方龍香，陳曦，黃銖玉，單祥保，邢路暢，張聰,宋超1,2,*

(1. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全環(huán)境因子風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心， 江蘇 無(wú)錫214081；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100141；3. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無(wú)錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214081;4. 江蘇省常州市天寧區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，江蘇 常州213000)

近年來(lái)，隨著中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，集約化程度也越來(lái)越高，由此而引發(fā)的一系列細(xì)菌性疾病也日趨嚴(yán)重。恩諾沙星由于其抗菌譜廣、殺菌和抑菌作用顯著，而被廣泛應(yīng)用于中華絨螯蟹的養(yǎng)殖[1-2]。但是，由于養(yǎng)殖從業(yè)者科學(xué)用藥理論缺乏，安全用藥意識(shí)薄弱，在養(yǎng)殖過(guò)程中濫用抗生素，忽視了因抗生素濫用而引起的養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境的惡化和藥物殘留的問(wèn)題，導(dǎo)致喹諾酮類抗生素在生物體內(nèi)蓄積[3-5]。而且中華絨螯蟹由于其底棲的生活習(xí)性、移動(dòng)緩慢、活動(dòng)范圍小以及濾食的特性，在污染環(huán)境中缺乏回避能力，所以體內(nèi)易蓄積污染物質(zhì)[6-7]。過(guò)量的抗生素不僅會(huì)使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，而且也會(huì)影響水產(chǎn)品的質(zhì)量安全。

相關(guān)研究表明，在蝦、鯉(Cyprinuscarpio)、鮭以及中華絨螯蟹等多種水產(chǎn)品體內(nèi)的各個(gè)組織中檢測(cè)到恩諾沙星的殘留[8-10]，含恩諾沙星的水產(chǎn)品被消費(fèi)者食用后，由于其在人體內(nèi)代謝緩慢，易蓄積在肌肉、肝臟等部位中，恩諾沙星在機(jī)體內(nèi)的長(zhǎng)期蓄積，可能會(huì)引起關(guān)節(jié)或者軟骨損傷，還可能會(huì)引起泌尿系統(tǒng)、消化系統(tǒng)的損害，更嚴(yán)重可能導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的損傷[11-12]。

目前關(guān)于恩諾沙星在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)代謝情況的研究對(duì)象多為魚(yú)類，少部分涉及蝦類、中華鱉(TrionyxSinensis)等其他的水產(chǎn)動(dòng)物[5, 13-15]。由于中華絨螯蟹肝臟組織的脂肪類化合物含量較高且成分復(fù)雜，極易干擾目標(biāo)藥物的檢測(cè)，較少有關(guān)于中華絨螯蟹體內(nèi)可食部位(蟹腿肉、蟹身肉、性腺和肝胰腺)恩諾沙星富集效應(yīng)的研究[16]。本研究以中華絨螯蟹為研究對(duì)象，探究其在不同濃度恩諾沙星暴露下，藥物在其體內(nèi)不同可食部位的富集規(guī)律，以及性別差異對(duì)恩諾沙星蓄積的影響，并觀察主要代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星的生成情況，為恩諾沙星在中華絨螯蟹體內(nèi)的分布、蓄積和遷移規(guī)律提供理論指導(dǎo)，進(jìn)而為國(guó)內(nèi)中華絨螯蟹的健康養(yǎng)殖以及質(zhì)量安全提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

實(shí)驗(yàn)所用的中華絨螯蟹于2019年10月中旬采集于中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心宜興生態(tài)養(yǎng)殖基地，將采集到的螃蟹暫養(yǎng)于玻璃缸(長(zhǎng)39.50 cm×寬28.50 cm×高19.50 cm)中。暫養(yǎng)一周后，選擇規(guī)格整齊、肢體健全以及無(wú)明顯體表外傷的雌雄個(gè)體(公蟹初始平均體重約為120 g，母蟹約為90 g)各60只開(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑及藥品

