吳榮梅 余書平 余秀宏 汪永奇 曹青青 唐平 尹軍峰 許勇泉

摘要：夏秋茶鮮葉原料中酯型兒茶素含量豐富，經(jīng)傳統(tǒng)方法加工而成的綠茶苦澀味重，不被廣大消費(fèi)者所接受，導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)效益低，因而被廣泛棄采并造成嚴(yán)重資源浪費(fèi)。單寧酶是一種作用于沒(méi)食子?；纳锩?，可催化酯型兒茶素生成非酯型兒茶素與沒(méi)食子酸，改變綠茶兒茶素組成，從而達(dá)到改善滋味品質(zhì)的目的。文章在綠茶加工過(guò)程中添加單寧酶處理殺青葉，并分析了酶添加量與處理溫度對(duì)成品綠茶浸提液感官品質(zhì)與理化指標(biāo)的影響。研究表明，單寧酶處理殺青葉可有效改善夏秋季綠茶浸提液滋味品質(zhì)。隨著酶添加量的提高，浸提液外觀色澤越發(fā)清亮，苦澀味降低而回甘顯著增強(qiáng)，整體口感得到極大改善。此外，酶解處理后，浸提液中的總兒茶素含量雖無(wú)明顯變化，但酯型兒茶素含量與比例均顯著降低，浸提液抗氧化活性得以提升。處理溫度的影響雖不及酶添加量，但40 ℃處理的浸提液品質(zhì)顯著最佳。

關(guān)鍵詞：?jiǎn)螌幟?夏秋季綠茶;感官品質(zhì);理化指標(biāo)

Improving the Taste of Summer-Autumn

Green Tea with Tannase

WU Rongmei1， YU Shuping1， YU Xiuhong1， WANG Yongqi1， CAO Qingqing2*，

TANG Ping3， YIN Junfeng2， XU Yongquan2

1. Tea Science Research Institute of Kaihua County， Quzhou 324300， China;

2. Tea Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Hangzhou 310008， China;

3. Hangzhou Vocational & Technical College， Hangzhou 310018， China

Abstract： The fresh tea leaves in summer and autumn are rich in galloylated catechins and the green tea processed from those with the traditional technology is known as summer-autumn green tea. Summer-autumn green tea is bitter and astringent， which is not acceptable by most tea consumers. Thus， tea leaves in summer and autumn are widely discarded， which directly resulted in a serious waste of tea resource. Tannase is a type of biological enzyme acting on galloyl group specifically. It's able to catalyze galloylated catechins to generate non-galloylated catechins and gallic acid， and change the catechins' composition， leading to the improvement of tea taste. This study treated enzyme-denatured leaves with tannse during green tea processing， and analyzed the effects of tannase addition and treatment temperature on the sensory quality and physicochemical properties of summer-autumn green tea extract. The results show that tannase treatment could promote the overall quality of green tea extract. With the addition amount of tannase increased， the color of extract was lighter and clearer， bitterness and astringency were weakened， and sweet aftertaste and overall flavor got improved. Besides， the total catechins were not changed greatly.The contents and proportion of galloylated catechins dropped dramatically， and antioxidant activity increased. Treatment temperature had a less influence， but the overall quality of green tea extract under 40 ℃ was significantly the best.

Keywords： tannase， summer-autumn green tea， sensory quality， physicochemical property

