李 建，張 敏，薛 霜，張飛雁，朱 薇，石寶蘭，漆世華，李文靜，王碧群，秦紅剛，韓 興，鄭良益，徐 松，舒銀輝，馮 釗，李婷婷，謝紅玲

(國(guó)藥集團(tuán)動(dòng)物保健股份有限公司，武漢 430075)

豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus，PCV)屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬成員，包括豬圓環(huán)病毒1型(PCV1)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)和豬圓環(huán)病毒3型(PCV3)。PCV1為非致病性病毒；PCV3于2016年首次報(bào)道，其致病力、流行病學(xué)研究、分子生物學(xué)研究等剛處于初步研究階段[1]；PCV2對(duì)豬有致病性，是豬圓環(huán)病毒病的主要病原，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[2]。

目前，接種疫苗是防控豬圓環(huán)病毒病的主要方法。豬圓環(huán)疫苗生產(chǎn)企業(yè)眾多，疫苗質(zhì)量參差不齊，因豬圓環(huán)病毒病對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失[3]，疫苗質(zhì)量在出廠前十分重要。不同生產(chǎn)企業(yè)評(píng)判圓環(huán)疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不同，免疫動(dòng)物后抗體水平檢測(cè)作為評(píng)價(jià)疫苗質(zhì)量的重要指標(biāo)。由于非洲豬瘟疫情給養(yǎng)殖業(yè)帶來的重大影響，實(shí)驗(yàn)豬來源受限以及經(jīng)濟(jì)方面考量，許多生產(chǎn)企業(yè)將圓環(huán)疫苗免疫小鼠后的抗體水平作為評(píng)價(jià)疫苗出廠前的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)之一。本研究建立了檢測(cè)小鼠血清中PCV2抗體的ELISA方法，并研制出了ELISA檢測(cè)試劑盒，可用于小鼠血清中PCV2抗體水平檢測(cè)和PCV2疫苗質(zhì)量評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 重組桿狀病毒CP08株由國(guó)藥集團(tuán)動(dòng)物保健股份有限公司研發(fā)中心實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG(Sigma公司)，新西蘭大白兔(購自湖北省疾病預(yù)防控制中心)，超速離心機(jī)(Beckman)等。

1.2 PCV2 Cap蛋白的表達(dá)與純化 將重組桿狀病毒CP08株按照0.5 MOI接種到Sf9細(xì)胞中，27 ℃培養(yǎng)72～96 h，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，經(jīng)CsCl密度離心[4]純化后進(jìn)行SDS-PAGE電泳和電鏡分析。

1.3 PCV2 Cap蛋白兔多抗的制備 PCV2 Cap蛋白常規(guī)免疫健康家兔[5]，待兔血清中PCV2抗體 ELISA檢測(cè)效價(jià)達(dá)1∶1000，即可采血分離血清。分離的血清通過辛酸-硫酸銨沉淀法進(jìn)行純化，獲得所需抗 PCV2 Cap蛋白純化多抗。

1.4 試劑盒的研制

1.4.1 反應(yīng)條件的確定 純化的PCV2 Cap蛋白兔多抗經(jīng)系列稀釋包被酶標(biāo)板，結(jié)合不同稀釋濃度的PCV2 Cap蛋白，按照方陣滴定方法[6]確定PCV2 Cap蛋白兔多抗和PCV2 Cap蛋白最佳包被濃度。對(duì)ELISA封閉液、酶標(biāo)二抗稀釋度、底物顯色液及終止液進(jìn)行優(yōu)化[7]。

1.4.2 試劑盒的組裝 根據(jù)1.4.1中優(yōu)化后的反應(yīng)條件組裝試劑盒，該試劑盒由96孔抗原檢測(cè)板、陽性和陰性對(duì)照血清、羊抗小鼠IgG酶標(biāo)二抗、顯色液A和B、終止液和10倍濃縮洗滌液組成。

1.4.3 判定標(biāo)準(zhǔn)的確定 選用間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)檢測(cè)血清抗體陰性小鼠血清50份，用組裝的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算陰陽性值的臨界點(diǎn)。

