劉衍素, 楊靜, 范艷珠, 沈迪, 孫若磊, 鈕文俊, 方光戰(zhàn)*

(1.四川護理職業(yè)學院,成都610100；2.中國科學院成都生物研究所,成都610041)

焦慮作為一種情緒反應或對未來威脅的預期，是由于個體經歷一定的有害刺激后，從而導致其行為和意識狀態(tài)的改變(Iftikhar.，2020)。不良的早期生活經歷可能會破壞與應激反應、情緒行為和情緒狀態(tài)有關的神經系統(tǒng)的正常發(fā)育，造成后期更易罹患如焦慮癥、情感障礙等精神疾病，從而對心理健康產生長期不良影響(Lukkes.，2009)。通過斷乳后即進行社會隔離的動物模型，可模擬人類早期(如童年時期)遭受的不良經歷，特別是社會忽視，而焦慮和攻擊行為增多則是該時期表現(xiàn)出的顯著行為特征之一(Chapple.，2005；Pesonen.，2010；劉朝寶等，2016；程廣超等，2017)。例如，斷乳后即開始經歷隔離飼養(yǎng)的雄性大鼠在高架十字迷宮(elevated plus maze，EPM)測試中，表現(xiàn)出進入開放臂的時間和次數(shù)均減少，表明焦慮行為增加(Parker & Morinan，1986；Wright.，1991；Weiss.，2004)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

購自成都達碩實驗動物有限公司的PD21雄性CD-1小鼠(=40)，隨機平分為2組：社會群居組(SG組，每籠5只)和社會隔離組(SI組，單籠單只)。動物均采用小鼠獨立通氣籠具(ZJ-4，馮氏，中國蘇州)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)2周后進行EPM行為測試。動物處于固定光照周期(08∶00 開燈，20∶00 關燈)、溫度和相對濕度分別保持在(22±1)℃和(60±10)%的飼養(yǎng)房中，可自由獲取食物和水。所有實驗在夜相且暗紅光(<2 lux)照明條件下進行。實驗流程按中國科學院成都生物研究所實驗動物倫理委員會相關要求進行。

1.2 動物手術

將小鼠放入誘導盒內使用異氟烷進行深度麻醉后，通過立體定位儀(51603，Stoelting，美國)進行頭部固定，連接氣體麻醉系統(tǒng)(VMR，Matrx，美國)維持麻醉，然后從前后、左右2個維度調平顱骨表面。根據(jù)小鼠腦圖譜，分別在雙側的內側前額葉、內側杏仁核及腹內側下丘腦植入6個由單根不銹鋼絲(直徑0.8 mm)組成的LFP電極(圖1)。相應電極位置坐標如圖1所示，其中，前后方向(anteroposterior，AP)以前囟為參考，前囟前為正，前囟后為負；左右方向(mediolateral，ML)以中縫為參考，左側為正，右側為負；深度方向(dorsoventral，DV)以硬腦膜為參考，下方為負：(1)內側前額葉(mPFC)：AP，+1.94 mm；ML，±0.4 mm；DV，-2.1 mm。(2)內側杏仁核(MeA)：AP，-1.34 mm；ML，±1.75 mm；DV，-5.4 mm。(3)腹內側下丘腦(VMH)：AP，-1.94 mm；ML，±0.6 mm；DV，-5.8 mm。將參考電極(C)植入小腦(AP，-6.5 mm；ML，0 mm)上方；電極埋植區(qū)前后共植入4個微型不銹鋼螺釘用于固定，使用牙托水泥封固，以確保電極的穩(wěn)固性。動物恢復7 d后再行后續(xù)實驗。共獲得31只小鼠的有效實驗數(shù)據(jù)(SI組16只，SG組 15只)。

圖1 電極位置分布及對應的10 s局部場電位特征波形

1.3 數(shù)據(jù)采集

EPM實驗是利用動物對高懸敞開環(huán)境的恐懼和對新異環(huán)境的探究特性，形成一種“規(guī)避-探究”的行為沖突，以模仿人類的焦慮狀態(tài)，是經典的焦慮行為測試，具有簡單、快速、結果重復性好等優(yōu)點(羅丹妮，2019)。該范式利用進入開放臂次數(shù)和百分比、開放臂停留時間和百分比等指標評價動物的焦慮水平。EPM高出地面50 cm，由2個開放臂(長30 cm×寬5 cm)、2個閉合臂(長30 cm×寬5 cm×高15 cm)和1個連接4個臂的中央?yún)^(qū)(長5 cm×寬5 cm)組成。

