劉笑笑 金 秋 張振都 張 奇 宋志峰 魏春雁*

(1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院/吉林省農(nóng)業(yè)環(huán)境與農(nóng)產(chǎn)品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130033； 2.吉林省吉測(cè)檢測(cè)技術(shù)有限公司，長(zhǎng)春 130117)

硒是人和許多生物所必需的微量元素，具有抗氧化、提高免疫力、降低血糖等多種功能[1-7]，但其在體內(nèi)的安全含量存在一個(gè)較小的范圍，缺少會(huì)引發(fā)許多疾病，過(guò)量亦會(huì)引起生物體中毒。

硒元素有益和有毒主要取決于該元素存在的化學(xué)形態(tài)和含量[8]，因此，建立靈敏度高、穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確可靠的硒形態(tài)檢測(cè)方法尤為重要。

目前，采用電感耦合等離子質(zhì)譜、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜、原子吸收光譜和原子熒光光譜等元素分析儀結(jié)合水提、酸提、酶提等提取方法進(jìn)行硒形態(tài)定性定量分析[9-12]，但在實(shí)際檢測(cè)分析時(shí)，常面臨基質(zhì)復(fù)雜、形態(tài)多樣和含量低等問(wèn)題?；诖?，采用超聲輔助酶法提取-原子熒光光譜法測(cè)定，系統(tǒng)分析了影響硒形態(tài)提取及分離的因素，建立了適宜富硒黑木耳中硒形態(tài)分析檢測(cè)的方法，為客觀評(píng)價(jià)富硒黑木耳質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

富硒木耳，采購(gòu)于伊春金瑞森林食品有限公司，粉碎后，過(guò)150 μm篩網(wǎng)，置于陰涼干燥處保存。

硒代蛋氨酸溶液(Selenomethionine，Se-Met，97.9 μg/g)、硒代胱氨酸溶液(Selenocystine，Se-Cys，93.5 μg/g)、甲基-硒代半胱氨酸溶液(Methyl Selenocysteine，Se-MSeC，96.6 μg/g)、亞硒酸根溶液(SeO32-，68.9 μg/g)、硒酸根溶液(SeO42-，75.1 μg/g)均購(gòu)自中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，木瓜蛋白酶、鏈霉蛋白酶E購(gòu)自Solarbio 生命科學(xué)公司，甲醇(色譜純，賽默飛世爾科技有限公司)，磷酸氫二胺(優(yōu)級(jí)純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)，四丁基溴化銨(分析純，麥克林)，鹽酸(優(yōu)級(jí)純，西隴化工股份有限公司)，氫氧化鉀(優(yōu)級(jí)純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)，硼氫化鉀(分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)，碘化鉀(分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠)，甲酸(分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)，實(shí)驗(yàn)用水均為實(shí)驗(yàn)室超純水。

1.2 儀器設(shè)備

SA-10原子熒光形態(tài)分析儀(北京吉天儀器有限公司)，硒原子熒光空心陰極燈(北京有色金屬研究總院)，HZQ-C空氣振蕩器(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù))，KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，BT 124S 電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 儀器條件

1)色譜條件

Hamilton PRP-X100離子交換色譜柱(250 mm×4.1 mm，10 μm)，流動(dòng)相為磷酸氫二銨(40 mmol/L)+四丁基溴化銨(0.5 mmol/L)，用甲酸(20%)調(diào)節(jié)pH 值為6.0。流量1.0 mL/min，進(jìn)樣體積100 μL。

2)原子熒光光譜條件

負(fù)高壓300 V，燈電流90 mA，載氣流量400 mL/min，屏蔽氣流量600 mL/min，原子化器高度8 mm。

3)氫化物發(fā)生條件

碘化鉀(4 g/L) + 氫氧化鉀(3.5 g/L，氧化劑)，硼氫化鉀(20 g/L) + 氫氧化鉀(3.5 g/L，還原劑)，鹽酸(10%，載流)，轉(zhuǎn)速80 r/min。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確移取各標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL，分別置于50 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，即得硒酸根(SeO42-，1.660 μg/mL)、亞硒酸根(SeO32-，1.716 μg/mL)、硒代胱氨酸(Se-Cys，1.768 μg/mL)、硒代半胱氨酸(MSeC，1.392 μg/mL)、硒代蛋氨酸(Se-Met，1.576 μg/mL)的標(biāo)準(zhǔn)溶液，4 ℃儲(chǔ)存。

分別再用標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成40、80、120、160、200 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.3 待測(cè)溶液制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取樣品0.1 g(精確至0.000 1 g)于離心管中，按料液比(1∶60)加入木瓜蛋白酶溶液6 mL，于超聲波清洗器中，水溫設(shè)定37 ℃(鏈酶蛋白酶E在37 ℃時(shí)效率最穩(wěn)定)，提取45 min，每隔10 min搖晃一次離心管。8 000 r/min離心20 min，上清液經(jīng)0.45 μm微孔水系濾膜過(guò)濾，得樣品待測(cè)液，備上機(jī)檢測(cè)。同時(shí)做試劑空白實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取劑的篩選

