張 偉 陳雪潔 劉 蓉 肖朝江 沈 磊 田新雁 姜 北*

1.大理大學(xué)藥物研究所，云南 大理 671000；2.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 大理 671000

腎缺血-再灌注損傷(Renal ischemia reperfusion injury，RIRI)是指在腎臟缺血的基礎(chǔ)上恢復(fù)血流后，損傷反而加重的現(xiàn)象，是引發(fā)急性腎損傷和腎衰竭的重要因素[1]。RIRI常見(jiàn)于休克復(fù)蘇、腎臟手術(shù)、腎移植等疾患[2]。研究[3-4]認(rèn)為，缺血-再灌注后自由基大量生成引發(fā)的細(xì)胞氧化損傷，是RIRI后腎功能受損的重要機(jī)制。其中黃嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase，XOD)系統(tǒng)是RIRI時(shí)自由基增加的重要途徑。因此，干預(yù)RIRI時(shí)XOD的水平，減少自由基的生成是減輕RIRI的有效途徑。

核桃(JuglansregiaL.)又名胡桃，為胡桃科(Juglandaceae)胡桃屬(JuglansL.)植物。分心木(Diaphragma juglandis fructus,DJF)，藥材拉丁名為Xeloseptum juglandis，為核桃果實(shí)子房室的木質(zhì)中隔，是漢族、白族、維吾爾族等多個(gè)民族以及民間常用藥材。民間主要用于治療腎虛遺精、遺尿、淋病、血尿、帶下、瀉痢以及失眠多夢(mèng)等多種疾病，有健脾補(bǔ)腎的功效[5]；另外《山西中藥志》中明確記載：“分心木利尿清熱，治淋病尿血，暑熱瀉痢等癥。”現(xiàn)代藥理研究[6-7]結(jié)果顯示，分心木有抑制黃嘌呤氧化酶、抗氧化、抗炎、抑菌等活性。本課題組曾對(duì)云南分心木進(jìn)行了初步的研究，從中分離鑒定了齊墩果酸、柚皮素、兒茶素等近二十個(gè)成分，對(duì)分心木的化學(xué)成分有了初步的認(rèn)識(shí)[7]。鑒于分心木主要用于泌尿系統(tǒng)病癥，但目前有關(guān)分心木對(duì)腎缺血-再灌注損傷是否有保護(hù)作用以及作用機(jī)制尚不清楚，因此本研究擬通過(guò)構(gòu)建大鼠腎臟缺血-再灌注損傷模型，探討云南分心木水提物對(duì)腎臟缺血-再灌注損傷的防治作用，為深入研究開(kāi)發(fā)利用分心木的藥用價(jià)值提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD雄性大鼠，體重180～220 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(湘)2019-0004。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)完全依照大理大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)及大理大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.2 樣品和試劑 實(shí)驗(yàn)用分心木(DJF)材料2019年購(gòu)于云南省大理市漾濞縣。肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、黃嘌呤氧化酶(XOD)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、BCA總蛋白定量測(cè)試盒(貨號(hào)依次為：C011-2-1、CO13-2-1、A002-1-1、A001-3-2、A045-4-2、A003-2-2)購(gòu)于南京建成生物工程研究所；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)購(gòu)于上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 儀器 酶標(biāo)儀(賽默飛世科爾科技有限公司)；CO2孵育箱(日本三洋電器公司)；多樣品組織研磨儀(上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司)；BX53F正置顯微鏡(Olympus公司)；T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)；大鼠獨(dú)立通氣籠(蘇州市蘇杭科技器材有限公司)。

2 方法

2.1 供試樣品的制備 取干燥分心木，粉碎后過(guò)120目篩，得分心木干粉。取干粉200 g置于蒸餾瓶中，加入500 mL蒸餾水，85 ℃回流提取3次，冷卻后過(guò)濾，合并濾液，濃縮凍干(每1 g凍干粉折合生藥12.5 g)得分心木水提物樣品DJF-W。

