胡 亞，羅 嫚，吳建偉

(1. 畢節(jié)市第一人民醫(yī)院，貴州畢節(jié) 551700；2. 畢節(jié)市中醫(yī)院，貴州畢節(jié) 551700；3. 貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽(yáng) 550004)

隨著免疫抑制劑及廣譜抗生素的大量使用，真菌感染尤其是白色念珠菌引起的機(jī)會(huì)性感染逐年增加，已嚴(yán)重威脅著人類生命健康(Marchettietal., 2004; Alastruey-Izquierdoetal., 2013; Yuetal., 2013)。宿主的免疫反應(yīng)抵御白色念珠菌的入侵，而對(duì)于宿主-病原菌相互作用的免疫應(yīng)答反應(yīng)還缺乏適合的動(dòng)物模型。因此，利用合適的動(dòng)物模型深入研究真菌感染后宿主的免疫應(yīng)答變化及其調(diào)控機(jī)制是非常必要的。先天免疫系統(tǒng)是宿主抵御病原入侵的第一防線，昆蟲(chóng)的先天性免疫系統(tǒng)具有高效抵御微生物病原侵害的效能，應(yīng)用昆蟲(chóng)作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷膶?shí)驗(yàn)結(jié)果不受獲得性免疫應(yīng)答的干擾，因此，大蠟蛾蠟螟Galleriamellonella、家蠶Bombyxmori、黑腹果蠅Drosophilamelanogaster、象鼻蟲(chóng)Bollweevil等昆蟲(chóng)已成為研究病原微生物與宿主之間先天免疫的重要模型(Pollardetal., 2012; 徐穎, 2012; Afonso-Barrosoetal., 2013; Huetetal., 2013; Rader and Guillemin, 2013; Rivas-Santiagoetal., 2013)。

昆蟲(chóng)體液免疫在其先天性免疫中起關(guān)鍵作用(Kounatidis and Ligoxygakis, 2012)。昆蟲(chóng)機(jī)體受微生物入侵后，體液中的分泌型模式識(shí)別受體(PRR, Pattern Recognition Receptor)對(duì)病原微生物的病原相關(guān)分子模式(PAMPs, Pathogen associated molecular patterns)進(jìn)行識(shí)別，通過(guò)信號(hào)通路進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)控，最終促使脂肪體細(xì)胞合成抗菌肽，抗菌肽分泌到血淋巴中殺死入侵的病原體(Kurata, 2014; 胡亞等, 2016)。研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽的表達(dá)主要由Toll信號(hào)通路和IMD信號(hào)通路控制(Lemaitre and Hoffmann, 2007; 修江帆等, 2014)，其中真菌與大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌激活Toll信號(hào)途徑，革蘭氏陰性菌激活I(lǐng)MD信號(hào)通路(Sony and Yonggyun, 2010; Choetal., 2012; Kleino and Silverman, 2014)，抵御并消除病原微生物對(duì)機(jī)體的損傷，這一復(fù)雜的過(guò)程是基于昆蟲(chóng)體液免疫模式識(shí)別微生物的病原相關(guān)分子。

在Toll受體介導(dǎo)的信號(hào)通路中，真菌感染靶生物時(shí)，機(jī)體啟動(dòng)免疫防御主要依賴于體液免疫系統(tǒng)對(duì)外源微生物的非特異性識(shí)別。真菌細(xì)胞壁中的β-1,3葡聚糖作為基本功能單位，可直接與靶生物體液中的革蘭氏陰性菌結(jié)合蛋白-3 (GNBP3, Gramnegative bacteriabinding protein 3)的功能結(jié)構(gòu)域相互作用，從而完成免疫系統(tǒng)對(duì)侵入體液中真菌的識(shí)別(Mishimaetal., 2009)，如在果蠅(Matskevichetal., 2010; Fullaondoetal., 2011)、黃粉蟲(chóng)(Leeetal., 2009)中，GNBP3結(jié)合β-1,3葡聚糖，然后迅速活化Toll信號(hào)通路上游的一系列信號(hào)級(jí)聯(lián)傳遞，最終啟動(dòng)抗菌肽的轉(zhuǎn)錄，參與抗真菌防御(胡亞等, 2016)。