以普通木耳為試驗(yàn)樣品，對(duì)5種硒形態(tài)分別添加回收，考察了甲醇溶液(50%)、檸檬酸溶液(0.1 mol/L)、氫氧化鈉溶液(0.1 mol/L)、木瓜蛋白酶溶液(100 g/L)和鏈酶蛋白酶 E溶液(3 mg/mL)對(duì)5種硒形態(tài)的提取效果。

從表1中可以看出，甲醇溶液(50%)、檸檬酸溶液(0.1 mol/L)可以提取亞硒酸和硒酸2種無(wú)機(jī)硒形態(tài)，對(duì)于其他3種有機(jī)硒形態(tài)無(wú)法提取。通過(guò)亞硒酸的回收率結(jié)果分析，可能存在硒形態(tài)之間的轉(zhuǎn)化，使亞硒酸的回收率偏高。氫氧化鈉溶液(0.1 mol/L)在提取過(guò)程中，木耳上清液更加黏稠、渾濁，無(wú)法通過(guò)濾膜，達(dá)不到上清液澄清的提取效果。木瓜蛋白酶與鏈酶蛋白酶 E 屬于蛋白水解酶，其中木瓜蛋白酶對(duì)木耳中甲基-硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸提取效果較好，而其他3種形態(tài)無(wú)法提??；鏈酶蛋白酶 E 對(duì)5種硒形態(tài)的提取率高，上清液澄清。

表1 不同提取劑對(duì)硒形態(tài)提取率的影響

2.2 提取方式、時(shí)間及料液比的篩選

木耳多糖含量高，遇水膨脹，上清液黏稠，且黏稠的溶液易將未泡發(fā)的木耳粉末包裹住形成結(jié)塊，附著在容器壁上，泡發(fā)不充分，在提取過(guò)程中會(huì)造成浪費(fèi)、提取不完全等情況(見(jiàn)圖1a)。

從木耳泡發(fā)狀態(tài)上比較，振蕩提取方式比超聲提取方式更容易使木耳充分的泡發(fā)，在振蕩過(guò)程中，木耳粉末容易散開(kāi)不形成結(jié)塊(見(jiàn)圖1b)。但是振蕩提取時(shí)間比超聲提取時(shí)間長(zhǎng)，有機(jī)形態(tài)通常不穩(wěn)定，尤其是硒代胱氨酸與硒代蛋氨酸之間容易轉(zhuǎn)化，長(zhǎng)時(shí)間振蕩過(guò)程中容易發(fā)生分解或轉(zhuǎn)化。因此采用超聲輔導(dǎo)提取方式，時(shí)間控制在 60 min 以?xún)?nèi)，5種形態(tài)可以保持穩(wěn)定。在超聲的過(guò)程中，每間隔 10 min，搖晃一次離心管，防止木耳粉末長(zhǎng)時(shí)間沉淀在離心管下層結(jié)塊或附著在管壁上。

從料液比的選擇上，分別對(duì)1/10、1/20、1/40、1/60、1/80、1/100進(jìn)行比較。稱(chēng)取木耳0.2 g依次加入純水2、4、8、12、16 mL，每隔15 min，觀察木耳泡發(fā)狀態(tài)。過(guò)少的提取液致使木耳遇水膨脹，如圖1E和1F所示，1/10和1/20的料液比時(shí)，木耳無(wú)法泡發(fā)完全，有明顯的結(jié)塊，上清液分離不完全，硒元素形態(tài)提取不充分，而使用過(guò)多的提取液導(dǎo)致最終硒元素形態(tài)含量檢測(cè)較少，結(jié)果不準(zhǔn)確。1/40、1/60、1/80在30 min內(nèi)能將木耳泡發(fā)完全(見(jiàn)圖1c)。1/40在離心過(guò)后，上清液過(guò)少，不易過(guò)膜，經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)確定采取1/60的料液比效果較好(見(jiàn)圖1d)。

綜上，提取方式上，超聲提取優(yōu)于振蕩提取，提取時(shí)間60 min為宜，料液比1/60效果相對(duì)較好。

2.3 碘化鉀濃度的篩選

碘化鉀的作用是氧化劑，其與硒酸發(fā)生氧化還原反應(yīng)，將硒酸還原為亞硒酸。碘化鉀的濃度直接影響硒酸的熒光強(qiáng)度。分別考察碘化鉀質(zhì)量濃度為3、4、5、6 g/L時(shí)5種硒形態(tài)的熒光強(qiáng)度。從圖 2中可以看出，當(dāng)?shù)饣浀馁|(zhì)量濃度增加時(shí)，只有硒酸和亞硒酸的熒光強(qiáng)度會(huì)隨著碘化鉀濃度的增加而升高，其他硒形態(tài)熒光強(qiáng)度差異不顯著。而當(dāng)?shù)饣浀馁|(zhì)量濃度大于 4 g/L時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值。因此選擇碘化鉀濃度為4 g/L。

圖1 木耳中硒形態(tài)提取方式、時(shí)間和料液比的選擇Figure 1 Selection of extracting method，time and ratio of solid to liquid of selenium from auricularia auricula.

