楊巧，譚松，張?jiān)聥?，傅金鐘，陳?jìng)峰

(1.中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所，成都610041；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100049；3.圭爾夫大學(xué)，圭爾夫ON N1G 2W1，加拿大)

靜止代謝率(resting metabolic rate，RMR)是指動(dòng)物維持生理穩(wěn)態(tài)的最低能量消耗(Biro & Stamps，2008；孫儒泳等，2019)。在內(nèi)溫動(dòng)物和外溫動(dòng)物中，RMR分別指代的是基礎(chǔ)代謝率(basal metabolic rate，BMR)和標(biāo)準(zhǔn)代謝率(standard metabolic rate，SMR)，即成年動(dòng)物處于非繁殖、靜止和消化吸收后的狀態(tài)時(shí)，在熱中區(qū)(內(nèi)溫動(dòng)物)或特定溫度(外溫動(dòng)物)測(cè)得的最低代謝速率。無(wú)論外溫動(dòng)物或內(nèi)溫動(dòng)物，RMR在個(gè)體、種群或物種水平上都存在顯著差異，且與生長(zhǎng)、存活等適合度成分關(guān)聯(lián)密切(Biro & Stamps，2010；Auer.，2015；Pettersen.，2016；Arnold.，2021)。因而探究這些差異的形態(tài)、行為、生活史、系統(tǒng)發(fā)育方面的原因一直是動(dòng)物生理生態(tài)學(xué)、進(jìn)化生理學(xué)的研究重點(diǎn)。

RMR應(yīng)該與心臟、肝臟、腎臟、小腸等高耗能器官的質(zhì)量顯著正相關(guān)(Daan.，1990；Hammond & Diamond，1997；Koteja，2000；Ksiazek.，2009)。代謝能力更強(qiáng)的有機(jī)體可以負(fù)荷更高的持續(xù)能量支出(如每日能量支出、持續(xù)代謝率或者最大代謝率)，但它們同時(shí)須承受更高的維持代價(jià)(即RMR)(Careau.，2008)。按照形態(tài)功能適應(yīng)的原則，更高的持續(xù)能量支出需要更強(qiáng)大的高耗能器官(主要用于食物同化過(guò)程)與之匹配(又稱“攝食增量假說(shuō)”)。這個(gè)假說(shuō)預(yù)測(cè)，在相關(guān)選擇作用下，更大的高耗能器官需要更高的RMR以維持其基礎(chǔ)運(yùn)行。該預(yù)測(cè)在內(nèi)溫動(dòng)物中得到較普遍的支持。盡管小鼠的小腸、肝臟、腎臟和心臟總重只占體質(zhì)量的17%，但卻貢獻(xiàn)了個(gè)體間RMR 52%的差異(Konarzewski & Diamond，1995；Ksiazek.，2004)。此外，人工選擇BMR更高或食物攝入量更多的小鼠品系會(huì)導(dǎo)致小腸、肝臟、腎臟和心臟的比重增加(Selman.，2001；Ksiazek.，2004)?？鄢w質(zhì)量的效應(yīng)，布氏田鼠的BMR和心臟、肝臟、腎臟以及盲腸干重顯著正相關(guān)(Song & Wang，2006)。在 22種鳥(niǎo)類中，心臟和腎臟的組合相對(duì)質(zhì)量也解釋了其BMR 50%的變化(Daan.，1990)。然而，該假說(shuō)很少在外溫脊椎動(dòng)物研究中進(jìn)行驗(yàn)證，已有的少數(shù)研究結(jié)論也不一致(Biro & Stamps，2010)。

與器官形態(tài)特征不同，生理特征具有較強(qiáng)的可塑性。一般認(rèn)為RMR的可重復(fù)性為0.3～0.4。因此，單次測(cè)定往往會(huì)與其真實(shí)值有較大偏離(Careau & Garland，2015)。進(jìn)化生理學(xué)家極力主張采用重復(fù)測(cè)量的研究范式，結(jié)合隨機(jī)回歸模型分解生理特征的個(gè)體間和個(gè)體內(nèi)方差及其相關(guān)性(Roche.，2016；Careau，2017)。然而，在過(guò)往RMR與器官大小的研究中，還未見(jiàn)該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)方法的應(yīng)用。