甲醇、甲酸均為色譜純(購(gòu)于德國(guó)默克生物科學(xué)公司)；提取液(0.1%甲酸乙腈溶液)；Agilent Bond Elu EMR-Lipid增強(qiáng)型脂質(zhì)去除凈化管，EMR-Lipid Polish MgSO4(購(gòu)于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品(純度>99.9%，購(gòu)于Dr. Ehrenstrofer GmbH)，鹽酸環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品(純度>92.3%，購(gòu)于Dr. Ehrenstrofer GmbH)；0.1%甲酸水、0.1%甲酸甲醇、初始流動(dòng)相(0.1%甲酸甲醇∶0.1%甲酸水=2∶8)；HLB固相萃取小柱(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司，60 mg/3 mL)。

1.3 儀器設(shè)備

超高效液相色譜/質(zhì)譜(Waters，美國(guó))；多管式渦旋振蕩器(Henry Troemner，美國(guó))；GL-22 MS高速冷凍離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；Talboys數(shù)顯型多管式漩渦混合器(上海安譜科學(xué)儀器有限公司)；Talboys基本型漩渦混合器(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；離心機(jī)(Sigma，德國(guó))；真空系統(tǒng)(Merck，德國(guó))；AL104分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，暴露實(shí)驗(yàn)分別設(shè)置了空白對(duì)照組(0 μg/L)、低濃度組(50 μg/L)、中濃度組(500 μg/L)和高濃度組(5 000 μg/L)4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)濃度組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，公母蟹分開(kāi)，共24個(gè)玻璃缸。每個(gè)玻璃缸中加入6 L水(養(yǎng)殖用水為戶外曝氣一周以上的除氯水)，分別隨機(jī)放入6只螃蟹。

在每個(gè)缸中放入增氧泵連續(xù)增氧，試驗(yàn)環(huán)境控溫，溫度保持在(23±1)℃，隔3 d換一次水，每次換完水都需要按照初始濃度重新添加藥物，養(yǎng)殖周期共5周。在實(shí)驗(yàn)養(yǎng)殖期間，不投喂任何飼料，每天觀察并記錄各試驗(yàn)缸中螃蟹的打斗和傷亡情況。

1.5 樣品采集

養(yǎng)殖周期為5周，從實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的第1天采集一次中華絨螯蟹樣品，隨后每間隔一周采集一次，在24個(gè)缸中分別隨機(jī)挑選一只螃蟹，仔細(xì)沖洗螃蟹表面，減少表面藥物殘留。用剪刀去殼、去鰓后，將螃蟹的可食部位按照蟹腿肉、蟹身肉、肝胰腺以及性腺分裝于離心管中，-20 ℃保存，待進(jìn)一步處理。

1.6 樣品前處理及測(cè)定

1.6.1 樣品的提取

準(zhǔn)確稱取(2.00±0.01)g的樣品于50 mL離心管中，加入10 mL的提取液(0.1%甲酸乙腈)振蕩混勻，在2 000 r/min的速度下渦旋振蕩10 min，10 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心5 min；取離心后的上清液5 mL到已經(jīng)用5 mL超純水活化后的Agilent Bond Elu EMR-Lipid增強(qiáng)型脂質(zhì)凈化管中，2 000 r/min的速度下渦旋振蕩5 min，在4 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心5 min；將離心后的上清液全部轉(zhuǎn)入裝有1.7 g EMR-Lipid Polish MgSO4離心管中，2 000 r/min的速度下渦旋振蕩5 min，在4 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心5 min。取有機(jī)相(上層)過(guò)0.22 μm有機(jī)相濾膜于10 mL離心管中，若樣品濃度較低時(shí)旋蒸濃縮后再上機(jī)；樣品濃度較高時(shí)稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍內(nèi)再上機(jī)。

1.6.2 儀器操作條件

色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C181.7 μm，2.1 mm×100.0 mm，柱溫設(shè)為40.0 ℃；樣品室溫度設(shè)為10.0 ℃；進(jìn)樣量為5.0 μL。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 液相梯度洗脫程序