1.4.4 敏感性、特異性和比較試驗(yàn) 選取6份不同的PCV2抗體陽性小鼠血清，進(jìn)行倍比稀釋，檢測(cè)所制備試劑盒的敏感性；分別對(duì)陰性小鼠血清、PRRSV、CSFV、PEDV及PRV陽性小鼠血清進(jìn)行檢測(cè)，判斷試劑盒的特異性；取100份小鼠血清樣本用本研究試劑盒和IFA方法分別進(jìn)行檢測(cè)，分析符合率。

1.4.5 試劑盒重復(fù)性和保存期試驗(yàn) 取3個(gè)不同批次的試劑盒，每批5個(gè)，分別檢測(cè)PCV2陽性小鼠血清和陰性小鼠血清，計(jì)算批內(nèi)及批間變異系數(shù)(CV)。將試劑盒置2～8 ℃保存，不同時(shí)間取樣檢測(cè)保存期。

1.4.6 試劑盒應(yīng)用效果評(píng)估 選取10周齡SPF小鼠50只，用本公司研制的PCV2桿狀病毒載體滅活疫苗(CP08株)及三種商品化疫苗(進(jìn)口PCV2基因工程疫苗和國(guó)產(chǎn)全病毒滅活疫苗1及國(guó)產(chǎn)全病毒滅活疫苗2)進(jìn)行常規(guī)免疫，每種疫苗免疫10只小鼠，留10只小鼠做空白對(duì)照，免疫后28 d采血，用本研究試劑盒對(duì)免疫小鼠血清進(jìn)行ELISA檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCV2 Cap蛋白表達(dá)、純化與鑒定 將表達(dá)的PCV2 Cap蛋白經(jīng)超濾濃縮，氯化銫密度梯度離心純化，經(jīng)SDS-PAGE鑒定，在28 kD左右可見條帶(圖1)；經(jīng)銅網(wǎng)負(fù)染色，電鏡下可見大量的病毒樣顆粒(圖2)。

M： Marker; 1： 樣品1; 2： 樣品2; 3： 陰性對(duì)照

圖2 PCV2 Cap蛋白電鏡(負(fù)染，25000×)

2.2 PCV2 Cap蛋白兔多抗制備 PCV2 Cap蛋白經(jīng)3次免疫新西蘭大白兔，血清PCV2 Cap蛋白抗體效價(jià)達(dá)1∶4000，分離血清經(jīng)辛酸硫酸銨純化，電泳結(jié)果見圖3。

M： Marker; 1： 純化PCV2 Cap蛋白兔多抗

2.3 試劑盒研制

2.3.1 反應(yīng)條件的確定 確定PCV2 Cap蛋白兔多抗最佳包被濃度為4 μg/mL，每孔100 μL，4 ℃孵育過夜，封閉液1% BSA，每孔200 μL，37 ℃封閉2 h后包被抗原，PCV2 Cap蛋白抗原最佳包被濃度為2 μg/mL，每孔100 μL，4 ℃孵育過夜，一抗1∶100稀釋，每孔100 μL，37 ℃反應(yīng)60 min，二抗最佳稀釋度為1∶2000，每孔100 μL，37 ℃反應(yīng)60 min，顯色液A和B每孔各50 μL，顯色10 min，2 mol/L的硫酸終止，酶標(biāo)儀OD450 nm讀數(shù)。

2.3.2 判定標(biāo)準(zhǔn)的確定 使用本試劑盒檢測(cè)經(jīng)IFA檢測(cè)抗體陰性健康小鼠血清50份，求其平均 OD450nm值0.152；標(biāo)準(zhǔn)差=0.061；按臨界值=陰性樣品平均值+3×標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算，其臨界值為0.335。所以待檢血清OD450nm值≥0.335判為陽性，待檢血清OD450nm值<0.274判為陰性。在0.274≤OD450nm<0.335范圍內(nèi)，為可疑，需進(jìn)行第二次檢測(cè)，如還在此區(qū)間判為陰性。

2.3.3 敏感性、特異性和比較試驗(yàn)結(jié)果 6份陽性小鼠血清ELISA檢測(cè)結(jié)果均為陽性， ELISA檢測(cè)最高稀釋倍數(shù) (ELISA效價(jià)) 可達(dá)1∶16000，結(jié)果見表1；試劑盒對(duì)陰性小鼠血清和4份豬其他病毒抗體陽性小鼠血清(PRRSV、CSFV、PEDV、PRV)的ELISA檢測(cè)結(jié)果均為陰性，特異性良好；100份小鼠血清樣本的檢測(cè)結(jié)果顯示，本研究試劑盒和IFA方法的總符合率為96%(96/100)，結(jié)果見表2。