單寧酯酰水解酶（Tannase，EC 3.1.1.20），簡(jiǎn)稱單寧酶或鞣酸酶，是一種重要的生物技術(shù)酶，可催化沒(méi)食子單寧、復(fù)合單寧與沒(méi)食子酸酯等化合物中酯鍵的水解，釋放沒(méi)食子酸[1-2]。單寧酶在速溶茶、啤酒、果汁與紅酒等飲料生產(chǎn)中被廣泛用作澄清劑，可有效改善飲料液體的外觀色澤與儲(chǔ)藏過(guò)程中產(chǎn)生的渾濁問(wèn)題[3]。綠茶是我國(guó)占比最大的茶類，但長(zhǎng)久以來(lái)，絕大部分商品茶原料都采用產(chǎn)量低、成本高的春季鮮葉，而產(chǎn)量約為春季2倍的夏秋茶鮮葉因苦澀味重被廣泛棄采。這不僅直接造成了茶鮮葉資源的嚴(yán)重浪費(fèi)，還極大限制了我國(guó)綠茶產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。攻克夏秋茶資源利用這一產(chǎn)業(yè)瓶頸的關(guān)鍵在于解決其鮮葉原料苦澀味重、滋味品質(zhì)差的現(xiàn)實(shí)問(wèn)題。前期研究表明，夏秋茶苦澀味強(qiáng)烈的主要原因在于其豐富的酯型兒茶素含量，因?yàn)轷バ蛢翰杷厥蔷G茶苦澀味的重要貢獻(xiàn)者[4-5]。單寧酶可催化水解酯型兒茶素生成非酯型兒茶素與沒(méi)食子酸，生成的非酯型兒茶素與沒(méi)食子酸不僅滋味柔和，基本無(wú)苦無(wú)澀，還具有令人愉悅的回甘滋味特征，可有效改善夏秋季綠茶的滋味品質(zhì)[6-7]。本研究在此基礎(chǔ)之上，嘗試在夏秋季綠茶加工過(guò)程中添加單寧酶處理殺青葉以期達(dá)到改善其滋味品質(zhì)的目的。研究重點(diǎn)分析了單寧酶添加量與處理溫度對(duì)成品綠茶浸提液感官品質(zhì)與理化指標(biāo)的影響，研究結(jié)果可以為生產(chǎn)實(shí)踐提供一定理論指導(dǎo)，對(duì)促進(jìn)夏秋茶鮮葉原料的高效高值化利用具有積極意義。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)材料與儀器

鮮葉原料：鳩坑種，一芽三葉，采摘于2019年9月浙江開(kāi)化。

儀器：電磁殺青機(jī)、碧螺春烘干機(jī);25型揉捻機(jī);Flukef59紅外線測(cè)溫槍（美國(guó)福祿克公司）;島津LC-20A高效液相色譜儀（日本島津公司）。

試劑：?jiǎn)螌幟福?00 U/g，北京衛(wèi)諾恩生物技術(shù)有限公司）;兒茶素（C）、沒(méi)食子兒茶素（GC）、兒茶素沒(méi)食子酸酯（CG）、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（GCG）、表兒茶素（EC）、表沒(méi)食子兒茶素（EGC）、表兒茶素沒(méi)食子酸酯（ECG）、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）、沒(méi)食子酸（GA）、谷氨酸、福林酚、乙腈（色譜純）、過(guò)硫酸鉀（K2S2O8）、2，2-二苯基-1-吡啶并肼基（DPPH）、6-羥基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸（Trolox）等均購(gòu)自Sigma-Aldrich;乙酸（色譜純）、甲醇、氯化亞錫二水合物（SnCl2 ·2H2O）購(gòu)自Aladdin;碳酸鈉（Na2CO3）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）購(gòu)自Macklin;茚三酮購(gòu)自Alfa Aesar。

1.2? 試驗(yàn)方法

1.2.1? 樣品制備

單寧酶酶解綠茶樣品制備：采摘的鮮葉攤放過(guò)夜（約12 h，含水率74.84%），240 ℃下殺青1 min（電磁殺青機(jī)），用25型揉捻機(jī)揉捻30 min至出汁，噴灑不同濃度單寧酶溶液后再揉捻15 min。完全混合后，揉捻葉置于不同溫度下進(jìn)行酶解處理，最后采用烘干機(jī)在90～120 ℃下烘至足干。單寧酶添加量分別為殺青葉（含水量50%，水浸出物50%）質(zhì)量的0.05%、0.10%、0.25%、0.50%，處理溫度為30 ℃、40 ℃、50 ℃，以添加量0、處理溫度30 ℃為對(duì)照。處理時(shí)間為揉捻后180 min。每個(gè)茶樣2 kg，制樣重復(fù)2次。

