田豐銘　佘瑞寧　藺曉源　胡國恒

〔摘要〕 目的 運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討祛瘀平肝化痰湯治療高血壓病的可能靶點及作用機制，并選取部分關(guān)鍵靶點及通路進行實驗驗證，為其臨床應(yīng)用及后續(xù)研究提供理論支持。方法 運用TCMSP、BATMAN、TCMIP網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析平臺挖掘祛瘀平肝化痰湯的中藥有效成分，運用SWISS、STITCH數(shù)據(jù)庫整理其作用靶標(biāo);以O(shè)MIM、TTD、GeneCards數(shù)據(jù)庫挖掘高血壓病的相關(guān)靶標(biāo)并與藥物成分靶標(biāo)取交集，整理后得到祛瘀平肝化痰湯的成分-疾病靶標(biāo);通過STRING數(shù)據(jù)庫及Cytoscape軟件，構(gòu)建蛋白互作的網(wǎng)絡(luò)圖，并篩選關(guān)鍵靶點;最后將所得的靶標(biāo)及通路進行富集分析。依據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)所得結(jié)果，設(shè)置4組SD大鼠進行實驗驗證，包括空白組、模型組、中藥組、西藥組。除空白組外，其余組以N’-硝基-L-精氨酸（N'-nitro-L-arginine， L-NNA）腹腔注射進行造模?？瞻捉M與模型組予純凈水灌胃，中藥組予祛瘀平肝化痰湯20.29 g/kg，西藥組予卡托普利混懸液2.11 mg/kg，每天灌胃2次，連續(xù)4周。HE染色觀察胸主動脈病理形態(tài)變化，ELISA法檢測血清中腎素（Renin）、血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ， AngⅡ）、醛固酮（aldosterone， Ald）的含量，免疫組化檢測胸主動脈內(nèi)皮素1（endothelin-1， ET-1）的含量。結(jié)果 整理各網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析平臺數(shù)據(jù)得到祛瘀平肝化痰湯治療高血壓病相關(guān)的靶點有162個，最終通過篩選得到EDN1、NOS3、INS、TNF、VEGFA、ACE等34個關(guān)鍵蛋白靶點，主要富集在血管收縮調(diào)節(jié)、血壓調(diào)節(jié)等生物過程及鈣、腎素-血管緊張素系統(tǒng)、腎素分泌等信號通路。動物實驗結(jié)果顯示，中藥組和西藥組大鼠胸主動脈內(nèi)膜結(jié)構(gòu)較模型組完善;空白組、中藥組、西藥組經(jīng)灌胃4周后，Renin、Ang Ⅱ、Ald表達均較模型組降低（P<0.01）;鏡下觀察免疫組化結(jié)果，模型組的ET-1表達顯著高于空白組及各給藥組（P<0.05）。結(jié)論 祛瘀平肝化痰湯可以通過多途徑、多靶點調(diào)節(jié)血壓，其藥理作用可能通過干預(yù)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin angiotensin aldosterone system， RAAS）、血管內(nèi)皮舒縮等得以實現(xiàn)。實驗結(jié)果表明祛瘀平肝化痰湯能夠改善血管狀態(tài)，降低血清中Renin、Ang Ⅱ、Ald的表達，干預(yù)RAAS，抑制血管內(nèi)ET-1的釋放，保護血管內(nèi)皮。

〔關(guān)鍵詞〕 祛瘀平肝化痰湯;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng);血管內(nèi)皮損傷;內(nèi)皮素-1

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標(biāo)志碼〕A? ? &nbsp; ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.03.012