中華蟾蜍是東亞地區(qū)演化最為成功的兩棲類之一，分布在20°～50°N，海拔分布從太平洋島嶼延伸至青藏高原(Zhan & Fu，2011；Lu.，2021)。在外溫脊椎動(dòng)物中具有較強(qiáng)的代表性。本研究擬從野外采集中華蟾蜍成年個(gè)體，重復(fù)測(cè)定RMR 3次，利用馬爾可夫-蒙泰卡羅雙變量混合線性模型(MCMCglmm)(Hadfield，2010)，探究RMR和高耗能器官相對(duì)質(zhì)量的個(gè)體間相關(guān)性。預(yù)測(cè)扣除體質(zhì)量影響后，中華蟾蜍的RMR和小腸、肝臟、腎臟和心臟正相關(guān)，支持“攝食增量假說(shuō)”。

1 研究方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年中華蟾蜍為在繁殖季節(jié)采自川西山區(qū)多個(gè)海拔樣點(diǎn)(雄性27只，雌性19只)。動(dòng)物捕獲后運(yùn)送至中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所動(dòng)物房飼養(yǎng)。動(dòng)物房?jī)?nèi)溫度控制在20 ℃±1 ℃，光周期設(shè)定為12 h∶12 h(08∶00—20∶00開(kāi)燈)。動(dòng)物單籠飼養(yǎng)在長(zhǎng)35.5 cm×寬25 cm×高15 cm的塑料盒內(nèi)，盒內(nèi)放置1塊濕潤(rùn)的海綿提供水分，以及1塊U形瓦片用于躲藏。飼喂蟾蜍的主要食物是沾有鈣粉(Exo Terra)的黃粉蟲(chóng)，每 2 d喂食1次。此外，每周給蟾蜍飼喂蟋蟀1次(2～3只)。所有蟾蜍均在實(shí)驗(yàn)室馴化3個(gè)月以上。所有動(dòng)物操作均按照中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所動(dòng)物福利委員會(huì)的要求執(zhí)行。

1.2 呼吸代謝測(cè)定

RMR采用開(kāi)放式呼吸代謝儀(TSE Systems，德國(guó))在21 ℃環(huán)境下測(cè)定(Tan.，2021)。代謝測(cè)定前后均測(cè)量動(dòng)物體質(zhì)量(精確到0.1 g)。實(shí)驗(yàn)測(cè)定前，動(dòng)物被轉(zhuǎn)移到900 mL的亞力克材質(zhì)的圓柱形呼吸室中適應(yīng)2 h。呼吸室內(nèi)均放置10 cm×10 cm濕紙巾以防止動(dòng)物在測(cè)定過(guò)程中脫水。代謝測(cè)定時(shí)，首先利用氣體流速控制器(G246)將壓縮空氣的氣體流速控制在200 mL·min。然后，氣流開(kāi)關(guān)(G244)將穿過(guò)呼吸室的氣流與高氯酸錳的干燥柱連接(去除其中的水汽)，再將干燥過(guò)的氣流導(dǎo)入O和CO分析裝置中(S104氧氣分析儀和QS151氧氣分析儀)。因?yàn)橹腥A蟾蜍為夜行性動(dòng)物，選擇在20∶30—06∶30測(cè)定RMR。代謝儀每批測(cè)定5只動(dòng)物，每次耗時(shí)5 h。所有個(gè)體測(cè)定重復(fù)3次，每次測(cè)定個(gè)體的順序保持一致。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用TSE Systems配備的專用軟件進(jìn)行采集。RMR以測(cè)定期內(nèi)5 min內(nèi)連續(xù)、最低耗氧速率的平均值計(jì)算。同時(shí)計(jì)算呼吸熵(CO生成和O消耗的比例)用于推斷其有氧代謝的底物利用狀態(tài)(Withers，2001)。