實驗前CD-1小鼠適應測試環(huán)境3 h。連接腦電信號采集系統(tǒng)(RM6280，成儀，成都)并在飼養(yǎng)籠內適應15 min，待信號穩(wěn)定后將小鼠頭朝開放臂放入中央?yún)^(qū)，讓其自由探索任意區(qū)域。使用位于EPM上方的紅外攝像頭記錄5 min行為視頻；同時連續(xù)同步記錄腦電(electroencephalogram,EEG)信號，采集參數(shù)設置為500 Hz低通濾波、50 Hz陷波、1 000 Hz采樣率。每個被試測試后，用75%乙醇對測試裝置進行清潔除味，方可進行下一被試的實驗；動物出場順序隨機。實驗完成后，用程控電刺激儀(YC-2，成儀，成都)并以0.4 mA的電流強度，對植入電極的每個腦區(qū)進行電流損毀8 s，用組織學方法驗證記錄電極位點，排除非目標位點的數(shù)據(jù)。

2 數(shù)據(jù)處理

2.1 焦慮行為數(shù)據(jù)分析

利用開源的事件記錄和分析軟件(BORIS)進行行為視頻分析。參數(shù)為進入開放臂次數(shù)(open arm entry，OE)、開放臂停留時間(open arm time，OT)、進入閉合臂次數(shù)(closed arm entry，CE)、閉合臂停留時間(closed arm time，CT)、進入中央?yún)^(qū)次數(shù)(central area entry，CEE)、中央?yún)^(qū)停留時間(central area time，CET)、在開放臂或中央?yún)^(qū)頭向下探究次數(shù)、閉合臂內后腿直立次數(shù)、進入開放臂次數(shù)百分比[OE%=OE/(OE+CE)×100%]、開放臂停留時間百分比[OT%=OT/(OT+CT)×100%]。進入開放臂次數(shù)及停留時間越少反映小鼠焦慮水平越高。

2.2 LFP數(shù)據(jù)分析

LFP數(shù)據(jù)經0.5～80 Hz帶通濾波后，提取小鼠位于開放臂遠端(即將開放臂從中間位置劃分，遠離中心區(qū)的一端)和閉合臂遠端(即將閉合臂從中間位置劃分，遠離中心區(qū)的一端)無偽跡的2 s數(shù)據(jù)段。利用Welch方法(漢明窗，頻譜分辨率為0.5 Hz)分別計算每段數(shù)據(jù)的δ、θ、α、β和γ節(jié)律的絕對功率譜。得到每種節(jié)律、每個組別、每個腦區(qū)(左右側內側前額葉、左右側內側杏仁核、左右側腹內側下丘腦)、每種臂型(開放臂和閉合臂)對應的絕對功率譜，并進行統(tǒng)計分析。

2.3 統(tǒng)計分析

分別用Shapiro-Wilk檢驗和Levene檢驗檢測數(shù)據(jù)分布的正態(tài)性和方差齊性。由于閉合臂內后腿直立次數(shù)的數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布和方差同質性假設，采用Mann-Whitney檢驗檢測2組間的行為響應差異，其余的行為數(shù)據(jù)均使用單因素方差分析統(tǒng)計。

對于絕對功率譜，采用因子“組別”“腦區(qū)”和“臂型”進行三因素重復測量方差分析探討主效應和交互效應。若交互效應顯著，采用簡單或簡單-簡單效應分析。采用最小顯著差異法(LSD)進行事后檢驗，對違反球形檢驗假設的數(shù)據(jù)進行Greenhouse-Geisser校正。所有統(tǒng)計分析均在SPSS 23.0中進行。顯著性水平設置為α=0.05。