〔Abstract〕 Objective To explore the possible targets and mechanism of Quyu Pinggan Huatan Decoction in the treatment of hypertension by using network pharmacology， and select some key targets and pathways for experimental verification， so as to provide theoretical support for its clinical application and follow-up research. Methods TCMSP， BATMAN， TCMIP network pharmacological analysis platforms were used to mine the effective components of Quyu Pinggan Huatan Decoction， and SWISS and STITCH databases were used to sort out its action targets; OMIM， TTD and GeneCards databases were used to mine the related targets of hypertension and the intersection with the drug component targets were obtained， and then the component-disease target of Quyu Pinggan Huatan Decoction was obtained; the network diagram of protein-protein interaction was constructed by STRINGdatabase and Cytoscape software， and the key targets were screened; finally， the obtained targets and pathways were enriched and analyzed. According to the results of network pharmacology， four groups of SD rats were set up for experimental verification， including blank group， model group， traditional Chinese medicine group and western medicine group. Except the blank group， the other groups were modeled by intraperitoneal injection of N'-nitro-L-arginine （L-NNA）. The blank group and model group were given purified water by gavage， the traditional Chinese medicine group was given 20.29 g/kg Quyu Pinggan Huatan Decoction， and the western medicine group was given 2.11 mg/kg captopril suspension by gavage， twice a day for 4 weeks. The pathological changes of thoracic aorta were observed by HE staining， the content of Renin， angiotensin Ⅱ （Ang Ⅱ） and? aldosterone （Ald） in serum were detected by ELISA， and the content of endothelin-1 （ET-1） in thoracic aorta was detected by immunohistochemistry. Results After sorting out the data of various network pharmacological analysis platforms， it was found that there were 162 targets related to the treatment of hypertension by Quyu Pinggan Huatan Decoction. Finally， 34 key protein targets such as EDN1， NOS3， INS， TNF， VEGFA and ACE were obtained through screening， which were mainly concentrated in biological processes such as vasoconstriction regulation and blood pressure regulation， calcium signal pathway， renin angiotensin system， renin secretion and other signaling pathways. The results of animal experiments showed that the intimal structure of thoracic aorta in traditional Chinese medicine group and western medicine group was better than that in model group; the expression levels of Renin， Ang Ⅱ and Ald in blank group， traditional Chinese medicine group and western medicine group were lower than those in model group （P<0.01）; immunohistochemical results were observed under microscope that， the expression of ET-1 in the model group was significantly higher than that in the blank group and each administration group （P<0.05）. Conclusion Quyu Pinggan Huatan Decoction can regulate blood pressure through multiple channels and targets， and its pharmacological effect may be realized by intervening renin angiotensin aldosterone system （RAAS）， vascular endothelial relaxation and contraction， etc. The experimental results show that Quyu Pinggan Huatan Decoction can improve the vascular state， reduce the expression of Renin， Ang Ⅱ and? Ald in serum， intervene RAAS， inhibit the release of ET-1 in blood vessels and protect vascular endothelium.

〔Keywords〕 Quyu Pinggan Huatan Decoction; network pharmacology; renin-angiotensin-aldosterone system; vascular endothelial injury; endothelin-1

原發(fā)性高血壓病（essential hypertension， EH）是一種常見的慢性疾病，其發(fā)病與年齡、遺傳、肥胖、精神壓力、飲食習(xí)慣等多種因素有關(guān)。WHO與國際高血壓學(xué)會聯(lián)合聲明中提到高血壓占全球疾病經(jīng)濟負擔(dān)的4.5%[1]。隨著我國人民生活水平的日漸改善，EH的發(fā)病率逐漸增長，并呈現(xiàn)年輕化的趨勢[2]。中國心血管病報告2018年數(shù)據(jù)顯示，EH患者超過2.45億，并以每年1000萬人的速度遞增[3]。EH會引起機體的代謝紊亂，并能成為心腦血管疾病和糖尿病的獨立風(fēng)險因素[4]。因此，提升EH的防治水平，將是我國社會長期面臨的問題。臨床治療EH以血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、鈣離子通道拮抗劑、受體阻滯劑、袢利尿劑等西藥為主，用藥干預(yù)周期較長，副作用較多，若患者依從性欠佳，則難以達到預(yù)期的療效，不能降低相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)病率[5]。中醫(yī)藥基于整體觀念，可以根據(jù)患者癥狀、體征，通過辨病辨證相結(jié)合進行施治，對患者的血壓調(diào)節(jié)及臟器保護均有作用。因此，圍繞EH的中醫(yī)病因病機，對其進行理法方藥的探究，在EH的防治上具有重要的價值。祛瘀平肝化痰湯為胡國恒教授治療EH的臨床經(jīng)驗用方[6-7]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)挖掘祛瘀平肝化痰湯中相關(guān)組方成分的中藥作用靶點，并對該方進行動物實驗驗證，旨在初步揭示祛瘀平肝化痰湯的藥理作用，為其應(yīng)用于EH的防治提供相關(guān)依據(jù)。

