吳榮梅 余書平 余秀宏 汪永奇 曹青青 唐平 尹軍峰 許勇泉

摘要：夏秋茶鮮葉原料中酯型兒茶素含量豐富，經(jīng)傳統(tǒng)方法加工而成的綠茶苦澀味重，不被廣大消費者所接受，導致經(jīng)濟效益低，因而被廣泛棄采并造成嚴重資源浪費。單寧酶是一種作用于沒食子酰基的生物酶，可催化酯型兒茶素生成非酯型兒茶素與沒食子酸，改變綠茶兒茶素組成，從而達到改善滋味品質(zhì)的目的。文章在綠茶加工過程中添加單寧酶處理殺青葉，并分析了酶添加量與處理溫度對成品綠茶浸提液感官品質(zhì)與理化指標的影響。研究表明，單寧酶處理殺青葉可有效改善夏秋季綠茶浸提液滋味品質(zhì)。隨著酶添加量的提高，浸提液外觀色澤越發(fā)清亮，苦澀味降低而回甘顯著增強，整體口感得到極大改善。此外，酶解處理后，浸提液中的總兒茶素含量雖無明顯變化，但酯型兒茶素含量與比例均顯著降低，浸提液抗氧化活性得以提升。處理溫度的影響雖不及酶添加量，但40 ℃處理的浸提液品質(zhì)顯著最佳。

關(guān)鍵詞：單寧酶;夏秋季綠茶;感官品質(zhì);理化指標

Improving the Taste of Summer-Autumn

Green Tea with Tannase

WU Rongmei1， YU Shuping1， YU Xiuhong1， WANG Yongqi1， CAO Qingqing2*，

TANG Ping3， YIN Junfeng2， XU Yongquan2

1. Tea Science Research Institute of Kaihua County， Quzhou 324300， China;

2. Tea Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Hangzhou 310008， China;

3. Hangzhou Vocational & Technical College， Hangzhou 310018， China

Abstract： The fresh tea leaves in summer and autumn are rich in galloylated catechins and the green tea processed from those with the traditional technology is known as summer-autumn green tea. Summer-autumn green tea is bitter and astringent， which is not acceptable by most tea consumers. Thus， tea leaves in summer and autumn are widely discarded， which directly resulted in a serious waste of tea resource. Tannase is a type of biological enzyme acting on galloyl group specifically. It's able to catalyze galloylated catechins to generate non-galloylated catechins and gallic acid， and change the catechins' composition， leading to the improvement of tea taste. This study treated enzyme-denatured leaves with tannse during green tea processing， and analyzed the effects of tannase addition and treatment temperature on the sensory quality and physicochemical properties of summer-autumn green tea extract. The results show that tannase treatment could promote the overall quality of green tea extract. With the addition amount of tannase increased， the color of extract was lighter and clearer， bitterness and astringency were weakened， and sweet aftertaste and overall flavor got improved. Besides， the total catechins were not changed greatly.The contents and proportion of galloylated catechins dropped dramatically， and antioxidant activity increased. Treatment temperature had a less influence， but the overall quality of green tea extract under 40 ℃ was significantly the best.

Keywords： tannase， summer-autumn green tea， sensory quality， physicochemical property

單寧酯酰水解酶（Tannase，EC 3.1.1.20），簡稱單寧酶或鞣酸酶，是一種重要的生物技術(shù)酶，可催化沒食子單寧、復合單寧與沒食子酸酯等化合物中酯鍵的水解，釋放沒食子酸[1-2]。單寧酶在速溶茶、啤酒、果汁與紅酒等飲料生產(chǎn)中被廣泛用作澄清劑，可有效改善飲料液體的外觀色澤與儲藏過程中產(chǎn)生的渾濁問題[3]。綠茶是我國占比最大的茶類，但長久以來，絕大部分商品茶原料都采用產(chǎn)量低、成本高的春季鮮葉，而產(chǎn)量約為春季2倍的夏秋茶鮮葉因苦澀味重被廣泛棄采。這不僅直接造成了茶鮮葉資源的嚴重浪費，還極大限制了我國綠茶產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。攻克夏秋茶資源利用這一產(chǎn)業(yè)瓶頸的關(guān)鍵在于解決其鮮葉原料苦澀味重、滋味品質(zhì)差的現(xiàn)實問題。前期研究表明，夏秋茶苦澀味強烈的主要原因在于其豐富的酯型兒茶素含量，因為酯型兒茶素是綠茶苦澀味的重要貢獻者[4-5]。單寧酶可催化水解酯型兒茶素生成非酯型兒茶素與沒食子酸，生成的非酯型兒茶素與沒食子酸不僅滋味柔和，基本無苦無澀，還具有令人愉悅的回甘滋味特征，可有效改善夏秋季綠茶的滋味品質(zhì)[6-7]。本研究在此基礎(chǔ)之上，嘗試在夏秋季綠茶加工過程中添加單寧酶處理殺青葉以期達到改善其滋味品質(zhì)的目的。研究重點分析了單寧酶添加量與處理溫度對成品綠茶浸提液感官品質(zhì)與理化指標的影響，研究結(jié)果可以為生產(chǎn)實踐提供一定理論指導，對促進夏秋茶鮮葉原料的高效高值化利用具有積極意義。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料與儀器