家蠅Muscadomestica是世界性昆蟲(chóng)，隸屬于昆蟲(chóng)綱雙翅目環(huán)裂亞目蠅科家蠅屬，孳生環(huán)境復(fù)雜，是重要的媒介昆蟲(chóng)之一(魏川川等, 2015)，其體表可攜帶多種病原體而自身很少受害，說(shuō)明家蠅比其它昆蟲(chóng)可能具有更強(qiáng)大的先天免疫系統(tǒng)(修江帆等, 2014; 王宇等, 2015; 彭傳林等, 2015)。目前國(guó)內(nèi)學(xué)者研究已表明，家蠅能夠產(chǎn)生attacin、cecropin、defensin、diptericin等多種常見(jiàn)抗真菌多肽(Wangetal., 2003; Liangetal., 2006; Liuetal., 2011; Jinetal., 2013)。家蠅基因組和Jeffrey等( 2014)的研究結(jié)果表明GNBP3是信號(hào)通路上游的模式識(shí)別受體，參與昆蟲(chóng)先天性免疫應(yīng)答反應(yīng)對(duì)真菌的識(shí)別，其能夠識(shí)別真菌細(xì)胞壁中的β-1,3葡聚糖，完成免疫系統(tǒng)對(duì)侵入體液中真菌的識(shí)別，從而宿主對(duì)真菌產(chǎn)生免疫抵抗，且根據(jù)本課題組前期家蠅轉(zhuǎn)錄組分析表明，GNBP3是家蠅迄今為止唯一的一個(gè)GNBP基因編碼的真菌模式識(shí)別受體(胡亞等, 2016)，而有關(guān)GNBP3在家蠅感染后的表達(dá)情況及抗菌肽的表達(dá)情況，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道，GNBP3在家蠅先天性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮什么作用還不清楚。

RNA干擾(RNA interference, RNAi)可調(diào)節(jié)大多數(shù)動(dòng)植物基因表達(dá)和用于研究抗病毒防御的發(fā)生(Fireetal., 1998)，已成為功能基因組學(xué)、生物醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)應(yīng)用的重要工具(Price and Gatehouse, 2008; Kurreck, 2009)。一旦宿主細(xì)胞對(duì)dsRNA產(chǎn)生反應(yīng)，其胞質(zhì)中的核酸內(nèi)切酶Dicer將dsRNA切割成多個(gè)具有特定長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)的小片段RNA(siRNA)，siRNA再與體內(nèi)一些酶(包括內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶等)結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)，RISC與基因表達(dá)的mRNA的同源區(qū)進(jìn)行特異性結(jié)合，從而誘發(fā)宿主細(xì)胞降解mRNA(Siomietal., 2011)。因此，本研究采用RNA干擾技術(shù)沉默家蠅GNBP3基因，以微生物感染家蠅幼蟲(chóng)，研究家蠅幼蟲(chóng)GNBP3對(duì)真菌感染的功能作用，并評(píng)價(jià)真菌感染后對(duì)下游抗菌肽水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種與實(shí)驗(yàn)昆蟲(chóng)

家蠅是由貴州醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)教研室長(zhǎng)期飼養(yǎng)。飼養(yǎng)溫度為 25～28℃，相對(duì)濕度為70%～80%，光照周期為12 h光照/12 h黑暗循環(huán)。家蠅幼蟲(chóng)RNA干擾模型的飼養(yǎng)溫度是20～25℃，飼以麥麩、熱滅活酵母、水等。大腸桿菌Escherichiacoli、金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus、白色念珠菌CanidiaAlbicans由貴州醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)教研室保存。