1 方法

1.1? 祛瘀平肝化痰湯化學(xué)成分的收集

以“鉤藤”“蒺藜”“葛根”“茯苓”“澤瀉”“石菖蒲”“丹參”“當(dāng)歸”“白芍”為關(guān)鍵詞，通過TCMSP搜索化學(xué)成分，以口服藥物生物利用度≥30%、藥物相似性≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)進行篩選。以相同的關(guān)鍵詞從BATMAN數(shù)據(jù)庫搜索中藥成分，BATMAN數(shù)據(jù)庫中以Score≥20、P≥0.05為篩選條件。運用相同關(guān)鍵詞在TCMIP V2.0搜索中藥成分，篩選靶標(biāo)預(yù)測卡值≥0.8的有效成分。匯總3個數(shù)據(jù)庫得到的有效成分，經(jīng)整理去重后，在PubChem數(shù)據(jù)庫中搜索各個藥物的化學(xué)成分，下載各成分的Canonical SMILES格式分子結(jié)構(gòu)并保存。

1.2? 祛瘀平肝化痰湯的靶點預(yù)測

將保存的化學(xué)成分，分別錄進SWISS、STITCH數(shù)據(jù)庫，并設(shè)置研究對象為“人類”，整理兩個數(shù)據(jù)庫有效成分作用靶點并降重后得到祛瘀平肝化痰湯的作用靶點。

1.3? 高血壓病靶點的獲取

利用OMIM、TTD、GeneCards、DisGeNET、CTD 5個數(shù)據(jù)庫，錄入“Hypertension”為關(guān)鍵詞，設(shè)置每個數(shù)據(jù)庫中的靶點相關(guān)度為前300，挑選出EH的相關(guān)作用靶點[8]，整理并降重后得到EH的作用靶點。

1.4? 潛在作用靶點的獲取

將祛瘀平肝化痰湯的作用靶點及EH的靶點分別錄進Venny 2.1作圖工具，繪成韋恩圖，取交集，為祛瘀平肝化痰湯抗EH的潛在作用靶點，即成分-疾病靶點。

1.5? 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及篩選關(guān)鍵蛋白靶點

將前項所述靶點錄進STRING 11.0數(shù)據(jù)庫，設(shè)置限定“Homo sapiens”，整理得到蛋白交互信息，運用Cytoscape 3.9軟件進行可視化分析，并篩選關(guān)鍵靶點[9]。

1.6? 通路富集分析

將成分-疾病靶點以Gene Symbol的格式錄進DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫，分別選擇分子功能、生物過程和細胞成分，而后進行GO富集分析，設(shè)置Count值為2、P<0.05;選擇KEGG進行基因通路注釋分析，設(shè)置Count值為2、P<0.05。然后運用Bioinformatics平臺將富集分析符合條件的結(jié)果做成條形圖。

1.7? 動物實驗

1.7.1? 動物分組及造模處理? 采用SPF級SD雄性大鼠20只，體質(zhì)量（220±30） g，許可證編號：SCXK（湘）2016-0002，實驗操作通過湖南中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，倫理審批號：LL2021030505。運用SPSS統(tǒng)計分析軟件中的隨機數(shù)字法，將20只老鼠分為4組，每組5只?？瞻捉M以生理鹽水15 mL/（kg·d）進行腹腔注射。模型組、西藥（卡托普利）組、中藥（祛瘀平肝化痰湯）組，進行EH大鼠造模：采用L-NNA水溶液，濃度1 mg/mL，以15 mg/（kg·d）劑量對單只大鼠進行腹腔注射，連續(xù)造模21 d，每日注射藥物兩次[10-11]。以大鼠的尾部動脈血壓SBP≥160 mmHg持續(xù)穩(wěn)定1周以上為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)[5]。

