俞 杰，陳衛(wèi)榮，黃 勇

（江蘇省南通市海門區(qū)人民醫(yī)院胸外科，南通 226100）

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)[1]。放療和化療是晚期肺癌患者的常用治療方法，但毒副作用大，長(zhǎng)期使用易使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生抗性，限制了其在臨床中的應(yīng)用[2]。因此，亟需尋找新的副作用小的治療肺癌的藥物。黑加侖是虎耳草科茶藤屬植物黑醋栗的漿果，富含維生素、多酚、酚酸等多種生物活性成分，具有抗氧化、降血壓、抗腫瘤等功效[3-4]。研究顯示，黑加侖水提物可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)抑制人食管癌細(xì)胞株Eca109細(xì)胞的生長(zhǎng)[5]。但目前尚無(wú)黑加侖提取物影響肺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的相關(guān)報(bào)道。

PSMA3基因的反義RNA1（PSMA3-AS1）是一種長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA），其在肺癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)升高。PSMA3-AS1 高表達(dá)與肺癌患者臨床分期、轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良密切相關(guān)，敲低PSMA3-AS1 可降低肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力[6]。因此，本研究旨在探究黑加侖提取物對(duì)肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞周期、凋亡和遷移的影響及其對(duì)PSMA3-AS1的調(diào)控作用，為其新藥研發(fā)和臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑 肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)）。胎牛血清（FBS，浙江天杭生物公司）；RPMI 1640 培養(yǎng)基、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡試劑盒和BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶）；LipofectamineTM2000 試劑盒（美國(guó)Invitrogen 公司）；PSMA3-AS1 過(guò)表達(dá)載體（pcDNA-PSMA3-AS1）、空載體（pcDNA）和PCR 引物（上海生工）；兔抗人Bcl-2、Bax 和GAPDH 抗體（美國(guó)Santa Cruz 公司）；Trizol 試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒（大連寶生物）。

1.2 黑加侖提取物的制備 黑加侖干燥，粉碎后，過(guò)100 目篩。準(zhǔn)確稱取200 g 干燥粉末，以1∶10（g/mL）加70%乙醇，進(jìn)行超聲提取。超聲條件：功率30 kW，溫度37 ℃，提取時(shí)間30 min，提取2次，抽濾，合并濾液。旋轉(zhuǎn)濃縮至10 mL 左右，冷凍干燥。制備100 mg/mL母液，過(guò)濾除菌后置于-20 ℃冰箱中保存，使用時(shí)用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 用含10% FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)A549 細(xì)胞。將對(duì)數(shù)期A549 細(xì)胞接種于6 孔板中（5.0×105個(gè)/孔），用LipofectamineTM2000 脂質(zhì)體法，分別轉(zhuǎn)染pcDNA-PSMA3-AS1、pcDNA。轉(zhuǎn)染6 h 后，更換培養(yǎng)基。再培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞分組和處理 將A549細(xì)胞分為對(duì)照組和不同濃度黑加侖提取物組，其中對(duì)照組細(xì)胞用含10%FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，不同濃度黑加侖提取物組細(xì)胞分別用含5 mg/mL、10 mg/mL、15 mg/mL[7]黑加侖提取物的培養(yǎng)基培養(yǎng)。

轉(zhuǎn)染pcDNA-PSMA3-AS1、pcDNA 的A549 細(xì)胞用含10%FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別記為pcDNA-PSMA3-AS1 組、pcDNA 組。轉(zhuǎn)染pcDNA-PSMA3-AS1、pcDNA 的A549 細(xì)胞用含15 mg/mL黑加侖提取物的培養(yǎng)基培養(yǎng)，并分別記為15 mg/mL 黑加侖提取物+pcDNA-PSMA3-AS1 組、15 mg/mL黑加侖提取物+pcDNA組。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡 將A549細(xì)胞接種于24 孔板中（5.0×104個(gè)/孔），按不同分組處理細(xì)胞，培養(yǎng)24 h 后，收集細(xì)胞。（1）PBS 清洗細(xì)胞2次，加入1 mL 70%乙醇，混勻，4 ℃固定12 h；1 000 r/min 離心5 min，棄上清，加1 mL PBS，重懸細(xì)胞，1 000 r/min 離心5 min，棄上清；加入0.5 mL PI 溶液室溫下避光染色30 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。（2）調(diào)整細(xì)胞密度為5.0×105個(gè)/mL，PBS 清洗細(xì)胞2 次，1 000 r/min離心5 min，棄上清；加入500 μL結(jié)合緩沖液，重懸細(xì)胞；加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室溫下避光孵育15 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 將A549細(xì)胞接種于24 孔板中（5.0×104個(gè)/孔），用200 μL 微量吸液槍頭沿板中軸在單層細(xì)胞劃痕。PBS 洗去劃掉細(xì)胞，測(cè)定劃痕間寬度，記為0 h 寬度。按不同分組處理細(xì)胞，培養(yǎng)24 h 后，再次測(cè)量寬度，記為24 h 寬度，計(jì)算劃痕愈合率。劃痕愈合率（%）=（0 h寬度-24 h寬度）/0 h寬度×100%。