1.1.2主要試劑及儀器

SYBR Premix Ex TaqTM II (Perfect Real Time)試劑盒、rTaq酶、分子量標(biāo)準(zhǔn)DNA marker DL2000、質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖?、總RNA提取試劑TRIzol Reagent、DNA凝膠回收試劑盒質(zhì)粒、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit試劑盒、DEPC水(焦碳酸二乙酯)均購(gòu)自Takara公司；MEGAscriptR RNAi Kit合成試劑盒(美國(guó))；所用引物由上海生工生物工程公司合成。ABI PRISM 7300 Fast real time PCR System(美國(guó))；核酸定量分析儀(GeneQuant公司)；PCR擴(kuò)增儀(德國(guó)Eppendorf公司)；顯微解剖鏡(尼康)；顯微超微量注射儀(美國(guó))；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI公布的家蠅基因組GNBP3基因預(yù)測(cè)序列、內(nèi)參基因RPS18和抗菌肽基因defensin、cecropins、diptericin的基因序列，運(yùn)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)內(nèi)參RPS18基因、GNBP3基因和抗菌肽基因的q-PCR引物及GNBP3基因和GFP基因的dsRNA合成引物。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其序列如下(表1)。

表1 本文中所使用的引物

1.2.2雙鏈RNA的制備

1.2.2.1 基因PCR擴(kuò)增及線性DNA片段合成

以課題組保存的家蠅質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定及回收純化。以純化PCR產(chǎn)物為模板，引物為含有T7啟動(dòng)子的GNBP3引物，PCR擴(kuò)增條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s ，56℃ 30 s，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min(羅嫚, 2017)。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。然后用DNA凝膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，并進(jìn)行濃度測(cè)定。

1.2.2.2 dsRNA的初步合成

以上述純化PCR產(chǎn)物為模板，定量為1 μg進(jìn)行dsRNA的合成，將無(wú)RNase的PCR小管(200 μL)置于冰盒上，Linear template DNA 1～2 μg，CTP Solution 2.0 μL，UTP Solution 2.0 μL，ATP Solution 2.0 μL，GTP Solution 2.0 μL，10×T7 Reaction Buffer 2.0 μL，T7 Enzyme Mix 2.0 μL，Nuclease-free Water至20.0 μL。輕輕混勻后瞬時(shí)離心，37℃孵育6 h(最佳孵育時(shí)間根據(jù)基因長(zhǎng)度而定)。

1.2.2.3 去除DNA和ssRNA及純化dsRNA

加入反應(yīng)體系dsRNA(1.2.2.2)20 μL，Nuclease-free Water 21 μL，10×Digestion Buffer 5.0 μL，DNase I 2.0 μL，RNase I 2.0 μL，總體積為50 μL。輕輕混勻后瞬時(shí)離心，37℃孵育1 h(不得超過(guò)2 h)。加入dsRNA 50 μL，10×Binding Buffer 50 μL，Nuclease-free Water 150 μL，100% Ethanol 250 μL，總體積至500 μL進(jìn)行純化并測(cè)定濃度，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3dsRNA注射家蠅幼蟲(chóng)

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇家蠅2齡幼蟲(chóng)，幼蟲(chóng)體表依次用75%酒精及滅菌水進(jìn)行擦拭，然后用干凈紙巾吸干幼蟲(chóng)體表的水分(羅嫚, 2017)。對(duì)家蠅2齡幼蟲(chóng)利用顯微超微量注射儀注射dsRNA(定量為2 μg)，設(shè)立GNBP3RNA干擾實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)注射dsGFP作為對(duì)照組，并設(shè)立空白對(duì)照組，每組100頭幼蟲(chóng)，將其飼養(yǎng)于20℃恒溫培養(yǎng)箱中。參照鐘鳴研究結(jié)果(鐘鳴, 2014)，設(shè)立干擾時(shí)間點(diǎn)分別為24 h、48 h和72 h，收集樣本以確定最佳干擾時(shí)間點(diǎn)，記錄RNA干擾后家蠅幼蟲(chóng)的死亡和化蛹等生理學(xué)特性，進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4微生物感染

