李亞麗 孔令娥 劉 蜜 汪 洪* 蘇志明

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081； 2.國家化肥質量檢驗檢測中心(北京)，北京 100081； 3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質量安全肥料源性因子風險評估實驗室(北京)，北京 100081； 4.中國合格評定國家認可委員會，北京 100081)

水溶肥料中氮養(yǎng)分形態(tài)主要有銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和尿素態(tài)氮，養(yǎng)分高、水溶性好，適合現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，節(jié)水、省肥、高效，廣泛用于各種糧食、蔬菜、果樹等經(jīng)濟作物，發(fā)展迅猛，但目前尚未見對水溶肥料中硝態(tài)氮含量及其檢測方法單獨作出規(guī)定[1-3]。

目前，肥料中硝態(tài)氮的測定方法有重量法、分光光度法、離子色譜法、高效液相色譜法、拉曼光譜法等[4-5]。國家標準《肥料中硝態(tài)氮含量的測定氮試劑重量法》(GB/T 3597—2002)規(guī)定了肥料中硝態(tài)氮含量的測定方法為氮試劑重量法，適用于各種肥料中硝態(tài)氮含量的測定，但當9倍于氮含量的過量氯化物存在時，測定結果偏高，且操作步驟煩瑣，測試時間長，檢驗過程中容易引起誤差，造成測定結果的重現(xiàn)性較差。農(nóng)業(yè)行業(yè)標準《肥料硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、酰胺態(tài)氮含量的測定》(NY/T 1116—2014)規(guī)定了紫外分光光度法測定肥料中硝態(tài)氮含量，適用于硝態(tài)氮含量較低的樣品，當試樣中硝態(tài)氮濃度過高時，試樣可能因稀釋倍數(shù)較大，導致測定結果誤差偏大。離子色譜法、高效液相色譜法、拉曼光譜法等方法靈敏度高，穩(wěn)定性好，但成本較高，分離步驟較為復雜，肥料中可能含有的Cl-、SO42-、PO43-等與NO3-共存的陰離子對NO3-產(chǎn)生一定的影響[6]。

連續(xù)流動分析儀法是采用空氣片段連續(xù)流動分析技術，將試樣溶液和試劑在一個連續(xù)流動的系統(tǒng)中均勻混合[7]，在硫酸銅作催化劑的堿性溶液中，用聯(lián)氨將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，亞硝酸鹽與磺胺和對氨基苯磺酰胺及 N-(1-萘基)乙二胺二鹽酸鹽(C10H7NH2CHCH2NH2·2HCl，簡稱NEDD)反應生成粉紅色絡合物，在波長550 nm處測定其吸光度，其吸光度大小與硝酸根離子濃度成正比，從而測定硝態(tài)氮含量。連續(xù)流動分析儀法采用自動化分析，人為因素干擾較小，精度高、重現(xiàn)性好、能大幅度提高分析速度，更適用于批量樣品的分析，廣泛應用于土壤[8]、水體[9]中硝態(tài)氮的測定，但有關肥料中硝態(tài)氮的測定還不多見。本文選擇6個不同的水溶肥料樣品，探討利用連續(xù)流動分析儀測定其中硝態(tài)氮的含量，將其測定結果與紫外分光光度法測定結果進行對比分析，以為生產(chǎn)和科研中硝態(tài)氮的測定提供參考。

1 實驗部分

1.1 試樣制備

試驗樣品選取了含腐植酸水溶肥料、有機水溶肥料、微量元素水溶肥料、大量元素水溶肥料4類，樣品6個，其中固體樣品2個，液體樣品4個，分別編號為S1，L2，L3，L4，S5，L6。固體樣品縮分至約100 g，將其迅速研磨至全部通過0.50 mm孔徑實驗篩，混合均勻，置于潔凈、干燥容器中；液體樣品經(jīng)多次搖動后，迅速取出約100 mL，置于潔凈、干燥容器中。

1.2 儀器設備

AutoAnaLyzer 3連續(xù)流動分析儀(SeaLAnaLyticaLGmbh)；UV-2501PC紫外分光光度計(SHIMEDZU)；Y JY-2112F振蕩器(恒宇分析儀器有限公司)；XS105 DU分析天平(感量為0.000 1 g，METTLER TOLEDO)。

1.3 主要試劑

鹽酸溶液(1+1)、實驗用水均為三級水。

硝態(tài)氮標準溶液(2.5 g/L)：準確稱取9.022 5 g 于 120 ℃干燥至恒重的硝酸鉀于50 mL燒杯中，用水溶解后移入500 mL容量瓶中，定容，混勻，備用。