綠茶浸提液制備：5 g干茶，250 mL純水，85 ℃水浴條件下浸提20 min，紗布過(guò)濾。浸提液冷卻至室溫（25 ℃± 2 ℃）后用于感官評(píng)價(jià)和理化指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.2? 感官評(píng)價(jià)

采用“十點(diǎn)標(biāo)度法”[6]定量評(píng)價(jià)綠茶浸提液的苦味、澀味、回甘等滋味強(qiáng)度，其中8～10分表示“非常強(qiáng)”，6～8分表示“較強(qiáng)”，4～6分表示“正好（一般）”，2～4分表示“較弱”，0～2分表示“非常弱”;整體風(fēng)味的評(píng)分則基于評(píng)價(jià)員對(duì)上述3種滋味屬性的綜合反饋，同樣采取10分制。所有樣品感官評(píng)價(jià)由專業(yè)審評(píng)小組成員（5男4女，25～48歲）完成。

1.2.3? 色差測(cè)定

綠茶浸提液的色差參數(shù)由色差儀（CM-3500d，柯尼卡美能達(dá)投資有限公司）測(cè)定[8]。色差結(jié)果采用CIE三度色彩空間（CIE L*a*b*）表示，其中，L*表示亮度，取值0（純黑）到100（純白）;a*表示紅綠色度，正值（+）表示紅色，負(fù)值（–）表示綠色;b*表示黃藍(lán)色度，正值（+）表示黃色，負(fù)值（–）表示藍(lán)色;C*則表示色彩飽和度，一定程度上可以綜合反映a*/b*。

1.2.4? 茶多酚與游離氨基酸含量測(cè)定

綠茶浸提液中的茶多酚含量采用福林酚法[9]測(cè)定。5 mL10%福林酚溶液加到1 mL浸提液樣品（或沒(méi)食子酸標(biāo)品樣品液、純水）中，充分混合靜置5 min后加入5 mL7.5%Na2CO3溶液，混合體系室溫靜置反應(yīng)1 h，之后用紫外分光光度計(jì)于765 nm下測(cè)定吸光度。

游離氨基酸含量測(cè)定參考茚三酮法[10]。取1 mL浸提液樣品（或谷氨酸標(biāo)品樣品液、純水）置于25 mL容量瓶中，之后依次加入0.5 mL磷酸緩沖液（pH 8.0）和2%茚三酮溶液，沸水浴15 min，冷卻至室溫，純水定容，570 nm處測(cè)定吸光度。

1.2.5? 兒茶素、沒(méi)食子酸與咖啡堿測(cè)定

兒茶素、沒(méi)食子酸與咖啡堿含量的測(cè)定利用島津LC-20A高效液相色譜儀（日本島津公司）[7]。綠茶浸提液樣品經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后上樣，液相方法如下：Diamonsil? C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），柱溫40 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，流動(dòng)相A為0.2%乙酸，B為純乙腈。梯度洗脫，B相初始為6.5%，在16 min內(nèi)由6.5%線性梯度變化到25%，30 min回到6.5%，平衡5 min。

1.2.6? 抗氧化活性測(cè)定

綠茶浸提液的抗氧化活性采用DPPH法測(cè)定[11]。100 μL樣品（或Trolox標(biāo)準(zhǔn)樣品液、純水）與3.9 mL DPPH反應(yīng)液（6 × 10?5 mol/L，溶于甲醇）充分混合后室溫避光孵育2 h，之后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定515 nm處的吸光度。

1.2.7? 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均表示為3個(gè)重復(fù)的“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”（X ± SD），采用SAS 9.4軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）、多重比較（Duncan，P < 0.05）以及相關(guān)性分析，采用SIMCA-P 14.1作主成分分析（PCA），采用GraphPad Prism 9.0作圖。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 單寧酶添加量與處理溫度對(duì)綠茶浸提液感官品質(zhì)的影響