以白色念珠菌、大腸桿菌及金黃色葡萄球菌作為感染源，通過(guò)喂食途徑感染RNA干擾24 h后并饑餓6 h的家蠅幼蟲(chóng)(dsGFP組和dsGNBP3組)，細(xì)菌感染濃度為1×108CFU/mL，設(shè)置為感染組，感染過(guò)程參照王宇對(duì)家蠅幼蟲(chóng)經(jīng)口途徑飼喂白色念珠菌感染模型的建立(王宇, 2016; 羅嫚, 2017)。同時(shí)設(shè)置未感染對(duì)照組，感染后6 h進(jìn)行各標(biāo)本的收集，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｃ拷M進(jìn)行3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5樣本總RNA的提取及cDNA合成

對(duì)所有收集標(biāo)本，按照Takara公司TRIzol說(shuō)明書(shū)提取總RNA。取總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，同時(shí)測(cè)定A260/280比值及濃度。以1 μg總RNA為模板進(jìn)行cDNA的合成，合成的cDNA保存于-80℃冰箱中備用。

1.2.6熒光定量PCR檢測(cè)

取家蠅2齡幼蟲(chóng)RNA干擾不同時(shí)間點(diǎn)(24 h、48 h和72 h)(dsGFP對(duì)照組、dsGNBP3實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組)cDNA(1 ∶10稀釋)為模板，以GNBP3為目的基因，RPS18為內(nèi)參基因，使用ABI PRISM 7300 (ABI, USA)進(jìn)行熒光PCR，確定最佳干擾時(shí)間，每個(gè)樣品重復(fù)3次，每組3個(gè)重復(fù)。同樣取家蠅微生物(大腸桿菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌)感染樣本(PBS對(duì)照組及感染組(dsGFP組和dsGNBP3組))cDNA(1 ∶10稀釋)為模板，以defensin、cecropins、diptericin為目的基因，RPS18為內(nèi)參基因，按照q-PCR試劑盒說(shuō)明進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，以檢測(cè)抗菌肽基因表達(dá)情況，進(jìn)行3×3重復(fù)實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)體系為：2×SYBR premixEX Taq II 10 μL、上游引物+下游引物1.6 μL、ROX Reference Dye (50×) 0.4 μL、cDNA 1.0 μL, 加無(wú)RNA酶的水(RNase Free dH20)補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s; 95℃ 5 s, 60℃ 34 s, 40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，確認(rèn)real-time PCR的溶解曲線和擴(kuò)增曲線。

1.2.7數(shù)據(jù)處理及分析

采用RPS18作為內(nèi)參照，用RPS18的拷貝數(shù)作為校正基數(shù)，按目的基因表達(dá)量=2-△△Ct計(jì)算各細(xì)菌感染樣本中目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)含量(胡亞等, 2016)。采用Graphpad prism 6統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用組間t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P<0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 GNBP3基因RNA干擾效率檢測(cè)

采用q-PCR方法檢測(cè)RNA干擾后GNBP3mRNA相對(duì)表達(dá)量。通過(guò)對(duì)家蠅2齡幼蟲(chóng)注射GNBP3dsRNA(2 μg)并收集注射后24 h、48 h和72 h樣本，以檢測(cè)GNBP3mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果表明，RNA干擾GNBP324 h后，較GFPRNAi對(duì)照組和空白對(duì)照組，GNBP3基因表達(dá)量下降了大約90%，最佳的干擾效果在48 h時(shí)(圖1)。此實(shí)驗(yàn)表明在干擾后24 h時(shí)GNBP3基因取得了較好的抑制作用，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)提供了依據(jù)。

圖1 注射dsRNA后GNBP3基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.1 Relative gene expression of GNBP3 over time by dsRNA treatment注：NC，空白對(duì)照組；GFP，dsGFP對(duì)照組；GNBP3，dsGNBP3實(shí)驗(yàn)組；*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。Note: NC, Normal control; GFP, dsGFP control group; GNBP3, dsGNBP3 experience group.