2.2 建模和分組 40只SD大鼠隨機(jī)分為4組：對(duì)照組、模型組、DJF-W高、低劑量組，每組10只。各組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，進(jìn)行藥物干預(yù)。DJF-W凍干粉以蒸餾水溶解，高劑量組和低劑量組分別給予1 g/kg和0.5 g/kg劑量的 DJF-W 灌胃，連續(xù)用藥14 d，1次/d，灌胃體積為1 mL/100 g，對(duì)照組及模型組給予等量的蒸餾水灌胃。末次灌胃后1 h，采用切除大鼠右腎、夾閉左腎腎動(dòng)脈45 min，再灌注24 h的方法建立RIRI模型[8]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均于術(shù)前禁食12 h，自由飲水。各組動(dòng)物以0.4 mL/100 g劑量的水合氯醛(10%)腹腔注射，待其充分麻醉后，仰臥位固定于加熱鼠板，備皮，消毒，沿腹白線(xiàn)逐層切開(kāi)，游離右側(cè)腎動(dòng)脈并永久性結(jié)扎，切除右腎并鈍性分離左側(cè)腎動(dòng)脈，將模型組及DJF-W高、低劑量組大鼠的左側(cè)腎動(dòng)脈用無(wú)損傷動(dòng)脈夾夾閉45 min；對(duì)照組不進(jìn)行夾閉，逐層縫合、關(guān)閉腹腔、消毒。術(shù)中應(yīng)用37 ℃生理鹽水使大鼠腹腔保持充分的水化。

2.3 取材及生化指標(biāo)測(cè)定 術(shù)后24 h，使用負(fù)壓采血管于大鼠腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置30 min后，3500 rpm離心15 min，收集上層血清，置于-20 ℃?zhèn)溆茫凑赵噭┖姓f(shuō)明書(shū)測(cè)定肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、丙二醛(MDA)的含量及超氧化物歧化酶(SOD)的活力；取腎組織用4 ℃生理鹽水清洗，濾紙吸干后稱(chēng)重，每只大鼠取50 mg左右組織，按1∶9的比例加入0.9%生理鹽水，機(jī)械勻漿，3500 rpm，4 ℃離心10 min后取上清液得10%的腎臟組織勻漿。按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定黃嘌呤氧化酶(XOD)的活性。

2.4 腎組織形態(tài)學(xué)病變檢測(cè) 取相同部位腎組織，經(jīng)生理鹽水沖洗后，常規(guī)取材，脫水，包埋，制片。腎組織切片H&E染色，在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察并描述。

2.5 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)采用mean±SD在表格表示，SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVE)比較組間差異，P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 RIRI模型構(gòu)建情況 進(jìn)行缺血-再灌注處理的腎臟，在該過(guò)程中發(fā)生的變化如圖1，用無(wú)損傷動(dòng)脈夾阻斷腎臟血供時(shí)，腎臟由鮮紅色會(huì)逐漸變?yōu)樽虾谏?5 min后松開(kāi)動(dòng)脈夾，5 min內(nèi)腎臟顏色會(huì)逐步恢復(fù)。

(從左到右依次為：正常、缺血、再灌注時(shí)的腎臟)圖1 大鼠腎臟-再灌注時(shí)腎臟變化情況圖

3.2 各組大鼠血清及腎組織生化指標(biāo)的比較

3.2.1 腎臟功能指標(biāo)變化 DJF-W對(duì)大鼠血清中Cr和BUN水平的影響情況見(jiàn)表1，與對(duì)照組比較，模型組的大鼠血清Cr和BUN水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，DJF-W高劑量可顯著降低Cr和BUN的水平(P<0.05)，低劑量樣品效果相對(duì)較弱，樣品效應(yīng)呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性。

表1 分心木水提取物對(duì)RIRI大鼠模型Cr和BUN水平的影響

3.2.2 氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)變化 分心木水提取物對(duì)大鼠血清中SOD與MDA以及腎組織中XOD活力水平的影響情況見(jiàn)表2，與對(duì)照組相比較，模型組大鼠血清中MDA及腎組織中XOD的水平明顯升高(P<0.01)，且血清中SOD的水平明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，DJF-W高劑量可顯著降低MDA和XOD的水平(P<0.05)，并且可顯著提高SOD的水平(P<0.01)，低劑量樣品效應(yīng)最弱，樣品效應(yīng)呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性。