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI+)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)。毛細(xì)管電壓為3.5 kV，錐孔電壓為30 V，離子源溫度為150 ℃，脫溶劑氣溫度為450 ℃，脫溶劑氣流速為800 L/Hr，錐孔氣流速為50 L/Hr，碰撞能量為3 V。恩諾沙星和環(huán)丙沙星的定性及定量離子對(duì)質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2，恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的總離子流色譜圖(Total Ions Chromatograph，TIC)和定量離子圖見(jiàn)圖1。

表2 恩諾沙星和環(huán)丙沙星的質(zhì)譜分析條件參數(shù)及保留時(shí)間

圖1 恩諾沙星和環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定量離子圖

考慮實(shí)驗(yàn)過(guò)程中恩諾沙星的濃度隨時(shí)間降解，以上機(jī)濃度為1、5、10、20和50 ng/mL的梯度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線線性良好，回歸系數(shù)均大于0.999 6，實(shí)驗(yàn)前對(duì)空白水樣進(jìn)行恩諾沙星加標(biāo)處理，樣品回收率在81%～112%，以樣品上機(jī)3倍和10倍信噪比(S/N)計(jì)算方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)，檢測(cè)限和定量限值均小于0.2 ng/mL。

1.7 生物富集

生物富集系數(shù)(Bioconcentration factors，BCF)是用來(lái)描述化學(xué)物質(zhì)在生物體累積趨勢(shì)的重要指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，某種抗生素在生物體內(nèi)以及在水中的含量變化基本保持平衡，此時(shí)生物體對(duì)抗生素的富集系數(shù)為：

BCF=Cfs/Cws

式(1)

式中，Cfs表示平衡時(shí)，生物體內(nèi)的藥物含量(mg/kg)；Cws表示平衡時(shí)生物體所在的水環(huán)境中藥物的含量(mg/kg)。

1.8 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及相關(guān)繪圖在Excel 2010軟件中完成，以P<0.05作為差異性顯著水平。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)表示，在進(jìn)行多重比較時(shí)，用*表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 恩諾沙星在中華絨螯蟹可食部位中的富集系數(shù)

從表3可知，當(dāng)中華絨螯蟹暴露在低濃度的恩諾沙星水環(huán)境時(shí)，不同可食部位的富集系數(shù)從大到小依次是蟹腿肉>蟹身肉>性腺>肝胰腺，說(shuō)明在低濃度時(shí)，蟹腿肉和蟹身肉的富集能力最強(qiáng)；當(dāng)暴露在中濃度的水環(huán)境時(shí)，恩諾沙星的富集系數(shù)從大到小依次是蟹身肉>肝胰腺>蟹腿肉>性腺，說(shuō)明中濃度條件下，中華絨螯蟹蟹身肉的富集能力最強(qiáng)；當(dāng)暴露在高濃度的水環(huán)境時(shí)，恩諾沙星在中華絨螯蟹各部位的富集系數(shù)從大到小依次是蟹身肉>性腺>肝胰腺>蟹腿肉，其中蟹身肉和性腺的富集系數(shù)相近，說(shuō)明高濃度組中，蟹身肉和性腺的富集能力較強(qiáng)。由3個(gè)濃度組的結(jié)果綜合可知，恩諾沙星在蟹身肉中的富集能力最強(qiáng)。

表3 不同濃度的恩諾沙星暴露下中華絨螯蟹可食部位的富集系數(shù)

2.2 不同濃度的恩諾沙星暴露下中華絨螯蟹各可食部位藥物殘留隨時(shí)間的變化

由圖2A的結(jié)果可知，試驗(yàn)開(kāi)始1周時(shí)，中華絨螯蟹蟹腿肉中恩諾沙星的殘留量在低、中、高三個(gè)濃度組含量分別是(12.75±1.96)、(79.88±22.88)和(488.52 ±160.72)ng/g。隨著時(shí)間的推移，三個(gè)濃度組恩諾沙星蓄積量逐漸增加，在2周時(shí)達(dá)到最高值，含量分別為(28.38±2.94)、(101.21±28.05)和(746.93±174.39)ng/g，之后殘留濃度逐漸降低。在整個(gè)養(yǎng)殖期間，高濃度組蟹腿肉中恩諾沙星的殘留量相較于低、中濃度組均存在顯著性差異(P<0.05)。