2.2 RNA干擾后檢測(cè)家蠅生理學(xué)指標(biāo)

通過(guò)對(duì)家蠅幼蟲(chóng)注射dsGNBP3已達(dá)到沉默GNBP3基因的目的，檢測(cè)GNBP3基因在RNA干擾后是否會(huì)影響家蠅幼蟲(chóng)的化蛹及存活等生理學(xué)指標(biāo)，以探究其在家蠅中所起的重要作用。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，家蠅幼蟲(chóng)在RNA干擾后的存活率隨時(shí)間的變化逐漸降低，最終存活率低于50%(圖2)。除此之外，家蠅幼蟲(chóng)的化蛹率也顯著降低(圖3)。

圖2 RNA干擾后家蠅幼蟲(chóng)存活率Fig.2 Survival rate of housefly larvae after RNA interference注：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.0001。下圖同。Note:The same below.

圖3 RNA干擾后家蠅幼蟲(chóng)化蛹率Fig.3 Pupation rate of housefly larvae after RNA interference

2.3 RNAi家蠅GNBP3基因后抗菌肽基因的表達(dá)情況

以白色念珠菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為感染源，通過(guò)喂食感染家蠅RNA干擾模型(dsGFP組和dsGNBP3組)，通過(guò)q-PCR方法檢測(cè)抗菌肽基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在GFPRNAi組和GNBP3RNAi組之間，對(duì)于不同微生物感染其抗菌肽基因(cecropins、defensin、diptericin)表達(dá)情況各有差異。

對(duì)家蠅cecropins基因的表達(dá)量進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，在未感染組中，RNA干擾GNBP3后cecropins的表達(dá)量顯著性降低；而白色念珠菌感染后，cecropins的表達(dá)與未感染組呈相似的趨勢(shì)(圖4-A,P<0.0001)；但是，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌感染后，在GNBP3RNAi后cecropins的表達(dá)量顯著提高(圖4-A,P<0.05)。

對(duì)家蠅diptericin基因的表達(dá)量進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，在未感染組中，RNA干擾GNBP3后diptericin的表達(dá)量顯著性降低(圖4-B,P<0.0001)；而大腸桿菌和白色念珠菌感染后，在GNBP3RNAi后diptericin的表達(dá)量顯著提高(圖4-B,P<0.05)；但金黃色葡萄球菌感染后其表達(dá)在兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4-B,P>0.05)。

對(duì)家蠅defensin基因的表達(dá)量進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，在未感染組中，RNA干擾GNBP3后defensin的表達(dá)量顯著性降低(圖4-C,P<0.05)；而白色念珠菌、大腸桿菌及金黃色葡萄球菌感染后其表達(dá)在兩組間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4-C,P>0.05)。這說(shuō)明GNBP3基因在家蠅先天性免疫應(yīng)答中起著重要作用，推測(cè)與其它免疫途徑協(xié)同調(diào)節(jié)家蠅免疫應(yīng)答。

圖4 RNAi GNBP3后家蠅抗菌肽基因的表達(dá)情況Fig.4 Housefly AMP genes expression after RNAi of GNBP3注：A，天蠶抗菌肽；B，雙翅肽；C，防御素。Note: A, Cecropins; B, Diptericin; C, Defensin.