表1 試劑盒檢測(cè)小鼠血清結(jié)果

表2 ELISA試劑盒與IFA檢測(cè)方法符合率

2.3.4 重復(fù)性和保存期試驗(yàn) 取3個(gè)不同批次的試劑盒，每批5個(gè)，分別檢測(cè)PCV2陽性小鼠血清和陰性小鼠血清，批內(nèi)變異系數(shù)為2.28%～4.17%，批間變異系數(shù)為4.27%～6.02%。保存期試驗(yàn)結(jié)果表明，2～8 ℃保存15個(gè)月穩(wěn)定。

2.3.5 試劑盒應(yīng)用效果評(píng)估 檢測(cè)結(jié)果顯示，不同疫苗免疫28日小鼠血清的PCV2抗體陽性率均在100%，結(jié)果見表3。依據(jù)免疫小鼠后抗體水平，CP08組抗體水平最高，進(jìn)口組次之，國(guó)產(chǎn)組1抗體水平最低；依據(jù)免疫小鼠后各組抗體均勻性，各疫苗免疫組產(chǎn)生抗體一致性良好，國(guó)產(chǎn)組1均勻最好，進(jìn)口組產(chǎn)生抗體均勻性稍差；各免疫組與對(duì)照組相比，差異極顯著。結(jié)果見圖4和表3。

****表示P<0.0001，差異極顯著

表3 不同疫苗人工免疫小鼠血清效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

PCV2抗體檢測(cè)的常用方法有病毒中和試驗(yàn)(SN)、間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)和免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)(IPMA)。SN、IFA和IPMA試驗(yàn)均需要結(jié)合細(xì)胞及病毒培養(yǎng)來進(jìn)行檢測(cè)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，對(duì)操作人員要求高，不適合推廣和普及[8]。Cap蛋白是 PCV2 病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，該蛋白成為基因工程疫苗首選抗原，是檢測(cè)該病毒特異性抗體的理想靶抗原[9-10]。

本研究利用兔多抗捕獲包被法建立了一種檢測(cè)小鼠血清PCV2抗體的方法，并組裝形成試劑盒。研究結(jié)果表明，試劑盒靈敏度和特異性良好，可重復(fù)性強(qiáng)，2～8 ℃保存15個(gè)月穩(wěn)定。應(yīng)用該試劑盒對(duì)PCV2疫苗免疫后的小鼠血清進(jìn)行PCV2抗體檢測(cè)，檢測(cè)效果良好。當(dāng)前，各疫苗生產(chǎn)企業(yè)對(duì)于豬圓環(huán)疫苗產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)評(píng)判不同，免疫動(dòng)物后檢測(cè)其抗體水平作為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)之一；目前，市場(chǎng)已有商品化檢測(cè)豬圓環(huán)抗體試劑盒在售，均為檢測(cè)豬血清中圓環(huán)抗體；由于非洲豬瘟疫情的影響導(dǎo)致動(dòng)物來源困難以及經(jīng)濟(jì)方面的考量，許多圓環(huán)疫苗生產(chǎn)企業(yè)將免疫小鼠檢測(cè)其血清抗體水平作為圓環(huán)疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的評(píng)判方法。本研究為圓環(huán)疫苗生產(chǎn)企業(yè)提供一種便捷的檢測(cè)方法及產(chǎn)品，用以評(píng)判免疫小鼠后血清抗體水平，對(duì)于圓環(huán)疫苗銷售前質(zhì)量檢測(cè)提供一種參考指標(biāo)。同時(shí)，本研究試劑盒中的二抗替換為抗豬IgG，可用于檢測(cè)豬血清中豬圓環(huán)病毒抗體。本研究制備的檢測(cè)小鼠血清中豬圓環(huán)抗體ELISA試劑盒，可作為疫苗生產(chǎn)企業(yè)評(píng)判圓環(huán)疫苗免疫小鼠后抗體水平的檢測(cè)產(chǎn)品，為檢測(cè)小鼠血清PCV2抗體提供一種快速便捷方法，對(duì)于當(dāng)前疫苗生產(chǎn)企業(yè)具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[11]。