從圖2B的結(jié)果可知，在整個(gè)養(yǎng)殖期間，低濃度組在1周時(shí)中華絨螯蟹身肉中恩諾沙星的蓄積量為(18.76±1.54)ng/g，在2周時(shí)達(dá)到最大值，濃度為(33.02±2.21)ng/g，之后恩諾沙星的含量隨著時(shí)間的推移緩慢下降；中濃度組在1周時(shí)蟹身肉中藥物的殘留量為(72.81±12.28) ng/g，在3周時(shí)達(dá)到最大值，濃度為(185.04±16.58) ng/g，之后蓄積的含量隨時(shí)間的變化緩慢降低并維持在一個(gè)穩(wěn)定的范圍內(nèi)；高濃度組蟹身肉的蓄積量在1周時(shí)為(671.47±79.94) ng/g，在2周時(shí)達(dá)到最大，為(1 013.90±45.74) ng/g，然后維持在一個(gè)穩(wěn)定的范圍內(nèi)。從整個(gè)養(yǎng)殖周期來(lái)看，低、中濃度組除了在2周時(shí)有顯著性差異外(P<0.05)，其他時(shí)間段低濃度組和中濃度組無(wú)顯著性差異(P>0.05)；高濃度組在整個(gè)養(yǎng)殖期間均顯著高于低、中濃度組(P<0.05)。

圖2C的結(jié)果可知，低、中濃度組在1周時(shí)，中華絨螯蟹性腺中恩諾沙星的殘留量分別為(10.53±1.92)和(55.07±2.32) ng/g，在4周時(shí)含量同時(shí)達(dá)到最高，分別為(22.22±4.50)和(143.48±21.30) ng/g；高濃度組在1周時(shí)，性腺中恩諾沙星的殘留量為(399.15±28.05) ng/g，在2周時(shí)達(dá)到最大值，為(1 008.00±116.62) ng/g，之后恩諾沙星的殘留量逐漸降低。在整個(gè)養(yǎng)殖周期內(nèi)，除4周時(shí)低濃度組和中濃度組之間有顯著性的差異(P<0.05)，其他養(yǎng)殖時(shí)間低濃度組和中濃度組中恩諾沙星的殘留量均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；高濃度組與低中濃度組之間均存在顯著性差異(P<0.05)。

由圖2D的結(jié)果可知，低濃度處理組在1周時(shí)，中華絨螯蟹肝胰腺中恩諾沙星的殘余量達(dá)到最高，為(24.15±10.03) ng/g，之后含量逐漸降低；中濃度處理組在1周時(shí)肝胰腺中藥物的殘留量為(65.63±14.24) ng/g，在3周時(shí)達(dá)到最大值，為(312.12±48.59) ng/g，之后逐漸降低；高濃度處理組在1周時(shí)藥物蓄積達(dá)到最大值，含量為(1 035.70±106.35) ng/g，之后肝胰腺中恩諾沙星的殘留量降低至穩(wěn)定的水平，藥物含量大約在578.81～667.28 ng/g范圍內(nèi)。高濃度處理組在整個(gè)養(yǎng)殖期間均顯著高于低、中濃度處理組(P<0.05)；而低濃度組和中濃度組在2周和3周時(shí)有顯著性差異(P<0.05)，其他時(shí)間均無(wú)顯著性變化(P>0.05)。