3 結(jié)論與討論

革蘭氏陰性菌結(jié)合蛋白-3 (GNBP3)作為昆蟲(chóng)先天性免疫病原識(shí)別因子，參與昆蟲(chóng)先天性免疫應(yīng)答，其能夠識(shí)別真菌細(xì)胞壁中的β-1,3葡聚糖完成免疫系統(tǒng)對(duì)侵入體液中真菌的識(shí)別(Mishimaetal., 2009; Matskevichetal., 2010; Fullaondoetal., 2011)。家蠅Muscadomestica孳生于雜亂菌叢的環(huán)境中傳播疾病，是重要的媒介昆蟲(chóng)，其有效的免疫防御系統(tǒng)得到很多研究者的關(guān)注，而對(duì)于家蠅GNBP3基因及其感染后表達(dá)水平的研究未見(jiàn)報(bào)道(胡亞等, 2016)。近年來(lái)，基因敲除技術(shù)逐漸成為研究基因功能必不可少的工具，但傳統(tǒng)的基因敲除很難獲得功能缺失的實(shí)驗(yàn)個(gè)體，RNAi技術(shù)是一種利用特異雙鏈RNA引起目的基因沉默的方法，在基因功能分析的研究領(lǐng)域應(yīng)用得尤為廣泛。