1.7.2? 藥物與試劑? 祛瘀平肝化痰湯：天麻、鉤藤、白蒺藜、澤瀉、石菖蒲、丹參、當(dāng)歸、白芍各20 g，全蝎10 g，葛根40 g，茯苓30 g。傳統(tǒng)方法煎煮后獲得的煎液再濃縮成生藥含量為2 g/mL的藥液，放入4 ℃冰箱中冷藏備用。卡托普利片劑（華中藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字：H42020384，批號：20200302，規(guī)格：25 mg/片）研碎摻和蒸餾水配制成0.3 mg/mL濃度的混懸液，放入4 ℃冰箱中冷藏備用。L-NNA（大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號：MB3299）;Renin ELISA試劑盒（批號：RA20331）、Ang Ⅱ ELISA試劑盒（批號：RA20065）、Ald ELISA試劑盒（批號：RA20556）均購于武漢貝茵萊生物科技有限公司;ET-1 兔 pAb（ABclona生物公司，批號：AB2757337）;SABC-POD兔IgG試劑盒（批號：SA1028）、DAB顯色試劑盒（批號：15F16BA00）、Mayor’蘇木素（批號：16C10A05）、中性樹膠（批號：AR0038）均采購于BOSTER生物公司。

1.7.3? 給藥方法? 空白組常規(guī)喂養(yǎng)，每次予以3 mL純凈水進行灌胃，早晨、下午各1次。模型組進行造模處理后，常規(guī)飲食，每次予以3 mL純凈水進行灌胃，早晨、下午各1次。中藥組在造模成功后，予以濃縮含生藥液20.29 g/kg進行灌胃，早晨、下午各1次。西藥組予以含卡托普利混懸液2.11 mg/kg進行灌胃，早晨灌藥，下午為純凈水。均連續(xù)干預(yù)4周。大鼠給藥劑量換算參考公式：Db’=Da*Rab*Sb，Db’為動物b實際體質(zhì)量下所需藥物劑量，Da為動物a標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量下藥物劑量，Rab為標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量下的動物a到動物b的換算系數(shù)，Sb為非標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量動物b的校正系數(shù)[12]。得出大鼠灌胃劑量。成人取標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量60 kg，給藥前大鼠平均體質(zhì)量約280 g。

1.7.4? 取材? 4組大鼠于末次灌胃后2 h，運用10%水合氯醛進行麻醉[5]，麻醉成功后置于冰臺操作，行腹主動脈采血，靜置半小時后離心15 min，溫度設(shè)定為4 ℃，速度3000 r/min，離心半徑8.5 cm，離心后保留血清;大鼠采血后當(dāng)場剝離胸主動脈經(jīng)PBS沖洗，置于4%多聚甲醛樣本固定液中固存。

1.8? 指標(biāo)檢測

1.8.1? HE染色觀察大鼠胸主動脈組織病理改變? 每組從4%多聚甲醛固定液中取出2個樣本，經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明后，浸蠟、包埋，切成薄片，經(jīng)烘干后脫蠟，再行HE染色、樹膠封片。最后低倍鏡選擇視野，200倍鏡下攝片，觀察胸主動脈組織病理變化。

1.8.2? 血液生化指標(biāo)檢測? 從冰箱中取出血清標(biāo)本，室溫下放置，進行解凍，按照試劑盒說明書步驟操作，采用ELISA法檢測血漿Renin、AngⅡ、Ald的水平。用標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度[13]。

1.8.3? 免疫組化法檢測各組大鼠胸主動脈ET-1的表達? 每組從4%多聚甲醛樣本固定液中取出3個樣本，進行免疫組化檢測，遵照試劑盒說明書操作。每張切片隨機取2個不同視野（400倍），棕黃色的成像即為陽性表達，使用圖像分析軟件分別計算組織面積（Area）、積分光密度值（IOD）及平均光密度值（AOD），AOD=IOD/Area[5]。

1.9? 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。計量資料以“x±s”的方式表示。多組間的比較滿足正態(tài)分布及方差齊性時，采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD法;不滿足正態(tài)性分布或方差不齊性時，用非參數(shù)檢驗，兩組比較采用秩和檢驗。檢驗水準(zhǔn)設(shè)置P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? 祛瘀平肝化痰湯的潛在化學(xué)成分

