高洋洋，朱麗丹

大連市第三人民醫(yī)院藥劑部，大連 116033

替米沙坦(telmisartan，TMS)是一種新型的降血壓藥物，能選擇性阻斷血管平滑肌和腎上腺中的血管緊張素Ⅱ與其受體亞型AT1的結(jié)合，從而抑制血管收縮和阻斷醛固酮的分泌，起到降低血壓的作用[1]。臨床研究表明，TMS降低血壓的效果良好，不良反應(yīng)較少，對(duì)靶器官具有保護(hù)作用，可降低患者的發(fā)病率和死亡率，已得到廣泛應(yīng)用[2]。TMS是生物制藥分類系統(tǒng)(biopharmaceutics classification system, BCS)Ⅱ類藥物，具有低溶解度和高滲透性，其在水中的溶解度僅為0.0035 mg·mL-1，口服生物利用度較低，僅為42%[3]。本研究以聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly lactic-co-glycolic acid, PLGA)作為納米粒的載體材料，將替米沙坦制備成PLGA納米粒，并通過實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了其體外細(xì)胞滲透性，為替米沙坦口服新型給藥系統(tǒng)的研究提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-60Tvp型高效液相色譜儀(無(wú)錫創(chuàng)想分析儀器有限公司)；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鄭州科泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；RE-52AA型上海亞榮旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海儀天科學(xué)儀器有限公司)；Malvern Zetasizer Nano ZS90納米粒徑電位分析儀(英國(guó)Malvern公司)；JEM-F200 場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社)；Transwell板(24孔，濾膜孔徑8.0 μm，北京諾博萊德科技有限公司)；96孔板(賽默飛世爾科技有限公司)。

1.2 試藥

替米沙坦原料藥(質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.3%，批號(hào)20200416，常州亞邦制藥有限公司)；替米沙坦對(duì)照品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%，批號(hào)100629-201803，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；聚乳酸-羥基乙酸共聚物(50∶50, 相對(duì)分子質(zhì)量為10 000～20 000，上海源葉生物科技有限公司)；泊洛沙姆188(Poloxamer 188，南京威爾藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司)；二氯甲烷(南京化學(xué)試劑股份有限公司)；DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素溶液、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)溶液、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和Hank平衡鹽溶液(Hank’s buffered salt solution，HBSS)、二甲基亞砜、四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)均購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 TMS-loaded PLGA NPs的制備

采用溶劑蒸發(fā)法[4-5]制備TMS-loaded PLGA NPs。制備工藝：稱取處方量的PLGA和替米沙坦溶解到二氯甲烷5 mL中；另稱取處方量的泊洛沙姆188溶解到50 mL純化水中；在磁力攪拌速度為3 000 r·min-1的條件下，將溶解藥物的二氯甲烷溶液以0.5 mL·min-1的速度滴加到泊洛沙姆188溶液中，并持續(xù)攪拌30 min，得到乳白色混懸液；將該混懸液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾并離心處理，去除上清液，收集沉淀物重新分散到質(zhì)量濃度為100 mg·mL-1的甘露醇溶液中，攪拌均勻，分裝至10 mL西林瓶中，冷凍干燥，即得到TMS-loaded PLGA NPs凍干粉。

2.2 TMS-loaded PLGA NPs處方的優(yōu)化

2.2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇影響TMS-loaded PLGA NPs包封率和粒徑分布的3個(gè)處方因素：以有機(jī)相中替米沙坦的質(zhì)量濃度(x1)、有機(jī)相中PLGA的質(zhì)量濃度(x2)和水相中Poloxamer 188的質(zhì)量濃度(x3)作為考察對(duì)象，通過3因素3水平析因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)[6]對(duì)其處方進(jìn)行評(píng)價(jià)。3個(gè)處方因素的低、中、高水平值見表1。進(jìn)行了27組實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表1 3因素3水平析因設(shè)計(jì)中的變量水平