1.7 Western blotting 法檢測(cè)細(xì)胞Bcl-2 和Bax 蛋 白表達(dá) 用RIPA 試劑提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白含量；SDS-PAGE電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉，加入一抗Bcl-2（1∶500）、Bax（1∶500）和GAPDH（1∶1 000）4 ℃孵育過(guò)夜；洗膜，山羊抗兔二抗（1∶2 000）室溫下孵育1 h；洗膜，加顯影液避光顯影，曝光，拍照。采用Image J 軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.8 RT-qPCR 法檢測(cè)PSMA3-AS1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量 用Trizol 試劑提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，在T100 型PCR 儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）上進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 個(gè)循環(huán)。引物序列如下：PSMA3-AS1 上游：5'-AACAGACCATCAGAAGAGAACA-3'，下 游：5'-GAACAGAAACCAGAGCCATACA-3'；GAPDH 上游：5'-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3'，下游：5'-GGAAGATGGTGATGGGATTT-3'。用2-△△Ct法計(jì)算PSMA3-AS1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黑加侖提取物對(duì)A549細(xì)胞周期的影響 與對(duì)照組比較，10 mg/mL、15 mg/mL 黑加侖提取物組A549 細(xì)胞周期G0～G1 期延長(zhǎng)，S 期縮短（均P＜0.05），而G2～M期無(wú)明顯差異（P＞0.05）；5 mg/mL黑加侖提取物組與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；隨著黑加侖提取物濃度的增加，G0～G1期延長(zhǎng)，S期縮短（均P＜0.05），而G2～M期組間無(wú)明顯差異（P＞0.05），見圖1。

圖1 4組A549細(xì)胞周期的比較

2.2 黑加侖提取物對(duì)A549 細(xì)胞凋亡和遷移的影響 與對(duì)照組比較，10 mg/mL、15 mg/mL 黑加侖提取物組A549 細(xì)胞凋亡率升高，劃痕愈合率降低，Bax 蛋白表達(dá)升高，Bcl-2 蛋白表達(dá)降低（均P＜0.05），而5 mg/mL黑加侖提取物組各檢測(cè)指標(biāo)均無(wú)明顯差異（P＞0.05），不同濃度黑加侖提取物組間各檢測(cè)指標(biāo)兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖2。

圖2 4組A549細(xì)胞凋亡率、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)及細(xì)胞遷移能力的比較

2.3 黑加侖提取物對(duì)A549 細(xì)胞中PSMA3-AS1 表達(dá)的影響 對(duì)照組和5 mg/mL、10 mg/mL、15 mg/mL黑加侖提取物組A549 細(xì)胞中PSMA3-AS1 表達(dá)分別為1.00±0.00、0.97±0.05、0.68±0.04 和0.29±0.02（F=290.222，P＜0.05），與對(duì)照組比較，10 mg/mL、15 mg/mL 黑加侖提取物組A549 細(xì)胞中PSMA3-AS1表達(dá)顯著降低（P＜0.05），而5 mg/mL黑加侖提取物組PSMA3-AS1 表達(dá)無(wú)明顯差異（P＞0.05），不同濃度黑加侖提取物組間PSMA3-AS1表達(dá)兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.4 過(guò)表達(dá)PSMA3-AS1 對(duì)黑加侖提取物處理的A549 細(xì)胞周期及PSMA3-AS1 表達(dá)的影響 與pcDNA組比較，15 mg/mL黑加侖提取物+pcDNA組A549細(xì)胞中PSMA3-AS1表達(dá)降低，A549細(xì)胞周期G0～G1 期延長(zhǎng)，S 期縮短（均P＜0.05），G2～M 期無(wú)明顯差異（P＞0.05），而pcDNA-PSMA3-AS1 組A549細(xì)胞中PSMA3-AS1表達(dá)升高（P＜0.05），細(xì)胞周期G0～G1 期縮短，S 期延長(zhǎng)（均P＜0.05），G2～M 期無(wú)明顯差異（P＞0.05）。與pcDNA-PSMA3-AS1 組比較，15 mg/mL 黑加侖提取物+pcDNA-PSMA3-AS1組A549細(xì)胞中PSMA3-AS1表達(dá)降低，細(xì)胞周期G0～G1 期延長(zhǎng)，S 期縮短（均P＜0.05），而G2～M 期無(wú)明顯差異（P＞0.05）。與15 mg/mL 黑加侖提取物+pcDNA組比較，15 mg/mL黑加侖提取物+pcDNA-PSMA3-AS1 組A549 細(xì)胞中PSMA3-AS1 表達(dá)升高，細(xì)胞周期G0～G1 期縮短，S 期延長(zhǎng)（均P＜0.05），而G2～M 期無(wú)明顯差異（P＞0.05），見圖3。

