測(cè)量值與齡數(shù)進(jìn)行回歸分析，擬合結(jié)果如圖3所示，表明各分齡指標(biāo)與齡數(shù)之間符合Dyar法則的所描述的指數(shù)關(guān)系，且各分齡指標(biāo)測(cè)量值與齡數(shù)之間均呈極顯著相關(guān)性(R2>R0.01=0.96)，證明幼蟲(chóng)分為5齡是合理的，其中頭殼寬的相關(guān)性最高，表明頭殼寬為最佳的分齡指標(biāo)。

圖3 分齡指標(biāo)與齡數(shù)的回歸關(guān)系Fig.3 Regression relationship between larval instar and morphological variables

2.3 各齡幼蟲(chóng)的發(fā)育齡期

確定齡數(shù)后，以頭殼寬的分齡樣本數(shù)分組為基準(zhǔn)，以放蜂時(shí)間為小蜂發(fā)育起點(diǎn)，依據(jù)榕小蜂齡數(shù)與日齡關(guān)系(圖4)計(jì)算齡期。相鄰齡期存在日齡交叉現(xiàn)象，依據(jù)交疊樣本比例拆分重疊的齡期。計(jì)算結(jié)果表明，愛(ài)玉子傳粉榕小蜂冬季幼蟲(chóng)發(fā)育約需171 d，1～5齡幼蟲(chóng)的發(fā)育齡期分別為8.05、10.49、14.70、46.07、91.35 d。

圖4 愛(ài)玉子傳粉蜂幼蟲(chóng)齡數(shù)與日齡關(guān)系Fig.4 Relationship between larval instars and its duration of Wiebesia pumila

2.4 幼蟲(chóng)形態(tài)特征

不同齡期的愛(ài)玉子傳粉榕小蜂在形態(tài)上共同點(diǎn): 幼蟲(chóng)蟲(chóng)體呈圓柱形，頭端大，尾端逐漸變細(xì)；體表光滑，軀體柔軟，骨化不明顯(圖5)；具體節(jié)，分為頭部、中軀3節(jié)和后軀10節(jié)(圖5-A)；不同點(diǎn)：(1)1～2齡幼蟲(chóng)蟲(chóng)體直，3～5齡蟲(chóng)體彎曲呈“C”型；(2)1、2、5齡幼蟲(chóng)的體節(jié)較明顯(圖5-A，B，E)，而3、4齡幼蟲(chóng)的體節(jié)較不明顯(圖5-C，D)；(3)1～3齡幼蟲(chóng)蟲(chóng)體白色半透明，可看到中腸充滿(mǎn)了白色或黃色顆粒，4、5齡幼蟲(chóng)的體壁肌肉組織發(fā)達(dá)，呈不透明的白色；(4)中軀在5齡幼蟲(chóng)期膨大(1～4齡的幼蟲(chóng)中軀膨大不明顯)。

頭殼(圖5-F)和口器(圖5-G)是幼蟲(chóng)骨化的部分，1～3齡期幼蟲(chóng)骨化程度低，1齡、2齡幼蟲(chóng)口器顏色淺，不易觀察，3齡期后可觀察到口器的鐮刀形下顎，呈棕色；幼蟲(chóng)通過(guò)肌肉的舒張和收縮蠕動(dòng)，帶動(dòng)中腸內(nèi)含物的流動(dòng)。5齡幼蟲(chóng)最后一次蛻皮后進(jìn)入預(yù)蛹階段。幼蟲(chóng)體不再進(jìn)食，排凈消化道內(nèi)的殘留物，蟲(chóng)體變得更加潔白。各齡幼蟲(chóng)均無(wú)法分辨雌雄。

圖5 愛(ài)玉子傳粉榕小蜂各齡幼蟲(chóng)及頭部與口器特征Fig.5 Larvae of Wiebesia pumilae注：A；1齡幼蟲(chóng)；B，2齡幼蟲(chóng)；C，3齡幼蟲(chóng)；D，4齡幼蟲(chóng)；E，5齡幼蟲(chóng)；F，5齡幼蟲(chóng)的頭部；G，5齡幼蟲(chóng)的口器；m，口器；md，上顎。Note: A，1stinstar larva；B，2ndinstar larva；C，3rdinstar larva；D，4thinstar larva；E，5thinstar larva；F，Head of 5thinstar larva；G，Mouthparts of 5thinstar larva；m，mouthparts；md，mandible.