圖2 不同濃度的恩諾沙星暴露下中華絨螯蟹蟹腿肉(A)、蟹身肉(B)、性腺(C)和肝胰腺(D)恩諾沙星含量隨時(shí)間的變化

整個(gè)養(yǎng)殖期間，在不同濃度恩諾沙星的水環(huán)境中，中華絨螯蟹4個(gè)可食部位均檢測(cè)到恩諾沙星的主要代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星的生成。其中中華絨螯蟹性腺和肝胰腺這兩個(gè)部位生成的環(huán)丙沙星量較高，蟹腿肉和蟹身肉在不同濃度組下生成環(huán)丙沙星的量相當(dāng)。由于肝胰腺中環(huán)丙沙星的生成量略高于性腺，因此圖3選擇肝胰腺來(lái)分析環(huán)丙沙星的生成情況。分析可知，低濃度組在整個(gè)養(yǎng)殖期間，中華絨螯蟹肝胰腺中環(huán)丙沙星的生成量都很低，含量在0～0.51 ng/g之間；而中、高濃度組隨著時(shí)間的推移，肝胰腺中環(huán)丙沙星的生成量逐漸增加，在5周時(shí)達(dá)到最大值，分別為(209.6±78.62)和(3 207.11±952.84)ng/g。而高濃度組顯著高于低、中濃度組(P<0.05)，低濃度組與中濃度組之間在整個(gè)養(yǎng)殖期間都無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

圖3 中華絨螯蟹肝胰腺中環(huán)丙沙星的生成情況

從整體來(lái)說(shuō)，中華絨螯蟹暴露在含有不同濃度的恩諾沙星水環(huán)境中，其可食部位中恩諾沙星的蓄積量隨著時(shí)間的推移先升高后降低，與恩諾沙星的暴露濃度呈正相關(guān)關(guān)系。另外，在不同濃度的恩諾沙星暴露下，蟹腿肉和蟹身肉的富集系數(shù)從大到小依次是低濃度處理組>中濃度處理組>高濃度處理組，性腺的富集系數(shù)從小到大為低濃度處理組>高濃度處理組>中濃度處理組，肝胰腺的富集系數(shù)從大到小為中濃度處理組>高濃度處理組>低濃度處理組。總的來(lái)說(shuō)，當(dāng)中華絨螯蟹暴露在不同濃度的恩諾沙星的水環(huán)境時(shí)，抗生素濃度越低，其在中華絨螯蟹體內(nèi)的富集能力越強(qiáng)。

2.3 中華絨螯蟹體內(nèi)恩諾沙星含量的性別差異

根據(jù)圖4的結(jié)果可知，處理組中母蟹和公蟹體內(nèi)恩諾沙星的蓄積量隨著暴露時(shí)間的增加，呈現(xiàn)出先升高后逐漸降低的趨勢(shì)；母蟹和公蟹在相同濃度恩諾沙星的暴露下，體內(nèi)可食部位(蟹腿肉、蟹身肉、性腺和肝胰腺)總的蓄積量隨時(shí)間的變化都呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，其中低濃度組和中濃度組中公蟹的殘留量在整個(gè)養(yǎng)殖期間基本都大于母蟹，而高濃度組中，1周和2周時(shí)，公蟹的殘留量大于母蟹，后3周母蟹大于公蟹。因此整體上來(lái)看，公蟹和母蟹的恩諾沙星殘留存在一定的性別差異，但是差異不顯著(P>0.05)，說(shuō)明恩諾沙星的暴露濃度和暴露時(shí)間可能會(huì)影響公母蟹體內(nèi)恩諾沙星的蓄積量，但是具體的差異以及差異機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

圖4 中華絨螯蟹體內(nèi)恩諾沙星含量的性別差異

由圖5的結(jié)果可知，低濃度組中，公蟹和母蟹體內(nèi)環(huán)丙沙星的生成量隨著養(yǎng)殖時(shí)間的增加無(wú)明顯變化，且公蟹和母蟹體內(nèi)可食部位環(huán)丙沙星總的生成量在整個(gè)養(yǎng)殖期間相差不多；中濃度組和高濃度組中，公蟹和母蟹體內(nèi)可食部位環(huán)丙沙星總生成量隨著養(yǎng)殖時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，其中公蟹體內(nèi)環(huán)丙沙星的生成量大于母蟹，這種差異在第1周表現(xiàn)最為明顯。因此，公蟹和母蟹體內(nèi)環(huán)丙沙星的生成量在低濃度恩諾沙星暴露下無(wú)明顯差別，但在中、高濃度暴露下存在一定的性別差異。

圖5 中華絨螯蟹體內(nèi)環(huán)丙沙星生成的性別差異影響

3 討論

3.1 恩諾沙星在中華絨螯蟹體內(nèi)的富集效應(yīng)