圖3 過(guò)表達(dá)PSMA3-AS1對(duì)黑加侖提取物處理的A549細(xì)胞周期及PSMA3-AS1表達(dá)的影響

2.5 過(guò)表達(dá)PSMA3-AS1 對(duì)黑加侖提取物處理的A549 細(xì)胞凋亡和遷移的影響 與pcDNA 組比較，15 mg/mL黑加侖提取物+pcDNA組A549細(xì)胞凋亡率升高，劃痕愈合率降低，Bax蛋白表達(dá)升高，Bcl-2蛋白表達(dá)降低（均P＜0.05），而pcDNA-PSMA3-AS1組A549 細(xì)胞凋亡率降低，劃痕愈合率升高，Bax 蛋白表達(dá)降低，Bcl-2 蛋白表達(dá)升高（均P＜0.05）。與pcDNA-PSMA3-AS1組比較，15 mg/mL黑加侖提取物+pcDNA-PSMA3-AS1 組A549 細(xì)胞凋亡率升高，劃痕愈合率降低，Bax 蛋白表達(dá)升高，Bcl-2 蛋白表達(dá)降低（均P＜0.05）。與15 mg/mL 黑加侖提取物+pcDNA 組比較，15 mg/mL 黑加侖提取物+pcDNAPSMA3-AS1 組A549 細(xì)胞凋亡率降低，劃痕愈合率升高，Bax 蛋白表達(dá)降低，Bcl-2 蛋白表達(dá)升高（均P＜0.05），見圖4。

圖4 過(guò)表達(dá)PSMA3-AS1對(duì)黑加侖提取物處理的A549細(xì)胞遷移及凋亡的影響

3 討論

黑加侖含有維生素、有機(jī)酸、多酚和礦物質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是天然的保健食品。有報(bào)道稱，1 mg/mL 的黑加侖提取物可抑制肝癌細(xì)胞QCY-7704 生長(zhǎng)[8]。本研究結(jié)果顯示，10 mg/mL、15 mg/mL 的黑加侖提取物可明顯阻滯肺癌細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡，并抑制肺癌細(xì)胞遷移，說(shuō)明黑加侖提取物可抑制肺癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，發(fā)揮一定的抗肺癌作用，具有治療肺癌的潛在價(jià)值。細(xì)胞凋亡是一種程序性死亡過(guò)程，受多種基因的調(diào)控。Bax/Bcl-2是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控分子，其中Bax表達(dá)上調(diào)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而Bcl-2表達(dá)下調(diào)時(shí)則對(duì)細(xì)胞凋亡起抑制作用[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，黑加侖提取物劑呈劑量依賴性地降低A549細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)，而促進(jìn)了Bax蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步從蛋白水平說(shuō)明黑加侖提取物可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡。

作為一種lncRNA，PSMA3-AS1 參與多種腫瘤的發(fā)展。研究顯示，食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）組織中PSMA3-AS1表達(dá)明顯上調(diào)，其高表達(dá)與ESCC患者腫瘤大小、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)，過(guò)表達(dá)PSMA3-AS1 通過(guò)靶向調(diào)控miR-101/EZH2 軸促進(jìn)體外ESCC 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，其可能為ESCC的治療提供新的分子靶點(diǎn)[10]。干擾PSMA3-AS1表達(dá)可有效提高多發(fā)性骨髓瘤異種移植瘤對(duì)卡非佐米的敏感性[11]。敲低PSMA3-AS1 可靶向miR-302a-3p 抑制RAB22A 的表達(dá)，在體內(nèi)、體外降低神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移、增殖和侵襲能力，表明PSMA3-AS1 可作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療和預(yù)后潛在靶標(biāo)[12]。PSMA3-AS1可靶向miR-409-3p促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的侵襲性[13]。本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)PSMA3-AS1可加速肺癌細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)肺癌細(xì)胞遷移，并阻礙肺癌細(xì)胞凋亡，提示PSMA3-AS1對(duì)肺癌的發(fā)展起促進(jìn)作用，其有可能成為肺癌治療的分子靶點(diǎn)；黑加侖提取物可劑量依賴性地降低肺癌細(xì)胞中PSMA3-AS1的表達(dá)，而過(guò)表達(dá)PSMA3-AS1逆轉(zhuǎn)了黑加侖提取物對(duì)肺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期、遷移及凋亡的影響。提示黑加侖提取物可能通過(guò)下調(diào)PSMA3-AS1表達(dá)來(lái)抑制肺癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。

綜上所述，黑加侖提取物可有效阻滯肺癌細(xì)胞周期進(jìn)程，抑制細(xì)胞遷移，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其可能通過(guò)下調(diào)PSMA3-AS1表達(dá)發(fā)揮作用。本組將進(jìn)一步探究黑加侖提取物抗肺癌的作用機(jī)制，并通過(guò)裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其作用。