顯色劑：稱取10 g磺胺、0.5 g NEDD 溶解于600 mL蒸餾水中，待完全混合后，加入100 mL磷酸，并用蒸餾水定容至1 000 mL，混勻，用棕色試劑瓶避光儲存。

氫氧化鈉試劑：將10 g氫氧化鈉溶于600 mL蒸餾水中，加入3 mL磷酸，完全混合后，用蒸餾水定容至1 000 mL，再加1 mL Brij-35助化劑(進口表面活性劑，潤滑泵管)混合均勻。保持溶液清潔，可持續(xù)使用。

硫酸肼試劑：在600 mL蒸餾水中分別加入10 mL硫酸銅溶液(1 g/L)、10 mL硫酸鋅溶液(10 g/L)和2 g硫酸肼，定容至1 000 mL。每周制備新鮮試劑。

1.4 樣品浸提

稱取試樣1.0 g(精確至0.000 1 g)于250 mL容量瓶中，加入25 mL水和25 mL鹽酸溶液(1+1)，混合，靜置至無氣體放出。加入約100 mL水，在振蕩器上振蕩30 min(振蕩頻率以容量瓶內(nèi)試樣能自由翻動即可)。加水定容，混勻，干過濾，待測。

1.5 測定

浸提液直接或稀釋后注入連續(xù)流動分析儀自動進樣系統(tǒng)。連續(xù)流動分析儀測定試樣中硝態(tài)氮的原理是在堿性條件下，NO3-—N 被硫酸肼還原成NO2-—N，然后與對氨基苯磺酰胺生成重氮鹽，再與N-(1-萘基)乙二胺二鹽酸鹽(NEDD)偶聯(lián)生成粉紅色的化合物，測定吸光值。流動分析儀設置進樣速率30樣/h，蠕動泵泵速25 r/min，進樣與清洗比為 3.0∶1，進樣時間90 s，清洗時間30 s。儀器默認設置基線和漂移校正，自動基線參比為 4%；比色濾光片波長為550 nm，燈強度大于 l 000 mV。

紫外分光光度計測定硝態(tài)氮原理是利用硝酸根發(fā)色團在紫外區(qū)210 nm附近有明顯吸收且吸光度與硝酸根離子濃度成正比的特性，測定硝態(tài)氮含量。測定使用1 cm比色皿，以0 mg/L為標準溶液調(diào)零，將浸提液稀釋至合適濃度，上機測定。

2 結果與討論

2.1 顯色劑的穩(wěn)定時間

硫酸肼作為還原劑將NO3-—N還原成NO2-—N，然后與顯色劑反應生成粉紅色的化合物。實驗中發(fā)現(xiàn)，硫酸肼放置一段時間后，會影響顯色效果，使得標準曲線相關性差，故對其在放置不同時間的還原能力進行驗證。用不同放置時間的硫酸肼測定標準曲線，其結果如表1所示。結果表明，硫酸肼在放置過程中，其還原能力會逐漸下降，因此適宜的線性范圍最高濃度會逐漸減小，所以標準曲線線性相關系數(shù)R2值下降，測定的準確度降低。因此，最好使用冷藏保存未超過7 d的硫酸肼。

表1 硫酸肼不同放置時間測定NO3-—N的 測定結果

2.2 泵速優(yōu)化

連續(xù)流動分析儀測定試樣中硝態(tài)氮可使試樣溶液與試劑在管路內(nèi)充分混合反應，但其導致檢測時間較長，為了提高實驗效率，本實驗對泵速進行了優(yōu)化。保持其他測定條件不變，分別設置泵速為 10、12、15、20、25、30 r/min，依次測定硝態(tài)氮的濃度為200 mg/L標準溶液的吸光度。結果表明，隨著泵速增大，吸光度顯著提高，當泵速達到 25 r/min 時，吸光度信號最強，之后趨于平緩。

2.3 進樣時間的優(yōu)化

在保證完全反應的基礎上，逐步縮短進樣時間，以吸光度峰高穩(wěn)定為最佳的進樣時間。分別設置進樣時間為 20、40、60、80、100、120 s，依次測定硝態(tài)氮的濃度為200 mg/L標準溶液的吸光度。結果表明，隨著進樣時間的延長，峰高不斷提高，在 80 s 后峰高逐漸趨于平緩(圖1)。

圖1 進樣時間與峰高關系曲線Figure 1 Correlation curve between injection time and peak height.