表2 分心木水提取物對(duì)RIRI大鼠模型XOD、SOD和MDA水平的影響

3.2.3 腎組織形態(tài)學(xué)變化 分心木水提物對(duì)大鼠腎臟形態(tài)學(xué)的影響如圖2，將腎組織切片用H&E染色，于200倍數(shù)視野下進(jìn)行圖片采集，可以明顯看出對(duì)照組腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)清晰，腎小管邊界完整，上皮細(xì)胞排列整齊，緊密。與對(duì)照組相比，模型組缺血45 min再灌注24 h后的腎臟表現(xiàn)為明顯的結(jié)構(gòu)破壞，腎小管上皮細(xì)胞可見(jiàn)腫脹壞死，刷狀緣脫落，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管?chē)?yán)重?cái)U(kuò)張，腎小管細(xì)胞邊界不明顯，腎小管壞死，腎小球嚴(yán)重?fù)p傷。與模型組相比，分心木水提取物有不同程度的減輕RIRI所致的腎損害作用，其中高劑量水提取物的效果最為明顯。

A:對(duì)照組；B:模型組；C:DJF-W(H)組；D:DJF-W(L)組白色箭頭：腎小管結(jié)構(gòu)病變;白色圓圈：炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；白色方框：腎小球損傷圖2 大鼠腎臟病理切片圖(×200，標(biāo)尺：100 μm)

4 討論

腎臟是高血流灌注器官，良好的血液循環(huán)是腎臟組織排除代謝產(chǎn)物和獲取養(yǎng)分的基礎(chǔ)[9]。哺乳動(dòng)物體內(nèi)存在有黃嘌呤脫氫酶(Xanthine dehydrogenase，XDH)，可通過(guò)翻譯后修飾轉(zhuǎn)化為XOD[10]，XDH占機(jī)體XDH和XOD總活力的90%[11]。腎缺血時(shí)，次黃嘌呤和XOD大量堆積[12]，再灌注后，次黃嘌呤在XOD和O2的共同作用下生成大量活性氧(Reactive oxygen species，ROS)[13]。ROS極易與各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分發(fā)生反應(yīng)，干擾氧化應(yīng)激系統(tǒng)引起細(xì)胞氧化損傷[14]，進(jìn)而導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)破壞及功能障礙。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)是機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶之一[4]，丙二醛(Malondialdehyde，MDA)是自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化物反應(yīng)的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物[15]，二者的水平可間接反應(yīng)機(jī)體抗氧化能力和氧化損傷的程度。血清中BUN和Cr是反應(yīng)腎臟功能的敏感性指標(biāo)，可間接反應(yīng)機(jī)體腎功能的強(qiáng)弱。

近年來(lái)，有關(guān)分心木的研究越來(lái)越多，結(jié)果表明分心木提取物具有較強(qiáng)的抗氧化活性[7,16]；其中的酚酸類(lèi)和黃酮類(lèi)化合物均具有良好的體外XOD抑制作用[6]。本文分心木水提物對(duì)RIRI的防護(hù)作用研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組XOD、MDA、Cr和BUN的水平明顯上升，SOD的活性明顯下降，表明大鼠腎臟缺血-再灌注后，機(jī)體出現(xiàn)了氧化損傷，腎臟功能下降；與模型組相比，分心木水提物1 g/kg組的大鼠XOD、MDA、Cr和BUN的水平明顯降低，體內(nèi)SOD活性提高，表明預(yù)處理分心木水提物可通過(guò)抑制XOD的活性干預(yù)ROS的來(lái)源，提高機(jī)體的抗氧化能力，減輕氧化應(yīng)激的損傷，改善RIRI后的腎功能，因此對(duì)腎缺血-再灌注損傷具有一定程度的防治作用。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了分心木傳統(tǒng)上用于腎虛相關(guān)性疾病、主要治療生殖系統(tǒng)與泌尿系統(tǒng)病癥的合理性[17]，可為臨床前研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為后續(xù)分心木的開(kāi)發(fā)利用提供思路。