中華絨螯蟹暴露在不同濃度恩諾沙星的水環(huán)境時(shí)，其體內(nèi)不同可食部位(蟹腿肉、蟹身肉、性腺和肝胰腺)中恩諾沙星的蓄積量隨著養(yǎng)殖時(shí)間的推移，先升高后逐漸降低，并且各組恩諾沙星的殘留量與暴露濃度正相關(guān)，呈現(xiàn)一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。在整個(gè)養(yǎng)殖周期中，低濃度組中華絨螯蟹各可食部位中恩諾沙星的殘留量為蟹身肉>蟹腿肉>性腺>肝胰腺；而中濃度組和高濃度組各可食部位中藥物的殘留量大致為蟹身肉>肝胰腺>性腺>蟹腿肉。此外，對(duì)照組中恩諾沙星的殘留順序大致為蟹身肉>蟹腿肉>性腺>肝胰腺，結(jié)果與低濃度組相同。吳光紅等[17]研究了恩諾沙星在中華絨螯蟹體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)，結(jié)果顯示中華絨螯蟹在肌肉注射恩諾沙星后，0～2 h之內(nèi)，4個(gè)組織中的藥物濃度關(guān)系是鰓>血液>肌肉>肝胰腺[17]。由此可見(jiàn)，在養(yǎng)殖生產(chǎn)過(guò)程中，中華絨螯蟹體內(nèi)恩諾沙星主要富集的可食部位是蟹身肉，肝胰腺僅次于蟹身肉。

本次實(shí)驗(yàn)在低、中、高三個(gè)濃度暴露下，恩諾沙星在中華絨螯蟹體內(nèi)不同可食部位的蓄積量與暴露濃度正相關(guān)。根據(jù)結(jié)果可知，高濃度處理組與低、中濃度處理組之間差異較大，但不呈倍數(shù)關(guān)系。說(shuō)明暴露濃度越大，恩諾沙星在中華絨螯蟹體內(nèi)的蓄積量就越大。當(dāng)中華絨螯蟹對(duì)恩諾沙星的蓄積達(dá)到平衡時(shí)，隨著養(yǎng)殖時(shí)間的增加，其體內(nèi)的恩諾沙星的殘留值不再增加，會(huì)穩(wěn)定在一個(gè)濃度范圍內(nèi)。低濃度組中的中華絨螯蟹由于暴露濃度較小，母蟹和公蟹的存活率相對(duì)較高；中、高濃度組由于暴露濃度較大，養(yǎng)殖期間存在螃蟹死亡的現(xiàn)象，公蟹之間打斗蠶食的現(xiàn)象也比較嚴(yán)重，很多公蟹的蟹腿不完整。并且中、高濃度組在養(yǎng)殖后期，體內(nèi)的部分器官發(fā)生病變，性腺和肝胰腺都發(fā)生不同程度的萎縮，其代謝能力下降。低濃度組各個(gè)可食部位恩諾沙星的殘留量在整個(gè)養(yǎng)殖期間都小于恩諾沙星殘留的限定標(biāo)準(zhǔn)。因此，在中華絨螯蟹養(yǎng)殖過(guò)程中使用恩諾沙星時(shí)，應(yīng)綜合考慮養(yǎng)殖環(huán)境和養(yǎng)殖密度，盡量減小養(yǎng)殖水體中藥物的濃度，控制在50 ng/mL左右，這樣可以盡量減少恩諾沙星在中華絨螯蟹體內(nèi)的殘留，從而保障水產(chǎn)品的質(zhì)量安全。

關(guān)于不同性別中華絨螯蟹對(duì)恩諾沙星蓄積的影響，根據(jù)結(jié)果可知，恩諾沙星在中華絨螯蟹體內(nèi)的蓄積情況與其性別關(guān)系不密切，公蟹和母蟹之間的差異不顯著(P>0.05)。在研究恩諾沙星在中華絨螯蟹體內(nèi)的代謝情況時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)公蟹和母蟹大劑量肌肉注射藥物時(shí)，公蟹和母蟹體內(nèi)的恩諾沙星半衰期存在明顯的差異，母蟹吸收和消除顯著快于公蟹[18]。說(shuō)明，環(huán)境中恩諾沙星的超過(guò)一定的暴露劑量，其藥物在中華絨螯蟹體內(nèi)的蓄積情況存在性別差異。