2.4 標準工作曲線的測定

選擇硝態(tài)氮的濃度分別為0、25、50、100、200 mg/L，儀器測定的信號值峰高與標準溶液 NO3-—N濃度之間進行線性回歸，制作校準曲線如圖2示，0～200 mg/L范圍內(nèi)標準工作曲線的回歸方程為y=300.97x+3853.4，R2=0.9992，滿足測定需要。

圖2 硝態(tài)氮含量測定標準曲線Figure 2 Standard curve for determination of nitrate nitrogen content.

2.5 檢出限

檢出限的計算方法是用空白試劑進行多次(n>10)測定，測得數(shù)據(jù)如圖3所示。根據(jù)國際純粹與應用化學聯(lián)合會(IUPAC)檢出限測定方法[10]，計算空白溶液測定結果的標準方差SD，并根據(jù)標準計算出檢出限MLD=3×SD，可得連續(xù)流動分析儀法的儀器檢出限為0.032 mg/L，按照稱取試樣1.000 0 g溶于250 mL容量瓶計算，方法檢出限為0.008 g/kg。

圖3 空白溶液硝態(tài)氮含量結果Figure 3 Results of nitrate nitrogen content in blank solution.

2.6 方法的精密度實驗

選擇水溶肥料樣品S1、S2、S3、S4、S5、S6，開展平行重復實驗，每個樣品做6組平行，依次利用連續(xù)流動分析儀測出相應的硝態(tài)氮(NO3-—N)濃度，測定結果如表2所示。結果表明，測定結果相對標準偏差(RSD，n=6)在1.7%～8.3%，未出現(xiàn)較大偏差。

表2 連續(xù)流動分析儀測定結果

2.7 加標回收實驗

向6個水溶肥料試樣中加入一定量的硝態(tài)氮(NO3-—N)標準溶液，利用連續(xù)流動分析儀進行回收率的測定，計算加標回收率，測定結果如表3所示。結果表明，加標回收率在93.2%～101%，表明該方法準確度較好。

表3 回收率測定結果

2.8 樣品測定與方法比較

6個試樣分別進行6個平行浸提，浸提液分別利用連續(xù)流動分析儀法和紫外分光光度法對其中硝態(tài)氮(NO3-—N)進行測定，分別得到36個測定數(shù)據(jù)(圖4)。兩種方法測定硝態(tài)氮(NO3-—N)含量范圍分別為0.01%～13.06%和0.03%～12.79%。t檢驗的雙尾P值小于 0.05(表4)，表明兩種方法測定結果之間無顯著性差異[11]。

2.9 相關性分析

將紫外分光光度法和連續(xù)流動分析儀的測定結果進行相關性分析(圖5)。兩種方法測定數(shù)據(jù)之間擬合方程為y=0.9782x+0.0768，R2=0.9966，其中x為連續(xù)流動分析儀測定硝態(tài)氮含量，y為紫外分光光度計測定硝態(tài)氮含量，兩種方法的測定結果之間呈現(xiàn)較好的一致性。

圖4 連續(xù)流動分析儀法與紫外分光光度法 測定肥料樣品中硝態(tài)氮(NO3-—N)結果比較Figure 4 Comparison of the results of continuous flow analyzer method and ultraviolet spectrophotometric method for determination of nitrate nitrogen (NO3-—N) in fertilizer samples.

表4 t檢驗-成對雙樣本均值比較分析連續(xù)流動 分析儀法與紫外分光光度法測定結果

圖5 不同方法測定硝態(tài)氮含量之間相關性分析Figure 5 Correlation analysis between different methods of determining nitrate nitrogen content.

3 結論

利用連續(xù)流動分析儀在波長550 nm處測定水溶肥料中硝態(tài)氮的含量。從標準曲線可以看出，流動分析儀法有很好的線性關系。通過對硫酸肼和顯色劑的穩(wěn)定時間、泵速、進樣時間等實驗條件進行優(yōu)化，選取了最佳檢測條件，提高了檢測效率。同時測定結果表明，檢出限為0.032 mg/L，方法檢出限為0.008 g/kg，回收率在93.3%～101%，符合正常的分析范圍，說明本實驗具有一定的準確度；測定結果的相對標準偏差在1.7%～8.3%，符合正常分析范圍，說明本實驗具有一定的精密度；所得數(shù)據(jù)與紫外分光光度計測定結果對比分析，t檢驗結果表明兩種方法無顯著差異，兩種方法測定數(shù)據(jù)之間擬合方程為y=0.9782x+0.0768，R2=0.9966，線性相關性較高。

綜上所述，采用連續(xù)流動分析儀法測定水溶肥料中硝態(tài)氮的方法是可行的。此方法由電腦控制進行進樣測定，分析速度快，消耗試劑少，準確度與精確度較高，適用于大批量的水溶肥料樣品硝態(tài)氮含量的測定。