吳珊珊 李 妍

1.內(nèi)蒙古自治區(qū)國際蒙醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010065；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)藥品檢驗研究院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010

清咽六味散由丁香、甘草、木香、訶子、玉簪花和石膏等六味藥材組成，主要功效為理肺，清咽，蒙醫(yī)臨床多用于治療外感咳嗽，失音聲啞，咽喉腫痛等病癥，現(xiàn)收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·蒙藥分冊》，收載項目為制法、性狀、檢查、功能主治等[1-2]。未見文獻對清咽六味散的顯微鑒別特征進行研究，已有文獻[3-5]報導(dǎo)了清咽六味散中丁香、甘草、木香、訶子的薄層鑒別方法。本課題參照《中國藥典》等相關(guān)文獻對清咽六味散進行了顯微鑒別研究，并展開了進一步的薄層鑒別研究，為提高清咽六味散的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，更好地控制其內(nèi)在質(zhì)量提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 DM3000 顯微鏡 (徠卡公司)；LEI-CAMP5 顯微鏡(徠卡公司)；TLC Visualizer薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)(杭州漢澤科技有限公司)；KQ-500DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Mettler AE-100型電子天平(萬分之一，梅特勒-托利多儀器有限公司)；Sartorius ME 5型電子天平(百萬分之一，賽多利斯貿(mào)易有限公司)；JD200-2型電子天平(千分之一，沈陽龍騰電子儀器有限公司)；DHG-9145A型鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；雙槽層析缸(上海信誼儀器廠)。

1.2 材料 丁香酚對照品(批號：110725-201716)、甘草對照藥材(批號：120904-201620)、山奈酚對照品(批號：110861-201612)均來自中國食品藥品檢定研究院；2個廠家3批次清咽六味散樣品(批號：151023、140372、140520)；薄層板：預(yù)制硅膠G板、預(yù)制硅膠GF254板(煙臺化學(xué)工業(yè)研究所；青島海洋化工廠分廠)，規(guī)格：100 mm × 200 mm、200 mm × 200 mm。所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別 取本品，置顯微鏡下觀察：花粉粒微黃色，極面觀呈三角形(圖1A)[6]；木纖維成束，周圍薄壁細(xì)胞中含草酸鈣方晶(圖1B)[7]；菊糖多見，表面呈放射狀紋理(圖1C)[8]；石細(xì)胞散在，淡黃色或鮮黃色，呈類長方形、長條形或不規(guī)則形，有的略分支或一端稍尖凸，直徑18～50 μm，孔溝細(xì)密而清晰，不規(guī)則分叉(圖1D)；花粉粒多破碎，完整者多呈橢圓形，外壁具網(wǎng)狀紋理，長徑100～150 μm(圖1E)；不規(guī)則片狀結(jié)晶無色，有平直紋理(圖1F)[9]。

A.丁香花粉粒；B.甘草木纖維成束且周圍薄壁細(xì)胞含草酸鈣方晶；C.木香菊糖；D.訶子石細(xì)胞；E.玉簪花花粉粒；F.石膏不規(guī)則片狀結(jié)晶無色圖1 清咽六味散顯微鑒別特征圖

2.2 丁香的薄層色譜鑒別 按清咽六味散處方比例折算，取粉末2 g，加乙醚5 mL，振搖數(shù)分鐘，濾過，濾液作為供試品溶液；取除丁香藥材外其他五味藥材粉末，按處方比例混合均勻，按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液；取丁香酚對照品，加乙醚制成每1 mL含16 μL的溶液，作為對照品溶液；照薄層色譜法(《中國藥典》2015版通則0502)試驗，吸取以上三種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(9∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰[8,10]。在供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照在相應(yīng)的位置上無斑點，表明專屬性強，如圖2。按確定的方法，考察了2個不同廠家的預(yù)制薄層板在室溫條件下(溫度：20 ℃，濕度：29%)的分離情況，結(jié)果兩種硅膠G板均能達(dá)到較好的分離效果；對低溫高濕條件下(溫度：6 ℃，濕度：58%)的耐用性進行考察，結(jié)果顯示，該方法對不同溫度、不同濕度的耐用性較好，如圖3。

1.陰性對照(缺丁香)；2.供試品(批號：151023)；3.模擬處方樣品；4.丁香酚對照品圖2 清咽六味散丁香TLC圖(青島預(yù)制板，溫度20 ℃，濕度29%)

1.陰性對照(缺丁香)；2.供試品(批號：151023)；3.模擬處方樣品；4.丁香酚對照品；5.供試品(批號：140372)；6.供試品(批號：140520)；A.煙臺預(yù)制板，溫度20 ℃，濕度29%；B.青島預(yù)制板，溫度6 ℃，濕度58%圖3 不同薄層板和溫濕度下清咽六味散中丁香TLC圖