通過TCMSP、BATMAN、TCMIP數(shù)據(jù)庫檢索到祛瘀平肝化痰湯中11味中藥化學(xué)成分共576個，其中澤瀉31個、天麻25個、石菖蒲23個、全蝎3個、蒺藜20個、鉤藤72個、葛根45個、茯苓54個、當(dāng)歸107個、丹參131個、白芍65個。其中，sitosterol為葛根、鉤藤、當(dāng)歸、白芍、蒺藜、澤瀉所共有，kaempferol為鉤藤、蒺藜、石菖蒲、白芍所共有，20-hexadecanoylingenol為天麻、全蝎所共有，整理去重后中藥化學(xué)成分為310個。

2.2? 祛瘀平肝化痰湯抗高血壓病的可能作用靶點

SWISS、SRING數(shù)據(jù)庫篩選的藥物成分靶點為5348個，去重后得到1366個靶點，繪制中藥-成分-靶點統(tǒng)計信息。見表1。通過OMIM、TTD、GeneCards、DisGeNET、CTD數(shù)據(jù)庫查找EH病的靶點，去重復(fù)后得到343個。將藥物可能作用靶點及EH相關(guān)靶點錄入Venny平臺繪制韋恩圖。見圖1。取交集后共162個，表明祛瘀平肝化痰湯可能調(diào)節(jié)多靶點來發(fā)揮作用。

2.3? PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將162個共同靶點導(dǎo)入STRING 11.5數(shù)據(jù)庫，設(shè)置combined score≥0.07，得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，利用Cytoscape 3.9軟件將蛋白互作網(wǎng)絡(luò)可視化。見圖2。運用Cytoscape 3.9的CytoHubba功能，分別以MCC、Betweenness、Closeness、Degree為計算指標(biāo)篩選出排名前20的關(guān)鍵靶點，整理去重后的關(guān)鍵靶點有EDN1、NOS3、INS、ALB、EGFR、TNF、VEGFA、AKT1、IL6、ACE、NOS2等34個。見圖3。

2.4? GO富集分析及KEGG通路注釋分析

將162個潛在靶點導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO富集分析（P<0.05），共得到418個生物過程，44個細胞成分，94個分子功能。見圖4。生物過程主要涉及腺苷酸環(huán)化酶激活腎上腺素能受體信號通路、血管收縮調(diào)節(jié)、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、平滑肌細胞增殖的正調(diào)控、血壓調(diào)節(jié)、細胞對缺氧的反應(yīng)、平滑肌收縮的正向調(diào)節(jié)、細胞對藥物的反應(yīng)等;在細胞成分中，主要涉及細胞質(zhì)膜、質(zhì)膜的組成部分、膜筏、細胞外空間、受體復(fù)合物、電壓門控鈣通道復(fù)合體等;分子功能主要包括腎上腺素結(jié)合、支架蛋白結(jié)合等。

KEGG分析（P<0.05）共富集到68條信號通路。見圖5。主要集中在鈣信號通路、心肌細胞中的腎上腺素能信號傳導(dǎo)、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、腎素-血管緊張素系統(tǒng)、腎素分泌、血管內(nèi)皮生長因子信號通路、脂肪細胞脂解的調(diào)節(jié)、腫瘤壞死因子信號通路等。上述生物功能及信號通路與祛瘀平肝化痰湯治療EH病密切相關(guān)。

2.5? 實驗驗證結(jié)果

2.5.1? 各組大鼠胸主動脈的病理形態(tài)變化? HE染色中，空白組大鼠胸主動脈內(nèi)膜結(jié)構(gòu)完善，內(nèi)皮平整，表面光滑、無凹凸樣突起及缺損，中膜平滑肌細胞排列整齊，外膜與中膜分界明顯。模型組大鼠動脈內(nèi)膜結(jié)構(gòu)較紊亂，內(nèi)皮欠光滑，表面有凹凸樣突起及缺損，中膜增厚，外膜與中膜分界不清晰。中藥組和西藥組大鼠主動脈內(nèi)膜結(jié)構(gòu)基本完善，內(nèi)皮大致完整，內(nèi)膜較模型組光滑，外膜與中膜分界較清楚。見圖6。