1.3 器官形態(tài)測(cè)定

代謝測(cè)定結(jié)束后，采用MS222(0.2%M/V)深度麻醉中華蟾蜍(鑷子夾擠后腿肌肉無(wú)條件反射)。隨即分離各內(nèi)臟器官(心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、性腺)和胴體，并將各器官間的結(jié)締組織剝離干凈。消化道用清水清理內(nèi)容物后，分割成大腸、小腸和胃。各器官用濾紙吸干水分后，用鋁箔紙包裹放置于干燥箱中，在65 ℃下干燥直至質(zhì)量不再變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0和R 4.0.3進(jìn)行分析。胴體干重和RMR均采用對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換使其符合正態(tài)分布(Shapiro-Wilk檢驗(yàn))。采用一般線性模型分析性別和總干重(待分析的目標(biāo)器官?zèng)]有被包括在總干重中)對(duì)各器官干重的影響，其中固定效應(yīng)包括性別、總干重、性別和總干重的交互作用。單變量混合線性模型用于分析重復(fù)測(cè)定的SMR和呼吸熵，固定效應(yīng)設(shè)置為性別、總干重、性別和總干重的交互作用，個(gè)體標(biāo)簽設(shè)定為隨機(jī)效應(yīng)。隨機(jī)效應(yīng)的顯著性基于最大似然法進(jìn)行檢驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 中華蟾蜍各器官相對(duì)干重的性別差異

中華蟾蜍雌雄個(gè)體存在二型性，雌性各器官的絕對(duì)干重均大于雄性(圖1：A)。除去體質(zhì)量影響后，雌性的脾臟、腎臟干重顯著大于雄性(<0.05)，雄性的心臟、肺臟干重顯著大于雌性(<0.05)，而肝臟、胃、小腸、大腸、消化道和胴體的性別間差異不顯著(>0.05；圖1：B；表1)。

表1 一般線性模型分析性別和總干重(不包含因變量器官)對(duì)中華蟾蜍各器官干重的影響

圖1 中華蟾蜍各器官絕對(duì)干重(A)和用干體質(zhì)量校正后的相對(duì)干重(B)

2.2 性別和體質(zhì)量對(duì)RMR的影響及其可重復(fù)性

總干重顯著影響RMR(<0.001)，但對(duì)性別和重復(fù)測(cè)定的時(shí)序沒(méi)有影響(>0.05；表2；圖2)。呼吸熵也不受性別和重復(fù)測(cè)定的時(shí)序影響(>0.05；表2)。RMR和呼吸熵的重復(fù)性分別為0.321和0.201。

表2 單變量混合線性模型分析中華蟾蜍靜止代謝率和呼吸熵

圖2 中華蟾蜍靜止代謝率與總干重的關(guān)系(A)及重復(fù)測(cè)定(B)