鮮葉原料：鳩坑種，一芽三葉，采摘于2019年9月浙江開化。

儀器：電磁殺青機、碧螺春烘干機;25型揉捻機;Flukef59紅外線測溫槍（美國福祿克公司）;島津LC-20A高效液相色譜儀（日本島津公司）。

試劑：單寧酶（500 U/g，北京衛(wèi)諾恩生物技術(shù)有限公司）;兒茶素（C）、沒食子兒茶素（GC）、兒茶素沒食子酸酯（CG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）、表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素（EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、沒食子酸（GA）、谷氨酸、福林酚、乙腈（色譜純）、過硫酸鉀（K2S2O8）、2，2-二苯基-1-吡啶并肼基（DPPH）、6-羥基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸（Trolox）等均購自Sigma-Aldrich;乙酸（色譜純）、甲醇、氯化亞錫二水合物（SnCl2 ·2H2O）購自Aladdin;碳酸鈉（Na2CO3）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）購自Macklin;茚三酮購自Alfa Aesar。

1.2? 試驗方法

1.2.1? 樣品制備

單寧酶酶解綠茶樣品制備：采摘的鮮葉攤放過夜（約12 h，含水率74.84%），240 ℃下殺青1 min（電磁殺青機），用25型揉捻機揉捻30 min至出汁，噴灑不同濃度單寧酶溶液后再揉捻15 min。完全混合后，揉捻葉置于不同溫度下進行酶解處理，最后采用烘干機在90～120 ℃下烘至足干。單寧酶添加量分別為殺青葉（含水量50%，水浸出物50%）質(zhì)量的0.05%、0.10%、0.25%、0.50%，處理溫度為30 ℃、40 ℃、50 ℃，以添加量0、處理溫度30 ℃為對照。處理時間為揉捻后180 min。每個茶樣2 kg，制樣重復2次。

綠茶浸提液制備：5 g干茶，250 mL純水，85 ℃水浴條件下浸提20 min，紗布過濾。浸提液冷卻至室溫（25 ℃± 2 ℃）后用于感官評價和理化指標的測定。

1.2.2? 感官評價

采用“十點標度法”[6]定量評價綠茶浸提液的苦味、澀味、回甘等滋味強度，其中8～10分表示“非常強”，6～8分表示“較強”，4～6分表示“正好（一般）”，2～4分表示“較弱”，0～2分表示“非常弱”;整體風味的評分則基于評價員對上述3種滋味屬性的綜合反饋，同樣采取10分制。所有樣品感官評價由專業(yè)審評小組成員（5男4女，25～48歲）完成。

1.2.3? 色差測定

綠茶浸提液的色差參數(shù)由色差儀（CM-3500d，柯尼卡美能達投資有限公司）測定[8]。色差結(jié)果采用CIE三度色彩空間（CIE L*a*b*）表示，其中，L*表示亮度，取值0（純黑）到100（純白）;a*表示紅綠色度，正值（+）表示紅色，負值（–）表示綠色;b*表示黃藍色度，正值（+）表示黃色，負值（–）表示藍色;C*則表示色彩飽和度，一定程度上可以綜合反映a*/b*。

1.2.4? 茶多酚與游離氨基酸含量測定

綠茶浸提液中的茶多酚含量采用福林酚法[9]測定。5 mL10%福林酚溶液加到1 mL浸提液樣品（或沒食子酸標品樣品液、純水）中，充分混合靜置5 min后加入5 mL7.5%Na2CO3溶液，混合體系室溫靜置反應1 h，之后用紫外分光光度計于765 nm下測定吸光度。

游離氨基酸含量測定參考茚三酮法[10]。取1 mL浸提液樣品（或谷氨酸標品樣品液、純水）置于25 mL容量瓶中，之后依次加入0.5 mL磷酸緩沖液（pH 8.0）和2%茚三酮溶液，沸水浴15 min，冷卻至室溫，純水定容，570 nm處測定吸光度。