表2 3因素3水平析因設(shè)計(jì)的結(jié)果

2.2.2方差分析與評(píng)估 將表2中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)輸入到實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件中，結(jié)果見表3、表4。方程模型的P值均小于0.05，說(shuō)明模型擬合度較好；替米沙坦質(zhì)量濃度(x1)、PLGA質(zhì)量濃度(x2)和Poloxamer 188質(zhì)量濃度(x3)對(duì)TMS-loaded PLGA NPs的包封率(y1)和粒徑分布(y2)均具有顯著影響(P<0.05)。通過軟件生成的效應(yīng)面圖可直觀地分析替米沙坦質(zhì)量濃度(x1)、PLGA質(zhì)量濃度(x2)和Poloxamer 188質(zhì)量濃度(x3)與TMS-loaded PLGA NPs的包封率(y1)和粒徑分布(y2)之間的關(guān)系。見圖1、圖2。

表3 x1、x2和x3對(duì)包封率(y1)影響的方差分析結(jié)果

表4 x1、x2和x3對(duì)粒徑分布(y2)影響的方差分析結(jié)果

圖1 替米沙坦質(zhì)量濃度(x1)、PLGA質(zhì)量濃度(x2)和Poloxamer 188質(zhì)量濃度(x3)對(duì)TMS-loaded PLGA NPs包封率(y1)影響的效應(yīng)面圖

在27次實(shí)驗(yàn)中，制備的TMS-loaded PLGA NPs的包封率為21.4%～95.3%。由圖1可見，包封率隨著藥物質(zhì)量濃度和PLGA質(zhì)量濃度的增加而增大，這是由于PLGA質(zhì)量濃度增加可以包載更多的藥物，提高了包封率；包封率隨著Poloxamer 188質(zhì)量濃度的增加而降低，這是由于在外部水相中較高質(zhì)量濃度的表面活性劑會(huì)溶解更多的藥物，不利于藥物包載。擬合得到的多元二次方程為y1=66.56+22.76x1+7.16x2-7.55x3-7.00x1x2-0.72x1x3-0.96x2x3(R2=0.913 2)。

同樣，在27次實(shí)驗(yàn)中，制備的TMS-loaded PLGA NPs的粒徑分布在126.4～237.1 nm范圍內(nèi)。由圖2可知，粒徑大小隨著藥物質(zhì)量濃度、PLGA質(zhì)量濃度和Poloxamer 188質(zhì)量濃度的增加而增大。擬合得到的多元二次方程為：y2=169.59+30.17x1+20.03x2+8.51x3+8.24x1x2+3.06x1x3+0.18x2x3(R2=0.908 7)。

圖2 替米沙坦質(zhì)量濃度(x1)、PLGA質(zhì)量濃度(x2)和Poloxamer 188質(zhì)量濃度(x3)對(duì)TMS-loaded PLGA NPs粒徑分布(y2)影響的效應(yīng)面圖

2.2.3處方優(yōu)化與驗(yàn)證 本研究的目的是使TMS-loaded PLGA NPs的包封率為最大值，粒徑分布為最小值，通過實(shí)驗(yàn)軟件獲得TMS-loaded PLGA NPs的最優(yōu)處方：替米沙坦的質(zhì)量濃度為14.0 mg·mL-1，PLGA的質(zhì)量濃度為35.0 mg·mL-1，Poloxamer 188的質(zhì)量濃度為5.0 mg·mL-1。預(yù)測(cè)可得到包封率為91.4%、粒徑分布為166.3 nm的TMS-loaded PLGA NPs。按該處方制備3批TMS-loaded PLGA NPs進(jìn)行驗(yàn)證，其粒徑分布為(159.6±18.3) nm，包封率為92.1%±1.6%，實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值一致，說(shuō)明建立的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)準(zhǔn)確性較好。

2.3 表征

取TMS-loaded PLGA NPs凍干粉，加入蒸餾水輕輕振搖，粉末完全溶解后形成淡藍(lán)色澄清溶液。取少量樣品溶液，加蒸餾水稀釋，通過Malvern Zetasizer Nano ZS90納米粒徑電位分析儀測(cè)定TMS-loaded PLGA NPs的粒徑分布和Zeta電位，每份樣品檢測(cè)3次，取平均值；另取1滴TMS-loaded PLGA NPs溶液滴加到300目碳涂層的銅網(wǎng)上，使用質(zhì)量濃度為5.0 mg·mL-1的磷鎢酸染色30 s，于紅外燈下?lián)]干水分，在透射電鏡下觀察樣品的微觀形態(tài)。見圖3。