2.5.2? 各組大鼠RAAS相關(guān)的生化指標(biāo)? 經(jīng)灌胃4周后，模型組與空白組相比，Renin、Ang Ⅱ、Ald均顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;中藥組、西藥組經(jīng)灌胃4周后，與模型組相比，Renin、AngⅡ、Ald均顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;中藥組與西藥組相比，經(jīng)灌胃4周后，Renin、AngⅡ、Ald指標(biāo)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.5.3? 大鼠胸主動脈ET-1表達結(jié)果? 鏡下可見，ET-1免疫陽性表達于胸主動脈血管內(nèi)膜、中膜平滑肌細胞胞漿內(nèi)及外膜纖維中，呈棕黃色染色。見圖7?？瞻捉M的表達顯著低于模型組（P<0.01）;模型組比各給藥組ET-1陽性表達較高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而中藥組與西藥組相近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

3 討論

中醫(yī)學(xué)將EH歸納為“眩暈”“頭痛”等病癥，多數(shù)醫(yī)家遵從“諸風(fēng)掉眩，皆屬于肝”的思想，對本病的病因病機認識以肝風(fēng)、肝陽來立論。而結(jié)合當(dāng)今社會環(huán)境來看，EH具有病機復(fù)雜、纏綿難愈、須長期服藥等特點。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對高血壓的早期診斷、早期用藥干預(yù)，使升高的血壓可以被迅速控制，直接改變了EH的自然進程，因此，對高血壓的中醫(yī)學(xué)病機探討值得重新審視。胡國恒教授經(jīng)過長期臨床實踐，對EH的認識形成了“痰濁瘀毒為病理因素，肝腎失調(diào)為發(fā)病關(guān)鍵，血絡(luò)形成為發(fā)病根本”的理論體系，自擬驗方祛瘀平肝化痰湯來治療EH[6]。

中藥組方貫徹了中醫(yī)治療疾病時強調(diào)的整體觀念、辨證論治思想。中藥復(fù)雜的化學(xué)成分決定了其藥理機制往往是能同時對多個所治療疾病的信號通路、蛋白靶點進行調(diào)節(jié)，以達到相應(yīng)的治療目的。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，祛瘀平肝化痰湯的組方藥物，具有許多調(diào)控EH的活性成分，方中鉤藤的有效成分鉤藤堿能有效降低EH大鼠的血清以及心肌中的 Ang Ⅱ表達，同時能對腎組織中ACE mRNA起到下調(diào)作用[14];研究表明蒺藜的有效成分能通過IKK-β/NF-KB信號通路干預(yù)血壓調(diào)節(jié)中樞[15];葛根素可降低血漿中Renin、Ang Ⅱ的水平[16];丹參酮ⅡA能調(diào)節(jié)心肌組織中腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system， RAS）的不同成分表達[17];當(dāng)歸萃取的揮發(fā)油可干預(yù)ACE2-Ang（1-7）-MasR軸拮抗ACE系統(tǒng)以調(diào)節(jié)血壓[18];白芍總苷能夠調(diào)節(jié)RAS，拮抗炎癥介質(zhì)和自由基的生成[19];茯苓、澤瀉功擅利水滲濕，石菖蒲長于豁痰化濕，部分文獻報道指出此三者的降壓作用與促進利尿相關(guān)，其具體機制有待進一步驗證[20]。

通過運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析祛瘀平肝化痰湯的組成藥物，經(jīng)過SWISS與STRING數(shù)據(jù)庫挖掘，發(fā)現(xiàn)其作用靶點有1366個，這與經(jīng)過OMIM、TTD、GeneCards等數(shù)據(jù)庫查找的505個EH靶點有162個交集。最終通過篩選得到34個關(guān)鍵蛋白靶點，包括EDN1、NOS3、INS、ALB、EGFR、TNF、VEGFA、AKT1、IL6、ACE、NOS2等。其中EDN1能夠干預(yù)全身動靜脈的收縮，并調(diào)控腎素分泌，在循環(huán)系統(tǒng)的穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用[21];NOS3、NOS2屬于內(nèi)皮NO合成酶，通過生成NO來維持血管擴張的穩(wěn)態(tài)，可以干預(yù)偏頭痛及動脈高血壓的發(fā)生[22];ACE是RAAS中最重要的成分之一，在心血管疾病中具有重要的調(diào)控作用，目前仍然是用于開發(fā)治療相關(guān)疾病的重要藥物靶點[23];TNF及VEGFA主要參與調(diào)解血管內(nèi)皮炎癥、增殖等病理生理變化，也會對心血管系統(tǒng)產(chǎn)生部分影響。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)關(guān)鍵靶點結(jié)果與現(xiàn)代藥理實驗研究結(jié)合表明，祛瘀平肝化痰湯可以通過EDN1、NOS3、ACE等關(guān)鍵靶點對EH起到治療作用。