1.2.5? 兒茶素、沒食子酸與咖啡堿測定

兒茶素、沒食子酸與咖啡堿含量的測定利用島津LC-20A高效液相色譜儀（日本島津公司）[7]。綠茶浸提液樣品經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后上樣，液相方法如下：Diamonsil? C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），柱溫40 ℃，檢測波長280 nm，流速1.0 mL/min，進樣量10 μL，流動相A為0.2%乙酸，B為純乙腈。梯度洗脫，B相初始為6.5%，在16 min內(nèi)由6.5%線性梯度變化到25%，30 min回到6.5%，平衡5 min。

1.2.6? 抗氧化活性測定

綠茶浸提液的抗氧化活性采用DPPH法測定[11]。100 μL樣品（或Trolox標準樣品液、純水）與3.9 mL DPPH反應液（6 × 10?5 mol/L，溶于甲醇）充分混合后室溫避光孵育2 h，之后用紫外分光光度計測定515 nm處的吸光度。

1.2.7? 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗數(shù)據(jù)均表示為3個重復的“平均值±標準差”（X ± SD），采用SAS 9.4軟件進行單因素方差分析（ANOVA）、多重比較（Duncan，P < 0.05）以及相關(guān)性分析，采用SIMCA-P 14.1作主成分分析（PCA），采用GraphPad Prism 9.0作圖。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 單寧酶添加量與處理溫度對綠茶浸提液感官品質(zhì)的影響

不同酶解處理得到的綠茶浸提液外觀色澤呈現(xiàn)出肉眼可見的差別（圖1-A），隨著單寧酶添加量的增加，浸提液顏色逐漸變亮變淺，而不同溫度處理間的差異不易察覺。圖1-B中的色差數(shù)據(jù)很好地佐證了視覺感知結(jié)果。單因素方差分析結(jié)果顯示，浸提液的各色差指標均受到單寧酶添加量的顯著影響（P < 0.01）。單寧酶濃度的提高導致綠茶浸提液色澤L*與a*值升高的同時，還會引起b*與C*值的降低。這說明，單寧酶酶解綠茶會有效改善其浸提液外觀色澤的亮度，并降低黃綠色度以及整體色彩飽和度。單寧酶添加量與色差指標之間也呈現(xiàn)良好相關(guān)性（P < 0.000 1;L*∶R = 0.690;a*∶R = 0.889;b*∶R =-0.837;C*∶R =-0.839）。這或許與單寧酶的澄清效果有關(guān)。Lu等[3]研究發(fā)現(xiàn)相較于未經(jīng)酶處理的對照組，單寧酶處理組的綠茶茶湯具有更好的外觀色澤，包括更高的澄清度與亮度、更少的沉淀物，因為單寧酶處理后的茶湯與蛋白的結(jié)合力更低，多羥基成分（主要是多酚）穩(wěn)定性明顯提高。楊曉麗[12]也發(fā)現(xiàn)添加單寧酶不僅可以顯著減少綠茶濃縮液中渾濁物的生成，濃縮液顏色清亮，還能有效保障儲存過程中的澄清度。此外，處理溫度僅對a*值有一定影響（P < 0.01），30 ℃下的a*值顯著低于40 ℃、50 ℃下的a*值，意即浸提液的綠色度更高。

不同酶解處理下的綠茶浸提液滋味屬性也呈現(xiàn)顯著差異。圖2-A顯示，綠茶加工過程中單寧酶處理可以顯著降低（P < 0.001）其浸提液的苦澀味、增強回甘，從而達到改善整體風味的目的。酶添加量與苦味（P < 0.000 1，R = -0.765）、澀味（P < 0.01，R = -0.575）、回甘（P < 0.000 1，R = 0.741）以及整體風味（P? < 0.000 1，R = 0.724）之間均存在顯著相關(guān)性。浸提液滋味屬性也在一定程度上受酶解處理溫度的影響，如圖2-B所示。40 ℃下浸提液的苦澀味最低、回甘最強，整體風味最佳。不過，整體而言，處理溫度對綠茶浸提液感官品質(zhì)的影響遠不及單寧酶添加量?？傊瑔螌幟该附饩G茶主要通過改善浸提液外觀色澤、降低苦澀味與增強回甘達到改善整體感官品質(zhì)的目的，這與前期研究結(jié)果一致[6-7]。