3 結(jié)論與討論

榕小蜂蟲(chóng)體小，低齡幼蟲(chóng)僅數(shù)十微米(Weiblen，2002)，且生活在由子房發(fā)育而成的蟲(chóng)癭內(nèi)，尚無(wú)法進(jìn)行人工培養(yǎng)，蛻皮現(xiàn)象難以觀察到(Yadav and Borges，2018)，因此，應(yīng)用定期采樣和頻次分布分析是確定榕小蜂齡數(shù)較為科學(xué)的方法。目前，關(guān)于榕小蜂齡數(shù)測(cè)定方法的相關(guān)研究鮮見(jiàn)，多依據(jù)幼蟲(chóng)形態(tài)特征的差異進(jìn)行分齡：Jansen-González等(2008)將榕樹(shù)Ficusandicola的傳粉榕小蜂Pegoscapusbacataensis幼蟲(chóng)分為5齡；Jia等(2014)也將對(duì)葉榕Ficushispida的傳粉榕小蜂Ceratosolensolmsi幼蟲(chóng)分為5齡；但Yadav等(2018)根據(jù)Jansen-González等(2012，2014)和Jia等(2014)的結(jié)果，將聚果榕Ficusracemosa3種非傳粉榕小蜂Sycophagatestacea、Apocryptasp.2、Apocryptawestwoodi幼蟲(chóng)分為4齡。由于榕小蜂早期幼蟲(chóng)頭殼和下顎難以觀測(cè)，Jansen-González等(2012，2014)選用體長(zhǎng)為分齡指標(biāo)，運(yùn)用頻次分布發(fā)確定了榕樹(shù)Ficuscitrifolia的傳粉蜂Pegoscapus sp.幼蟲(chóng)為4齡，以及非傳粉蜂Idarnesflavicollis幼蟲(chóng)為3齡。在實(shí)踐中體長(zhǎng)雖是最簡(jiǎn)便的參數(shù)，但體長(zhǎng)由于變異較大，一般不宜用于作為齡數(shù)劃分的指標(biāo)和依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示以各分齡測(cè)量指標(biāo)形成的頻次分布圖均無(wú)明顯的分布聚集區(qū)(即無(wú)間隔聚集分布)，表明各齡間測(cè)量指標(biāo)值存在相互重疊現(xiàn)象，其原因：(1)個(gè)體差異大。昆蟲(chóng)發(fā)育易受環(huán)境因素影響，如溫濕度、食物源、種內(nèi)種間競(jìng)爭(zhēng)等(Wise and Weinberg，2002；Shintanietal.，2003；Hanksetal.，2005；Goguen and Moreau，2013)，實(shí)驗(yàn)樣本在不同時(shí)期野外采集于同株不同的果，或不同植株，其個(gè)體差異大于可室內(nèi)培養(yǎng)的昆蟲(chóng)；(2)榕小蜂個(gè)體小，小到幾乎進(jìn)入顯微鏡的測(cè)量誤差范圍，從而造成了測(cè)量值的高標(biāo)準(zhǔn)差；(3)低齡幼蟲(chóng)(即1齡、2齡幼蟲(chóng))不僅個(gè)體極小，且發(fā)育歷期短，因此1齡、2齡幼蟲(chóng)之間測(cè)量指標(biāo)值的疊加尤為明顯，且同樣的定期定量采樣，低齡幼蟲(chóng)的樣本量少于高齡的幼蟲(chóng)，因此，在頻次分布圖中1齡、2齡測(cè)量指標(biāo)值的波形規(guī)律不明顯，難以分區(qū)，造成齡數(shù)誤判的可能性大。本研究中，齡數(shù)為5齡的愛(ài)玉子傳粉榕小蜂幼蟲(chóng)極易被誤判為4齡。密集采樣(即每天或隔天采樣)，多采樣(提高樣本量)，以及提高頻次分布分析的分組數(shù)，均可解決這一難題。此外，雖然昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)蟲(chóng)體按一定規(guī)律增長(zhǎng)，但只有骨化部分如頭殼等是間斷式增長(zhǎng)的，每蛻皮一次便顯著增大一次(王芳等，2016；Goetal.，2019)，本研究結(jié)果進(jìn)一步表明依據(jù)頭殼寬的變化來(lái)劃分榕小蜂齡數(shù)更為可靠。