將祛瘀平肝化痰湯抗EH的162個靶點經(jīng)過GO、KEGG富集分析可以發(fā)現(xiàn)，祛瘀平肝化痰湯主要通路為鈣通道信號通路、心肌細胞中的腎上腺素能信號傳導(dǎo)、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、腎素-血管緊張素系統(tǒng)、腎素分泌、血管內(nèi)皮生長因子信號通路、脂肪細胞脂解的調(diào)節(jié)、腫瘤壞死因子信號通路等。這些通路表明祛瘀平肝化痰湯具有較好的靶向干預(yù)作用。以鈣信號通路為例，動脈的收縮需要Ca2+及鈣通道的活化參與，動脈平滑肌細胞（artery smooth

muscle cells， ASMCs）中有鈣敏感受體的表達[24]，同時Ca2+通道分布與開放對RAAS也有明顯的干預(yù)作用[25]。富集分析的同時表明祛瘀平肝化痰湯作用靶點涉及調(diào)控心肌細胞中的腎上腺素能信號傳導(dǎo)、腎素-血管緊張素系統(tǒng)、腎素分泌等通路，三者均為RAAS的調(diào)控范疇。神經(jīng)活性配體-受體相互作用、脂肪細胞脂解的調(diào)節(jié)在細胞和全身組織影響穩(wěn)態(tài)代謝信號，在EH的狀態(tài)下二者的正常作用受到干擾，可能與相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生有關(guān)系。血管內(nèi)皮生長因子信號通路則往往參與血管生成及影響血管分布的組織細胞的遷移情況，EH狀態(tài)下往往造成血管內(nèi)皮的損傷，誘發(fā)該通路的活化。

本課題組據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果推測，祛瘀平肝化痰湯能夠通過上述途徑改善血管狀態(tài)，降低心肌及血管收縮力來起到降壓的效果，并對血管內(nèi)皮具有保護作用。運用祛瘀平肝化痰湯對L-NNA 所致的高血壓大鼠模型進行實驗干預(yù)。結(jié)果表明，祛瘀平肝化痰湯干預(yù)后的中藥組大鼠胸主動脈的病理形態(tài)較模型組改善;中藥組血漿中Renin、Ang Ⅱ、Ald的含量較模型組低（P<0.05），表明其對RAAS具有調(diào)控作用;免疫組化分析血管活性物質(zhì)ET-1的表達，發(fā)現(xiàn)中藥組較模型組低（P<0.05），說明祛瘀平肝化痰湯具有較好的血管內(nèi)皮保護作用。

RAAS在循環(huán)系統(tǒng)中表現(xiàn)出巨大的生理調(diào)控作用，各個器官都會受到RAAS激活以及由此產(chǎn)生的高血壓、炎癥和細胞增殖、纖維化的損害[26]，Renin和Ang Ⅱ的分泌過多會導(dǎo)致大量的慢性和急性疾病，長期高血壓最終會導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷，尤以腎小球血管損傷最為嚴(yán)重，這往往又能刺激腎素分泌的增加，形成惡性循環(huán)。因此，拮抗RAAS的相關(guān)環(huán)節(jié)，目前是治療EH中藥物開發(fā)的重要關(guān)注點。血管平滑肌收縮構(gòu)成血壓升高的外周循環(huán)阻力，這往往與ET-1的釋放密切相關(guān)，因此，拮抗血管內(nèi)皮收縮肽制劑的研發(fā)，已經(jīng)成為一個新的值得關(guān)注的領(lǐng)域。

綜上所述，祛瘀平肝化痰湯具有多靶點、多途徑的抗EH作用。本次實驗僅通過其干預(yù)RAAS中的相關(guān)指標(biāo)及ET-1的表達，來探討其治療EH的可行性，但仍需進一步的臨床及基礎(chǔ)研究提供支持。

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