3 實驗結果

3.1 行為結果

SG組小鼠進入開放臂的次數(shù)高于SI組(=10.326，=0.003)，差異顯著；進入閉合臂(=2.373，=0.134)和中央?yún)^(qū)的次數(shù)(=0.156，=0.696)在2組間的差異不顯著(圖2：A)。SG組小鼠在開放臂的停留時間顯著高于SI組(=4.268，=0.048)，而在閉合臂的停留時間(=0.461，=0.503)在2組間的差異不顯著，SI組在中央?yún)^(qū)的停留時間顯著高于SG組(=4.697，=0.039)(圖2：B)；SG組在開放臂或中央?yún)^(qū)頭向下探究的次數(shù)高于SI組(=4.37，=0.045)，差異顯著；在閉合臂內后腿直立的次數(shù)(=80，=31，=0.112)在2組間的差異不顯著(圖2：C)。SG組小鼠進入開放臂次數(shù)百分比高于SI組(=23.472，<0.001)，差異極顯著；而開放臂停留時間百分比在2組間的差異不顯著(=3.145，=0.087；圖2：D)。

圖2 焦慮行為不同參數(shù)統(tǒng)計結果

3.2 LFP結果

開放臂和閉合臂的近端與遠端對應的LFP數(shù)據(jù)相似，僅匯報遠端結果：δ、θ、α、β和γ節(jié)律中，“臂型”和“腦區(qū)”的主效應均極顯著，且閉合臂對應的絕對功率譜大于開放臂，差異均顯著，但“組別”的主效應不顯著(表1)。

表1 不同EEG節(jié)律的方差分析結果

事后多重比較顯示：(1)對δ節(jié)律而言，左側內側前額葉的絕對功率譜大于右側內側前額葉和雙側內側杏仁核以及左側腹內側下丘腦，右側內側前額葉的絕對功率譜大于左側內側杏仁核及右側腹內側下丘腦，雙側腹內側下丘腦的絕對功率譜大于雙側內側杏仁核，差異均顯著(圖3：A)。(2)對θ節(jié)律而言，左側內側前額葉的絕對功率譜大于右側內側前額葉和雙側腹內側下丘腦以及雙側內側杏仁核；右側內側前額葉及雙側腹內側下丘腦的絕對功率譜大于雙側內側杏仁核，差異均顯著(圖3：B)。(3)對α節(jié)律而言，左側內側前額葉的絕對功率譜大于右側內側前額葉和雙側腹內側下丘腦以及雙側內側杏仁核；右側內側前額葉和左側腹內側下丘腦的絕對功率譜大于雙側內側杏仁核；右側腹內側下丘腦的絕對功率譜大于右側內側杏仁核，差異均顯著(圖3：C)。(4)對β節(jié)律而言，左側內側前額葉的絕對功率譜大于右側內側前額葉和雙側腹內側下丘腦以及雙側內側杏仁核；右側內側前額葉大于右側腹內側下丘腦以及雙側的內側杏仁核，差異均顯著(圖3：D)。(5)對γ節(jié)律而言，雙側內側前額葉的絕對功率譜大于雙側腹內側下丘腦以及雙側內側杏仁核；左側腹內側下丘腦的絕對功率譜大于右側內側杏仁核，差異均顯著(圖3：E)。

圖3 獨籠(左)和合籠(右)飼養(yǎng)條件下不同腦區(qū)、不同臂型條件下的各節(jié)律絕對功率譜

3.3 電極位置的組織學驗證結果

經過電損毀后的電極植入?yún)^(qū)域的DAPI染色結果(電損毀所在區(qū)域均在紅色標記區(qū)域內)與腦圖譜比較結果(圖4)顯示，與小鼠腦圖譜進行對比，發(fā)現(xiàn)電極植入位置與腦圖譜所示位置基本一致，說明電極位置正確。