本研究通過(guò)RNA干擾技術(shù)沉默家蠅GNBP3基因，檢測(cè)GNBP3基因的干擾效率及家蠅幼蟲(chóng)在干擾后的生理學(xué)指標(biāo)(化蛹率及存活率)，對(duì)已確定家蠅GNBP3基因干擾模型進(jìn)行微生物感染(以白色念珠菌、大腸桿菌及金黃色葡萄球菌作為感染源)，通過(guò)q-PCR方法檢測(cè)抗菌肽基因(cecropins、defensin及diptericin)的表達(dá)情況。經(jīng)過(guò)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)各齡期家蠅幼蟲(chóng)進(jìn)行dsRNA注射，以確定dsRNA注射的最佳齡期及濃度，注射家蠅1齡幼蟲(chóng)后，由于此期家蠅幼蟲(chóng)個(gè)體小，體壁薄，及針刺刺激，其死亡率達(dá)到100%，注射家蠅3齡幼蟲(chóng)后，由于家蠅幼蟲(chóng)受到外界刺激，使得其化蛹時(shí)間提前，無(wú)法完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)各齡期幼蟲(chóng)注射濃度為1 μg時(shí)，并未達(dá)到干擾效果。對(duì)家蠅2齡幼蟲(chóng)注射dsGNBP3(定量為2 μg)，結(jié)果顯示，在干擾后24 h時(shí)家蠅GNBP3基因已達(dá)到有效沉默，其干擾效率達(dá)到90%左右，在48 h時(shí)沉默效果達(dá)到最佳，但72 h時(shí)沉默效率有復(fù)蘇的情況，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其次，RNA干擾家蠅GNBP3基因后，家蠅幼蟲(chóng)的存活率逐漸降低達(dá)50%以上，同時(shí)化蛹率降低，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這說(shuō)明家蠅GNBP3基因能夠影響家蠅幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育，推測(cè)干擾家蠅GNBP3基因后，擾亂了家蠅幼蟲(chóng)體內(nèi)的菌群平衡狀態(tài)，造成其死亡率增高及化蛹推遲現(xiàn)象。RNA干擾家蠅GNBP3基因24 h后并饑餓6 h幼蟲(chóng)，再進(jìn)行微生物感染6 h，抗菌肽基因的表達(dá)各有差異。對(duì)于未感染組，GNBP3RNAi組抗菌肽基因(defensin、cecropins及diptericin)的表達(dá)較GFPRNAi組呈顯著性降低(P<0.05)。GFP是一種理想的報(bào)告基因，對(duì)宿主的生理并無(wú)影響，同時(shí)它可以顯示生物體一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)狀況，所以GFPRNAi后對(duì)家蠅幼蟲(chóng)沒(méi)有影響卻可以顯示GNBP3基因和抗菌肽基因的表達(dá)情況，在未感染時(shí)GFPRNAi后GNBP3基因正常表達(dá)，抗菌肽基因也正常表達(dá)，當(dāng)GNBP3RNAi后使抗菌肽基因呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)，就此GNBP3基因的表達(dá)得到有效抑制，從而調(diào)節(jié)了抗菌肽基因的表達(dá)，這說(shuō)明GNBP3基因參與了家蠅先天性免疫應(yīng)答，在先天性免疫中有著至關(guān)重要的作用，可誘導(dǎo)抗菌肽基因的表達(dá)。白色念珠菌感染時(shí)，家蠅cecropins基因在GNBP3RNAi后的表達(dá)量顯著性降低(P<0.05)，diptericin基因在GNBP3RNAi后的表達(dá)量顯著性提高(P<0.05)，而家蠅defensin基因的表達(dá)在兩組間(GFPRNAi和GNBP3RNAi)差異不顯著(P>0.05)。大腸桿菌感染時(shí)，家蠅cecropins基因及家蠅diptericin基因在GNBP3RNAi后的表達(dá)量顯著性提高(P<0.05)，而家蠅defensin基因的表達(dá)在兩組間(GFPRNAi和GNBP3RNAi)差異不顯著(P>0.05)；金黃色葡萄球菌感染時(shí)，家蠅cecropins基因在GNBP3RNAi后的表達(dá)量顯著性提高(P<0.05)，而家蠅defensin基因及家蠅diptericin基因的表達(dá)在兩組間(GFPRNAi和GNBP3RNAi)差異不顯著(P>0.05)。GNBP3基因能夠激活Toll信號(hào)通路上游信號(hào)級(jí)聯(lián)傳遞，啟動(dòng)下游抗菌肽基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，使抗菌肽對(duì)微生物發(fā)揮查殺作用。通過(guò)對(duì)家蠅幼蟲(chóng)GNBP3RNA干擾模型在微生物感染下，各抗菌肽基因表達(dá)情況的研究，發(fā)現(xiàn)白色念珠菌感染家蠅時(shí)cecropins基因低表達(dá)，說(shuō)明沉默的GNBP3導(dǎo)致由β-1,3葡聚糖激活的Toll通路基因不能被激活，酚氧化物酶活性降低，不能啟動(dòng)下游抗菌肽的應(yīng)答反應(yīng)，這說(shuō)明家蠅GNBP3基因能夠識(shí)別真菌以啟動(dòng)下游抗菌肽對(duì)真菌的查殺，在抗真菌免疫中起到一定作用。然而每種抗菌肽都有不同的活性譜，defensin一般情況下只對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌起作用；diptericin對(duì)革蘭氏陰性菌有較強(qiáng)殺傷作用；cecropins對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌都有廣譜的抗菌活性(Lietal., 2012; 羅嫚, 2017)，造成不同微生物感染狀態(tài)下各抗菌肽基因表達(dá)的差異性，白色念珠菌感染家蠅時(shí)diptericin基因高表達(dá)，大腸桿菌感染家蠅時(shí)cecropins及diptericin基因呈高表達(dá)，金黃色葡萄球菌感染家蠅時(shí)cecropins基因高表達(dá)，說(shuō)明干擾GNBP3基因后并不能影響所有抗菌肽基因的表達(dá)反應(yīng)，可能同時(shí)存在其它抗菌途徑能夠誘導(dǎo)抗菌肽的產(chǎn)生，呈現(xiàn)協(xié)同調(diào)節(jié)的作用，共同完成家蠅先天性免疫系統(tǒng)對(duì)真菌的識(shí)別及免疫應(yīng)答，而對(duì)于家蠅先天性免疫系統(tǒng)對(duì)真菌的免疫應(yīng)答機(jī)制需進(jìn)一步研究。此次研究將為今后家蠅先天性免疫系統(tǒng)對(duì)真菌的免疫應(yīng)答研究提供依據(jù)和參照，為進(jìn)一步探討家蠅先天性免疫系統(tǒng)提供新的思路。