2.2? 單寧酶添加量與處理溫度對綠茶浸提液理化成分的影響

為進一步探索單寧酶酶解處理再加工葉改善綠茶浸提液的內(nèi)在機制，各酶解處理組浸提液樣品的主要成分被一一測定并分析，包括茶多酚、咖啡堿、氨基酸等。主成分分析結(jié)果的Biplot（圖3）直觀地反映了各處理組與各成分含量之間的復雜關(guān)系。從中可以看出，所有樣品處理組按照其成分含量大致可以劃分成兩部分，分別位于Biplot的左右兩側(cè)，左側(cè)是單寧酶低添加量處理組（酶添加量0～0.10%），右側(cè)則是高添加量處理組（0.25%～0.50%）。其中，對照組（CK）位于最左側(cè)，雖與低添加量處理組較為接近，但依然具有良好的區(qū)分度，說明酶解處理確實對綠茶浸提液的理化成分產(chǎn)生相當程度的影響。此外，左側(cè)低添加量處理組（包括CK）與ECG、GCG、EGCG、CG、C、GC等兒茶素成分標記點相對集中，說明該組樣品中含有大量這些成分;而高添加量處理組則含有更多的EC、EGC和GA，并具有更高的抗氧化活性。而茶多酚、咖啡堿和游離氨基酸三大主要成分似乎沒有表現(xiàn)出與高或低添加量處理組間明顯的離散性，說明其在這兩大處理組間的含量差異并不顯著。

重點分析酶添加量與處理溫度對幾種主要成分含量的影響發(fā)現(xiàn)，單寧酶處理濃度顯著影響浸提液中的茶多酚（P < 0.05）與咖啡堿含量（P < 0.05），但并未呈現(xiàn)顯著的相關(guān)關(guān)系（P > 0.05）（圖4），氨基酸含量則不受單寧酶影響，在各處理組之間基本保持穩(wěn)定。此外，這三大主要成分含量在不同溫度處理組間均未呈現(xiàn)出顯著差異。

兒茶素是綠茶中含量最高的多酚類物質(zhì)，對綠茶風味與保健功能貢獻斐然。圖5-A、圖5-B分別顯示了單寧酶添加量與處理溫度對浸提液中兒茶素組分的影響。結(jié)果表明，單寧酶添加量與溫度的不同并不會導致浸提液中總兒茶素含量的變化（P > 0.05），但是酯型兒茶素與非酯型兒茶素的含量都發(fā)生了劇烈變化（圖5-A）。隨著單寧酶添加量的增加，綠茶浸提液中酯型兒茶素絕對含量與百分含量都顯著下降（P < 0.000 1），而非酯型兒茶素與之相反。酶解處理溫度也對兒茶素組分產(chǎn)生一定影響（圖5-B），40 ℃處理的浸提液中酯型兒茶素含量與百分比均顯著低于其他溫度處理，這與前文中感官結(jié)果相吻合，證明在本研究中40 ℃是單寧酶酶解的最佳溫度。前期研究表明，酯型兒茶素具有強烈苦澀味（尤其是EGCG），是導致夏秋季綠茶苦澀味重的關(guān)鍵原因[4];而非酯型兒茶素滋味柔和，具有明顯回甘滋味特征[6];此外，沒食子酸也被證明是綠茶茶湯關(guān)鍵回甘滋味化合物之一[7]。單寧酶處理綠茶殺青過程中，鮮葉中大量的酯型兒茶素被水解成非酯型兒茶素和沒食子酸，兒茶素組分發(fā)生劇烈變化，成品茶滋味口感也從苦澀刺激向回甘醇和轉(zhuǎn)化，使得整體風味得到明顯改善。

此外，浸提液的抗氧化活性也受單寧酶添加量的影響（P < 0.000 1）。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，單寧酶添加量與浸提液抗氧化活性之間存在顯著正相關(guān)（P < 0.001，R = 0.634）。這與Thiyonila等[13]的研究結(jié)果一致，該研究發(fā)現(xiàn)單寧酶具有提高綠茶浸提液抗氧化活性的潛力，因為單寧酶水解復雜多酚類化合物的酯鍵使得酚類抗氧化劑得以充分釋放。

3? 結(jié)論

單寧酶被廣泛應用于食品飲料生產(chǎn)中，對改善飲料沉淀渾濁與風味都具有顯著成效。本研究以夏秋茶鮮葉作為原料，在綠茶加工過程中添加單寧酶處理殺青葉，以期有效改善夏秋季綠茶苦澀味重的風味弊端。研究表明，單寧酶添加量與處理溫度都會顯著影響成品綠茶浸提液的感官品質(zhì)與理化指標。隨著酶添加量的增加，浸提液外觀色澤亮度提升、色彩飽和度降低，苦澀味降低、回甘提高、整體風味顯著得到改善;浸提液酯型兒茶素含量與比例顯著降低，抗氧化活性提高。處理溫度雖不及酶添加量的影響顯著，但對浸提液的風味特征和理化成分依然具有較大影響，40 ℃被證明是最佳處理溫度，該溫度下浸提液中的酯型兒茶素含量與比例最低，整體口感最佳。

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