不同酶解處理得到的綠茶浸提液外觀色澤呈現(xiàn)出肉眼可見(jiàn)的差別（圖1-A），隨著單寧酶添加量的增加，浸提液顏色逐漸變亮變淺，而不同溫度處理間的差異不易察覺(jué)。圖1-B中的色差數(shù)據(jù)很好地佐證了視覺(jué)感知結(jié)果。單因素方差分析結(jié)果顯示，浸提液的各色差指標(biāo)均受到單寧酶添加量的顯著影響（P < 0.01）。單寧酶濃度的提高導(dǎo)致綠茶浸提液色澤L*與a*值升高的同時(shí)，還會(huì)引起b*與C*值的降低。這說(shuō)明，單寧酶酶解綠茶會(huì)有效改善其浸提液外觀色澤的亮度，并降低黃綠色度以及整體色彩飽和度。單寧酶添加量與色差指標(biāo)之間也呈現(xiàn)良好相關(guān)性（P < 0.000 1;L*∶R = 0.690;a*∶R = 0.889;b*∶R =-0.837;C*∶R =-0.839）。這或許與單寧酶的澄清效果有關(guān)。Lu等[3]研究發(fā)現(xiàn)相較于未經(jīng)酶處理的對(duì)照組，單寧酶處理組的綠茶茶湯具有更好的外觀色澤，包括更高的澄清度與亮度、更少的沉淀物，因?yàn)閱螌幟柑幚砗蟮牟铚c蛋白的結(jié)合力更低，多羥基成分（主要是多酚）穩(wěn)定性明顯提高。楊曉麗[12]也發(fā)現(xiàn)添加單寧酶不僅可以顯著減少綠茶濃縮液中渾濁物的生成，濃縮液顏色清亮，還能有效保障儲(chǔ)存過(guò)程中的澄清度。此外，處理溫度僅對(duì)a*值有一定影響（P < 0.01），30 ℃下的a*值顯著低于40 ℃、50 ℃下的a*值，意即浸提液的綠色度更高。

不同酶解處理下的綠茶浸提液滋味屬性也呈現(xiàn)顯著差異。圖2-A顯示，綠茶加工過(guò)程中單寧酶處理可以顯著降低（P < 0.001）其浸提液的苦澀味、增強(qiáng)回甘，從而達(dá)到改善整體風(fēng)味的目的。酶添加量與苦味（P < 0.000 1，R = -0.765）、澀味（P < 0.01，R = -0.575）、回甘（P < 0.000 1，R = 0.741）以及整體風(fēng)味（P? < 0.000 1，R = 0.724）之間均存在顯著相關(guān)性。浸提液滋味屬性也在一定程度上受酶解處理溫度的影響，如圖2-B所示。40 ℃下浸提液的苦澀味最低、回甘最強(qiáng)，整體風(fēng)味最佳。不過(guò)，整體而言，處理溫度對(duì)綠茶浸提液感官品質(zhì)的影響遠(yuǎn)不及單寧酶添加量。總之，單寧酶酶解綠茶主要通過(guò)改善浸提液外觀色澤、降低苦澀味與增強(qiáng)回甘達(dá)到改善整體感官品質(zhì)的目的，這與前期研究結(jié)果一致[6-7]。