圖4 內側前額葉(A)、內側杏仁核(B)和腹內側下丘腦(C)雙側腦區(qū)的電極位置驗證結果

4 討論

4.1 隔離飼養(yǎng)導致CD-1小鼠的焦慮水平上升

由于嚙齒類動物具有嗜暗性，喜歡在黑暗的環(huán)境中活動(比如閉合臂)，但面對新環(huán)境(比如開放臂)易產生一定的好奇心去探究，EPM范式主要依靠兩者之間的沖突產生焦慮心理進行測試。本研究發(fā)現(xiàn)CD-1小鼠焦慮行為在不同飼養(yǎng)方式間具有不同的行為表現(xiàn)，即SG組小鼠對應的焦慮行為相關參數(shù)(如OE%、OT%、OE%)均顯著高于SI組，說明其焦慮水平較低，面對新環(huán)境的探究行為多，能夠克服對高懸敞開環(huán)境的恐懼；反之，SI組小鼠進入開放臂次數(shù)以及停留時間少，反映其焦慮水平高、探究性行為少。同時，SG組小鼠在開放臂或中央?yún)^(qū)頭向下探究次數(shù)顯著多于SI組，表明SG組小鼠在非保護區(qū)域內的探索活動更多、更大膽，與其焦慮水平較低相關。本結果與既往嚙齒類動物的研究一致(Lukkes.，2009；Chang & Gean，2019)，即經過社會隔離飼養(yǎng)的CD-1小鼠表現(xiàn)出更高的焦慮水平。

4.2 不同腦區(qū)的EEG節(jié)律特征受小鼠所處位置調制

將CD-1小鼠停留在EPM的臂型和外周生理信號結合起來探究行為表現(xiàn)和生理標記之間的聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)低外周狀態(tài)(生理表現(xiàn)為穩(wěn)定的呼吸周期以及正常的心率，可理解為非焦慮狀態(tài))只出現(xiàn)在閉合臂的遠端區(qū)域，而在靠近中心區(qū)的閉合臂區(qū)域沒有觀察到這種狀態(tài)(Okonogi.，2018)。因本實驗沒有進行外周生理信號的采集、且近端區(qū)域的LFP結果與遠端相似，故選取2個臂型的遠端區(qū)域進行結果匯報與討論。與以往研究一致，本研究發(fā)現(xiàn)閉合臂對應的絕對功率譜均顯著大于開放臂，尤其是與表達焦慮狀態(tài)等情緒相關的θ節(jié)律(Pape.，2005)。分析大鼠從EPM的閉合臂走向開放臂時的LFPs，發(fā)現(xiàn)θ節(jié)律的絕對功率譜在閉合臂內會突然增大，在離開閉合臂進入開放臂時顯著下降，表明θ節(jié)律參與大鼠對開放臂的探索行為，θ節(jié)律功率的增大會抑制探索行為，而減少會增加(Lu.，2018)。

調控焦慮行為的環(huán)路較為復雜，集中于情緒邊緣系統(tǒng)，包括內側前額葉、海馬、杏仁核和下丘腦等。本研究發(fā)現(xiàn)，相對于SG組而言，SI組小鼠大部分腦區(qū)對應的EEG各節(jié)律的絕對功率譜在開放臂或閉合臂均具有上調趨勢(因未達到統(tǒng)計顯著性，結果未匯報)。這一結果與慢性應激造成小鼠杏仁核基底外側核LFP的EEG各節(jié)律的絕對功率譜均具有上調趨勢的結果一致(姜方潔等，2016)，亦與運動疲勞后大鼠探索行為減少、焦慮樣行為增多、并伴有海馬CA1區(qū)θ節(jié)律活動增強(孫麗娜等，2021)以及人類兒童低頻EEG節(jié)律的功率譜隨不利生活環(huán)境上調的結果一致(Knyazev，2012)。但是本研究發(fā)現(xiàn)的EEG各節(jié)律的絕對功率譜在SG組和SI組之間的差異并不顯著，這可能與當前研究采用的隔離時長(2周)較短有關。此外，我們發(fā)現(xiàn)LFP各節(jié)律的絕對功率譜均表現(xiàn)為內側前額葉最大，這可能與該腦區(qū)高度參與小鼠的情緒反應及認知過程(Zheng & Zhang，2015)、前額葉的皮層調控作用(Adhikari.，2010；Lesting.，2011)、各腦區(qū)之間協(xié)同響應(Jinks & McGregor，1997；Felix-Ortiz.，2013，2016)等認知活動相關。未來研究可考慮延長隔離時長或者采用雙光子顯微鏡等空間分辨率更高的技術手段進一步研究隔離飼養(yǎng)對大腦神經活動模式或相關腦區(qū)樹突棘的形態(tài)和結構的影響，進而探討動物焦慮行為與大腦功能之間的因果聯(lián)系。