3.2 恩諾沙星的主要代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星的生成情況

有研究表明，恩諾沙星在魚(yú)[19]、蝦[20]等的體內(nèi)均可以脫去一個(gè)乙基而生成環(huán)丙沙星，且存在種間差異。潘明軒等[20]研究中國(guó)對(duì)蝦(Fenneropenaeuschinensis)通過(guò)肌肉注射恩諾沙星，觀察其在體內(nèi)的代謝情況，在檢測(cè)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)環(huán)丙沙星的存在[21]。Intorre等[22]研究鱸(Lateolabraxjaponicas)體內(nèi)恩諾沙星的代謝情況時(shí)，在鱸的血液和肝臟中也檢測(cè)到了環(huán)丙沙星的存在。

在本次暴露實(shí)驗(yàn)的研究過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)在中華絨螯蟹體內(nèi)也檢測(cè)到環(huán)丙沙星的生成。低濃度組中，環(huán)丙沙星的生成量較少，與空白組相當(dāng)，說(shuō)明在低濃度狀態(tài)下，恩諾沙星僅有很少的一部分脫去乙基代謝成環(huán)丙沙星，相較于其他高等生物、代謝率較低。中華絨螯蟹屬低等生物，因此新陳代謝可能比較緩慢，也可能與體內(nèi)缺乏某種乙基肝微粒體酶有關(guān)[17]。在中、高濃度組，由于使用的恩諾沙星的濃度要大于正常使用量，所以恩諾沙星在中華絨螯蟹體內(nèi)可能呈現(xiàn)被動(dòng)吸收的狀態(tài)。過(guò)量的恩諾沙星對(duì)于中華絨螯蟹來(lái)說(shuō)是一種外來(lái)刺激物，因此機(jī)體為了保護(hù)自身，會(huì)通過(guò)鰓、觸角腺等排泄器官將多余的恩諾沙星排出體內(nèi)或者轉(zhuǎn)移到肝胰腺等器官將其降解，來(lái)降低藥物對(duì)機(jī)體的刺激[12]。這也解釋了肝胰腺部位檢測(cè)出的環(huán)丙沙星含量較高的原因，說(shuō)明肝胰腺是恩諾沙星代謝的主要部位[23]。

關(guān)于螃蟹的性別差異對(duì)環(huán)丙沙星生成的影響，由結(jié)果可知，低濃度暴露條件下，公蟹和母蟹生成環(huán)丙沙星的量差異不大；中、高濃度條件下，公蟹體內(nèi)環(huán)丙沙星的生成量高于母蟹，但差異不顯著(P>0.05)。說(shuō)明在恩諾沙星暴露濃度較高的情況下，存在一定的性別差異，但具體的差異以及差異機(jī)制需要進(jìn)一步的探究[21]。

4 結(jié)論

恩諾沙星在中華絨螯蟹體內(nèi)不同可食部位殘留的情況與暴露濃度的劑量存在一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，且恩諾沙星主要蓄積在蟹身肉部位，肝胰腺僅次于蟹身肉。根據(jù)富集系數(shù)的結(jié)果可知，富集能力較強(qiáng)的是蟹身肉。此外，性別差異對(duì)恩諾沙星在中華絨螯蟹體內(nèi)的蓄積存在一定的影響，但差異不顯著。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)組中華絨螯蟹可食部位均檢測(cè)到環(huán)丙沙星的存在，且環(huán)丙沙星的生成量同樣與恩諾沙星的暴露濃度正相關(guān)，其中肝胰腺是環(huán)丙沙星的主要生成部位。中華絨螯蟹的性別差異對(duì)環(huán)丙沙星的生成存在一定的影響，具體的情況有待進(jìn)一步探究。