2.2? 單寧酶添加量與處理溫度對(duì)綠茶浸提液理化成分的影響

為進(jìn)一步探索單寧酶酶解處理再加工葉改善綠茶浸提液的內(nèi)在機(jī)制，各酶解處理組浸提液樣品的主要成分被一一測(cè)定并分析，包括茶多酚、咖啡堿、氨基酸等。主成分分析結(jié)果的Biplot（圖3）直觀地反映了各處理組與各成分含量之間的復(fù)雜關(guān)系。從中可以看出，所有樣品處理組按照其成分含量大致可以劃分成兩部分，分別位于Biplot的左右兩側(cè)，左側(cè)是單寧酶低添加量處理組（酶添加量0～0.10%），右側(cè)則是高添加量處理組（0.25%～0.50%）。其中，對(duì)照組（CK）位于最左側(cè)，雖與低添加量處理組較為接近，但依然具有良好的區(qū)分度，說(shuō)明酶解處理確實(shí)對(duì)綠茶浸提液的理化成分產(chǎn)生相當(dāng)程度的影響。此外，左側(cè)低添加量處理組（包括CK）與ECG、GCG、EGCG、CG、C、GC等兒茶素成分標(biāo)記點(diǎn)相對(duì)集中，說(shuō)明該組樣品中含有大量這些成分;而高添加量處理組則含有更多的EC、EGC和GA，并具有更高的抗氧化活性。而茶多酚、咖啡堿和游離氨基酸三大主要成分似乎沒(méi)有表現(xiàn)出與高或低添加量處理組間明顯的離散性，說(shuō)明其在這兩大處理組間的含量差異并不顯著。

重點(diǎn)分析酶添加量與處理溫度對(duì)幾種主要成分含量的影響發(fā)現(xiàn)，單寧酶處理濃度顯著影響浸提液中的茶多酚（P < 0.05）與咖啡堿含量（P < 0.05），但并未呈現(xiàn)顯著的相關(guān)關(guān)系（P > 0.05）（圖4），氨基酸含量則不受單寧酶影響，在各處理組之間基本保持穩(wěn)定。此外，這三大主要成分含量在不同溫度處理組間均未呈現(xiàn)出顯著差異。

兒茶素是綠茶中含量最高的多酚類物質(zhì)，對(duì)綠茶風(fēng)味與保健功能貢獻(xiàn)斐然。圖5-A、圖5-B分別顯示了單寧酶添加量與處理溫度對(duì)浸提液中兒茶素組分的影響。結(jié)果表明，單寧酶添加量與溫度的不同并不會(huì)導(dǎo)致浸提液中總兒茶素含量的變化（P > 0.05），但是酯型兒茶素與非酯型兒茶素的含量都發(fā)生了劇烈變化（圖5-A）。隨著單寧酶添加量的增加，綠茶浸提液中酯型兒茶素絕對(duì)含量與百分含量都顯著下降（P < 0.000 1），而非酯型兒茶素與之相反。酶解處理溫度也對(duì)兒茶素組分產(chǎn)生一定影響（圖5-B），40 ℃處理的浸提液中酯型兒茶素含量與百分比均顯著低于其他溫度處理，這與前文中感官結(jié)果相吻合，證明在本研究中40 ℃是單寧酶酶解的最佳溫度。前期研究表明，酯型兒茶素具有強(qiáng)烈苦澀味（尤其是EGCG），是導(dǎo)致夏秋季綠茶苦澀味重的關(guān)鍵原因[4];而非酯型兒茶素滋味柔和，具有明顯回甘滋味特征[6];此外，沒(méi)食子酸也被證明是綠茶茶湯關(guān)鍵回甘滋味化合物之一[7]。單寧酶處理綠茶殺青過(guò)程中，鮮葉中大量的酯型兒茶素被水解成非酯型兒茶素和沒(méi)食子酸，兒茶素組分發(fā)生劇烈變化，成品茶滋味口感也從苦澀刺激向回甘醇和轉(zhuǎn)化，使得整體風(fēng)味得到明顯改善。

此外，浸提液的抗氧化活性也受單寧酶添加量的影響（P < 0.000 1）。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，單寧酶添加量與浸提液抗氧化活性之間存在顯著正相關(guān)（P < 0.001，R = 0.634）。這與Thiyonila等[13]的研究結(jié)果一致，該研究發(fā)現(xiàn)單寧酶具有提高綠茶浸提液抗氧化活性的潛力，因?yàn)閱螌幟杆鈴?fù)雜多酚類化合物的酯鍵使得酚類抗氧化劑得以充分釋放。