經(jīng)測(cè)定TMS-loaded PLGA NPs的平均粒徑為(162.1±20.7) nm，PDI為0.162±0.002，Zeta電位為(-2.92±0.01) mV。由圖3可見，TMS-loaded PLGA NPs呈圓整球狀，無(wú)聚集，分散性良好，粒徑為50～200 nm，該粒徑范圍具有最佳的細(xì)胞攝取特性，可通過內(nèi)吞作用被腸細(xì)胞吸收[7]。

圖3 TMS-loaded PLGA NPs的透射電鏡照片

2.4 體外藥物釋放

采用透析法比較TMS乙醇溶液與TMS-loaded PLGA NPs的藥物釋放行為[8-9]。操作方法：取TMS-loaded PLGA NPs凍干粉加入蒸餾水中復(fù)溶，取TMS-loaded PLGA NP溶液2 mL和含量相同的TMS乙醇溶液分別加入處理好的透析袋中，兩端夾緊，分別放入體積為200 mL的pH 6.8磷酸鹽緩沖液(含體積分?jǐn)?shù)為0.5%的吐溫80)中，溫度為37 ℃，磁力攪拌速度為100 r·min-1，在固定的時(shí)間(0、5、1、2、4、6、8、10、12、24 h)取出介質(zhì)溶液(并加入等體積的新鮮釋放介質(zhì))，過0.45 μm微孔濾膜，取過濾液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后進(jìn)樣檢測(cè)藥物含量，繪制釋放曲線。見圖4。

圖4 TMS乙醇溶液與TMS-loaded PLGA NPs的體外藥物釋放曲線 (n=6)

由圖4可見，TMS乙醇溶液中的藥物釋放較快，在2 h內(nèi)藥物基本釋放完全；而TMS-loaded PLGA NPs中的藥物表現(xiàn)為持續(xù)、緩慢釋放，最終在24 h時(shí)藥物累積釋放量達(dá)到了87.1%±3.6%。

2.5 細(xì)胞毒性評(píng)估

使用MTT測(cè)定法評(píng)估TMS原料藥和TMS-loaded PLGA NPs對(duì)Caco-2細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性[10]。取復(fù)蘇的Caco-2細(xì)胞接種到DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃環(huán)境中培養(yǎng)14 d，采用質(zhì)量濃度為2.5 mg·mL-1的胰蛋白酶-EDTA溶液消解、離心，取Caco-2細(xì)胞按照1.0×104個(gè)/孔的密度接種到96孔板中，培養(yǎng)48 h。向96孔板中分別加入二甲基亞砜溶液(作為空白對(duì)照)、TMS二甲基亞砜溶液、TMS-loaded PLGA NPs，使藥物的質(zhì)量濃度達(dá)到10、40、80、150、200 μg·mL-1，培養(yǎng)48 h，除去培養(yǎng)基，每孔加入MTT溶液和培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 h，除去培養(yǎng)基，加入DMSO溶解甲臜沉淀，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值，并根據(jù)吸光度值計(jì)算細(xì)胞存活率。結(jié)果見圖5。

圖5 TMS原料藥和TMS-loaded PLGA NPs對(duì)Caco-2細(xì)胞毒性的比較

由圖5可見，在研究的藥物質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，TMS原料藥和TMS-loaded PLGA NPs對(duì)Caco-2細(xì)胞均無(wú)明顯抑制作用，說(shuō)明TMS-loaded PLGA NPs與Caco-2細(xì)胞具有良好的生物相容性。