2.3 甘草的薄層色譜鑒別 按清咽六味散處方比例折算，取粉末6 g，分別加乙醚40 mL，加熱回流1 h，濾過，棄去醚液，藥渣加甲醇30 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水40 mL使溶解，用正丁醇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用水洗滌3次，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇5 mL使溶解，作為供試品溶液[10-11]；將除甘草藥材外其他五味藥材粉末，按處方比例混合均勻，按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液；取甘草對照藥材1 g，按供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2015版通則0502)試驗，吸取以上三種溶液各2 μL，分別點于同一用1%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15∶1∶1∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%的硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈(365 nm)下檢視[10]。在供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上主要有4個相同的黃色熒光斑點，陰性對照在相應(yīng)的位置上無斑點，表明專屬性強，如圖4。按確定的方法，考察了2個不同廠家的預(yù)制薄層板在室溫條件下(溫度：21 ℃、濕度：29%)的分離情況，結(jié)果兩種硅膠G板均能達(dá)到較好的分離效果；對低溫高濕條件下(溫度：4 ℃，濕度：51%)的耐用性進行考察，結(jié)果顯示，該方法對不同溫度、不同濕度的耐用性較好，如圖5。

1.陰性對照(缺甘草)；2.供試品(批號：151023)；3.供試品(批號：140372)；4.甘草對照藥材；5.供試品(批號：140520)圖4 清咽六味散甘草TLC圖(青島預(yù)制板，溫度21 ℃，濕度29%)

1.供試品(批號：151023)；2.供試品(批號：140372)；3.供試品(批號：140520)；4.甘草對照藥材；A.煙臺預(yù)制板，溫度21 ℃，濕度29%；B.煙臺預(yù)制板，溫度4 ℃，濕度51%圖5 不同薄層板和溫濕度下清咽六味散中甘草TLC圖

2.4 玉簪花的薄層色譜鑒別 按清咽六味散處方比例折算，取粉末8.5 g，加甲醇20 mL，25%鹽酸溶液5 mL，水浴加熱回流1 h，取出，放冷，濾過，濾液作為供試品溶液；將除玉簪花藥材外其他五味藥材粉末，按處方比例混合均勻，按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液；取山奈酚對照品適量加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液；照薄層色譜法(《中國藥典》2015版通則0502)試驗，吸取以上三種溶液各5 μL，分別點于同一GF254薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸(2∶1∶0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%三氯化鋁乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈(365 nm)下檢視[12]。在供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照在相應(yīng)的位置上無斑點，表明專屬性強，如圖6。按確定的方法，考察了2個不同廠家的預(yù)制薄層板在室溫條件下(溫度：24 ℃、濕度：30%)的分離情況，結(jié)果兩種硅膠GF254板均能達(dá)到較好的分離效果；對低溫高濕條件下(溫度：6 ℃，濕度：51%)的耐用性進行考察，結(jié)果顯示，該方法對不同溫度、不同濕度的耐用性較好，如圖7。

1.陰性對照(缺玉簪花)；2.供試品(批號：151023)；3.模擬處方樣品；4.山奈酚對照品； 圖6 清咽六味散玉簪花TLC圖(青島預(yù)制板，溫度18℃，濕度31%)

1.供試品(批號：151023)；2.供試品(批號：140372)；3.山奈酚對照品；4.供試品(批號：140520)；A.青島預(yù)制板，溫度24 ℃，濕度30%；B.煙臺預(yù)制板，溫度24 ℃，濕度30%；C.煙臺預(yù)制板，溫度6 ℃，濕度：51%圖7 不同薄層板和溫濕度下清咽六味散中玉簪花TLC圖

3 討論

3.1 顯微鑒別方法的建立 實驗采用顯微鑒別方法對清咽六味散處方中六味藥材均進行了顯微鑒別，結(jié)合查閱相關(guān)文獻，顯微鏡下均觀察到六味藥材的專屬性顯微特征，且清晰可見，可用于清咽六味散的顯微鑒別。

3.2 薄層鑒別方法的建立 清咽六味散中丁香為君藥，藥理活性廣泛[2]，有解毒之功效[13]，其中丁香酚為主要活性成分之一，具有抗菌抗病毒等多種作用[14]；甘草具有豐富的化學(xué)成分，具有止咳平喘、抗炎抗菌等作用；玉簪花具有清熱，解毒，止咳，利咽喉的功能[1]，其中山奈酚為主要活性成分之一，具有并有一定的抗炎、止咳、祛痰作用[15]，故本實驗選擇處方中丁香、甘草和玉簪花3味藥材作為薄層鑒別研究對象，且為首次對處方中玉簪花進行薄層鑒別研究，結(jié)果檢出了處方中的丁香酚、甘草、山奈酚的斑點，并通過了耐用性考察實驗，薄層斑點清晰，陰性無干擾。

清咽六味散作為蒙藥復(fù)方散劑，具有良好的臨床療效，但迄今為止對其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的定性和定量研究并不多，故本實驗建立的顯微和薄層鑒別方法對清咽六味散中各味藥材真?zhèn)魏蛢?yōu)劣的鑒別以及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高均有一定的參考意義。