3? 結(jié)論

單寧酶被廣泛應(yīng)用于食品飲料生產(chǎn)中，對(duì)改善飲料沉淀渾濁與風(fēng)味都具有顯著成效。本研究以夏秋茶鮮葉作為原料，在綠茶加工過(guò)程中添加單寧酶處理殺青葉，以期有效改善夏秋季綠茶苦澀味重的風(fēng)味弊端。研究表明，單寧酶添加量與處理溫度都會(huì)顯著影響成品綠茶浸提液的感官品質(zhì)與理化指標(biāo)。隨著酶添加量的增加，浸提液外觀色澤亮度提升、色彩飽和度降低，苦澀味降低、回甘提高、整體風(fēng)味顯著得到改善;浸提液酯型兒茶素含量與比例顯著降低，抗氧化活性提高。處理溫度雖不及酶添加量的影響顯著，但對(duì)浸提液的風(fēng)味特征和理化成分依然具有較大影響，40 ℃被證明是最佳處理溫度，該溫度下浸提液中的酯型兒茶素含量與比例最低，整體口感最佳。

參考文獻(xiàn)

[1] 王揮， 黃壽恩， 顏紅， 等. 單寧酶制備研究進(jìn)展[J]. 食品與機(jī)械， 2012， 28（3）： 246-254.

[2] YAO J， GUO G S， REN G H， et al. Production， characterization and applications of tannase[J]. Journal of Molecular Catalysis B： Enzymatic， 2014， 101： 137-147.

[3] LU M J， CHU S C， YAN L， et al. Effect of tannase treatment on protein-tannin aggregation and sensory attributes of green tea infusion[J]. LWT - Food Science and Technology， 2009， 42： 338-342.

[4] XU Y Q， ZHANG Y N， CHEN J X， et al. Quantitative analyses of the bitterness and astringency of catechins from green tea[J]. Food Chemistry， 2018， 258：16-24.

[5] 張英娜， 陳根生， 劉陽(yáng)， 等. 烘青綠茶苦澀味及其滋味貢獻(xiàn)物質(zhì)分析[J]. 茶葉科學(xué)， 2015， 35（4）： 377-383.

[6] ZHANG Y N， YIN J F， CHEN J X， et al. Improving the sweet aftertaste of green tea infusion with tannase[J]. Food Chemistry， 2016， 192： 470-476.

[7] CAO Q Q， ZOU C， ZHANG Y H， et al. Improving the taste of autumn green tea with tannase[J]. Food Chemistry， 2019， 277： 432-437.

[8] MAO Y L， WANG J Q， CHEN G S， et al. Effect of chemical composition of black tea infusion on the color of milky tea[J]. Food Research International， 2021， 139： 109945.

[9] SINGLETON V L， ORTHOFER R， LAMUELA-RAVENTóS R M. Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent[J]. Methods in Enzymology， 1999， 299（1）： 152-178.

[10] MAGNé C， LARHER F. High sugar content of extracts interferes with colorimetric determination of amino acids and free proline[J]. Analytical Biochemistry， 1992， 200（1）： 115-118.

[11] XU Y Q， YU P， ZHOU W. Combined effect of pH and temperature on the stability and antioxidant capacity of epigallocatechin gallate （EGCG） in aqueous system[J]. Journal of Food Engineering， 2019， 250： 46-54.

[12] 楊曉麗. 復(fù)合酶水解技術(shù)改善綠茶濃縮液品質(zhì)的研究[J]. 中國(guó)茶葉加工， 2021（2）： 48-53.

[13] THIYONILA B， KANNAN M， PAULIN RN， et al. Influence of tannase from serratia marcescens strain IMBL5 on enhancing antioxidant properties of green tea[J]. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology， 2020， 27： 101675-101684.