2.6 Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)研究

由于Caco-2細(xì)胞在形態(tài)上與人小腸上皮細(xì)胞相似，并含有與小腸刷狀緣上皮細(xì)胞相關(guān)的酶[11]，故用Caco-2細(xì)胞單層模型評(píng)價(jià)TMS-loaded PLGA NPs的吸收和外排特性。取復(fù)蘇的Caco-2細(xì)胞接種于DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃環(huán)境中培養(yǎng)14 d，采用質(zhì)量濃度為2.5 mg·mL-1的胰蛋白酶-EDTA溶液消解、離心，按照1.0×104個(gè)/cm2的密度為將Caco-2細(xì)胞接種到Transwell板上，加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)21 d，細(xì)胞發(fā)育良好，經(jīng)檢測(cè)，跨上皮電阻(trans epithelial electric resistance，TEER)值均大于600 Ω·cm-2，可確保Caco-2細(xì)胞單層的完整性。實(shí)驗(yàn)開始前使用預(yù)熱(37 ℃)的空白HBSS洗滌Caco-2細(xì)胞單層3次。在研究頂端到基底外側(cè)(AP→BL)的轉(zhuǎn)運(yùn)中，分別取TMS二甲基亞砜溶液和TMS-loaded PLGA NPs溶液各0.5 mL添加到AP表面，作為供給池，并將HBSS 1.5 mL添加到BL表面，作為接收池；在研究基底外側(cè)到頂端(BL→AP)的轉(zhuǎn)運(yùn)中，分別取TMS二甲基亞砜溶液和TMS-loaded PLGA NPs溶液各1.5 mL添加到BL表面，作為供給池，將HBSS 0.5 mL添加到AP表面，作為接收池，在固定的時(shí)間間隔從接收池中取出200 μL樣品溶液，離心后用HPLC法測(cè)定藥物含量，按照下列公式計(jì)算表觀滲透系數(shù)(apparent permeability coefficient,Papp)和外排比(external ratio，ER)。

Papp=dQ/dt×1/A×1/C0

ER=Papp(BL→AP)/Papp(AP→BL)

其中dQ/dt表示藥物轉(zhuǎn)運(yùn)率，A表示轉(zhuǎn)運(yùn)膜的表面積，C0表示供給池中的藥物初始質(zhì)量濃度，Papp(AP→BL)表示TMS從頂端轉(zhuǎn)運(yùn)到基底外側(cè)的Papp值，Papp(BL→AP)表示TMS從基底外側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)到頂端的Papp值。

研究結(jié)果顯示，TMS-loaded PLGA NPs組的Papp(AP→BL)值為[(9.64±0.42)×10-6] cm·s-1，高于TMS原料藥組的Papp(AP→BL)值[(5.21±0.39)×10-6] cm·s-1；而TMS-loaded PLGA NPs組和TMS原料藥組的Papp(BL-AP)值無(wú)明顯差異，其值分別為[(6.32±0.29)×10-6]和[(6.18±0.34)×10-6] cm·s-1；TMS原料藥組的ER值為1.19，TMS-loaded PLGA NPs組的ER值為0.66，說(shuō)明TMS-loaded PLGA NPs能夠有效提高藥物的滲透性。

3 討論

為提高TMS的溶解度，提高其口服生物利用度，研究人員已將其制備成包括自乳化藥物遞送(self-emulsifying drug delivery system，SEDDS)[12]、固體分散體[13]、環(huán)糊精包合物[14]、納米粒[15]及共晶物[16]等多種新型給藥系統(tǒng)。PLGA是一種可生物降解的高分子材料，在體內(nèi)PLGA的酯鍵水解生成乳酸和羥基乙酸，并進(jìn)一步代謝為二氧化碳和水[17]，目前其作為傷口縫合材料和藥用輔料已被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)使用。以PLGA作為納米粒載體材料制備的納米粒不僅可以增大藥物的溶解度，而且經(jīng)口服后可被腸道集合淋巴結(jié)的M細(xì)胞吸收[18]，能夠逃避P-糖蛋白的識(shí)別作用[19]，促進(jìn)藥物吸收。因此，本研究以PLGA作為納米粒的載體材料，將替米沙坦制備成PLGA納米粒。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，制備的TMS-loaded PLGA NPs粒徑分布為(159.6±18.3)nm，包封率為92.1%±1.6%，呈圓整球狀；體外藥物釋放研究結(jié)果顯示，TMS-loaded PLGA NPs中的藥物呈現(xiàn)持續(xù)緩慢釋放；體外滲透性研究結(jié)果顯示，TMS-loaded PLGA NPs能夠有效提高藥物的滲透性。本研究為后續(xù)的動(dòng)物體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)評(píng)價(jià)奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。