2.3 器官干重與RMR的相關(guān)性

MCMCglmm分析結(jié)果顯示，在個(gè)體水平上，總干重校正的RMR和器官大小都無(wú)顯著相關(guān)性(>0.05；表3；圖3)。

圖3 中華蟾蜍靜止代謝率殘差與各器官質(zhì)量殘差的相關(guān)性

表3 MCMCglmm雙變量混合線性模型分析中華蟾蜍靜止代謝率和各器官在個(gè)體間水平的相關(guān)關(guān)系

3 討論

中華蟾蜍的高耗能器官質(zhì)量與RMR不存在相關(guān)性：1)在該物種中，RMR和持續(xù)能量支出間可能不存在相關(guān)選擇或其選擇壓力較小。無(wú)論外溫動(dòng)物還是內(nèi)溫動(dòng)物，種間比較都支持持續(xù)能量支出和RMR顯著正相關(guān)(Taigen，1983；Bozinovic，1992；Merritt.，2013)。然而，種內(nèi)分析二者相關(guān)性往往出現(xiàn)不一致的結(jié)果。例如，在個(gè)體水平上，根田鼠和高原鼠兔夏季的BMR與最大代謝率并不相關(guān)，而冬季根田鼠BMR與最大代謝率顯著相關(guān)(=0.612)(王玉山等，2002)；花園石龍子的RMR和最大代謝率不相關(guān)(Merritt.，2013)；在福勒蟾蜍中二者雖然相關(guān)，但相關(guān)系數(shù)僅為0.37(Walton，1988)。因而，何種生態(tài)、進(jìn)化及生活史因素可以影響RMR和持續(xù)能量支出的關(guān)聯(lián)性值得進(jìn)一步研究。2)在該物種中，持續(xù)能量支出的個(gè)體差異不是由高耗能器官的質(zhì)量大小變異來(lái)貢獻(xiàn)的。在美洲豹蛙中，僅見(jiàn)RMR和腎臟干重殘差顯著正相關(guān)，而與心臟、肝臟、小腸和腓腸肌干重不相關(guān)(Steyermark.，2005)。然而，該相關(guān)性受單一數(shù)據(jù)奇值點(diǎn)影響。這說(shuō)明，即便是用腎臟來(lái)解釋RMR的個(gè)體間變異，也存在較大的不確定性。在安第斯蟾蜍中發(fā)現(xiàn)，具有更高RMR的個(gè)體擁有更大的小腸、肝臟、腎臟和心臟(Naya.，2009)，但該研究將冬眠組、短期禁食組和對(duì)照組樣本合并進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。而冬眠、短期禁食處理可能消耗高耗能器官中的脂肪等低代謝身體成分，潛在地增加了數(shù)據(jù)的極化程度，進(jìn)而導(dǎo)致器官質(zhì)量與RMR相關(guān)。因此，利用高耗能器官的大小來(lái)闡釋持續(xù)能量支出的個(gè)體差異在兩棲類中可能并不具有普遍性。將來(lái)的研究有必要聚焦于高耗能器官的生理生化特征(如檸檬酸循環(huán)或電子呼吸傳遞鏈過(guò)程中的限速酶)，來(lái)闡釋高耗能器官與RMR的關(guān)聯(lián)性(Bozinovic，1992；Trzcionka.，2008；Koch.，2021)。

本研究結(jié)果也證實(shí)，在開(kāi)展整體生理學(xué)特征相關(guān)性研究時(shí)，進(jìn)行重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的必要性。中華蟾蜍的RMR重復(fù)性僅為0.321，許多個(gè)體在3次測(cè)定過(guò)程中的RMR出現(xiàn)大幅度波動(dòng)。如果僅依據(jù)單次測(cè)定結(jié)果進(jìn)行相關(guān)分析，必然會(huì)偏離其真實(shí)值。實(shí)際上，利用單(多)變量隨機(jī)回歸模型分析重復(fù)測(cè)量的數(shù)據(jù)集可以解析何種因子限制特征穩(wěn)定性、可塑性、進(jìn)化權(quán)衡等一系列有趣的進(jìn)化和生態(tài)問(wèn)題，且日益受到學(xué)界關(guān)注和重視(Dingemanse & Dochtermann，2013；Sih.，2015；Videlier.，2019)。因此建議國(guó)內(nèi)動(dòng)物生理生態(tài)學(xué)者們?cè)诓捎梅侨肭中陨韺W(xué)指標(biāo)測(cè)定時(shí)充分利用這一設(shè)計(jì)理念。

本研究采用的動(dòng)物來(lái)自不同海拔位點(diǎn)，而不同海拔的持續(xù)能量支出、RMR和體質(zhì)量的尺度關(guān)系可能存在差異，從而影響器官大小與RMR的關(guān)系。然而，前期研究發(fā)現(xiàn)不同海拔中華蟾蜍的RMR沒(méi)有差異，而且其與體質(zhì)量的尺度關(guān)系也不隨海拔變化(Tan.，2021)。而且，這些動(dòng)物經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間的室內(nèi)馴化，很大程度上抵消了采用前即時(shí)環(huán)境的影響。因此，理論上來(lái)說(shuō)，多個(gè)海拔位點(diǎn)取樣不會(huì)對(duì)本研究結(jié)果產(chǎn)生顯著影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，中華蟾蜍的高耗能器官大小與其RMR不相關(guān)，提示該物種的持續(xù)能量支出與其高耗能器官質(zhì)量不相關(guān)，或者持續(xù)能量支出與RMR不相關(guān)，因而不支持“攝食增量假說(shuō)”。該研究為擴(kuò)展外溫動(dòng)物持續(xù)能量支出理論奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。