圖2 碘化鉀的濃度對(duì) 5 種 硒形態(tài)熒光強(qiáng)度的影響Figure 2 Effect of concentration of potassium iodide on fluorescence intensity of five selenium forms.

2.4 流動(dòng)相濃度的確定

以磷酸鹽緩沖溶液為流動(dòng)相，分別考察了磷酸氫二銨的濃度為30、40、50 mmol/L 時(shí)5種硒元素形態(tài)的分離情況，結(jié)果如表2所示。流動(dòng)相的濃度對(duì)亞硒酸與硒酸出峰時(shí)間影響較大，對(duì)硒代胱氨酸、甲基-硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸出峰時(shí)間無(wú)明顯變化。隨著流動(dòng)相濃度升高，亞硒酸與硒酸出峰時(shí)間均提前。當(dāng)流動(dòng)相濃度為30 mmol/L 時(shí)，5種硒形態(tài)在 30 min 全部出峰，而亞硒酸與硒代蛋氨酸有重疊。當(dāng)流動(dòng)相濃度為40 mmol/L 時(shí)，亞硒酸與硒代蛋氨酸全部分離，5種硒形態(tài)在16 min 內(nèi)全部出峰。當(dāng)流動(dòng)相濃度為50 mmol/L 時(shí)，5種硒形態(tài)全部出峰時(shí)間縮短在12 min 內(nèi)，但亞硒酸又與前面的甲基-硒代半胱氨酸峰有重疊。因此，在5種硒形態(tài)峰完全分離的條件下，流動(dòng)相濃度40 mmol/L 為最佳檢測(cè)條件(圖3)。

表2 不同流動(dòng)相濃度對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

圖3 5種硒形態(tài)流出曲線圖Figure 3 The peak time five selenium forms.

2.5 線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確移取5種硒形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為40、80、120、160、200 μg/mL，用上述儀器條件依次測(cè)定，5種硒元素形態(tài)在16 min內(nèi)全部出峰，順序依次為硒代胱氨酸、甲基硒代-半胱氨酸、亞硒酸、硒代蛋氨酸、硒酸。

從圖4中可以看出，硒代胱氨酸、硒代半胱氨酸、亞硒酸、硒蛋氨酸、硒酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)分別為0.999 0、0.999 2、0.999 9、0.999 4、0.999 9。

2.6 檢出限實(shí)驗(yàn)

按照上述儀器條件，以試劑空白溶液為測(cè)試基準(zhǔn)，連續(xù)測(cè)定11 次，計(jì)算空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，DL=3SD/K(DL為檢出限，K為校正曲線斜率)；5種硒元素形態(tài)檢出限依次為：硒代胱氨酸0.35 μg/L，甲基硒代半胱氨酸 0.46 μg/L，亞硒酸 0.26 μg/L，硒代蛋氨酸 0.64 μg/L，硒酸 3.06 μg/L。

2.7 精密度實(shí)驗(yàn)

連續(xù)測(cè)定相同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液6針，計(jì)算各組分峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。5種硒元素形態(tài)RSD為別為2.4%、1.9%、0.90%、0.91%、2.0%。參見(jiàn)表3。

2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

同一份樣品溶液(溶液中5種硒形態(tài)本底值約為硒代胱氨酸60 μg/L、甲基硒代胱氨酸120 μg/L、亞硒酸120 μg/L、硒代蛋氨酸180 μg/L、硒酸120 μg/L)分別在0 、2、4、8、12 h時(shí)上機(jī)測(cè)定，測(cè)定結(jié)果計(jì)算RSD。5種硒元素形態(tài)RSD依次為1.7%、2.2%、2.7%、1.7%、1.6%，見(jiàn)表4。

2.9 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

取已知硒形態(tài)含量的富硒木耳6份，分別添加適量5種硒形態(tài)濃度，按上述樣品制備并定容至5 mL，使得添加濃度為30、60、120 μg/L(已知木耳中硒代蛋氨酸上機(jī)液濃度約為60 μg/L)，上機(jī)測(cè)定并計(jì)算回收率及RSD。結(jié)果表明，5種硒元素形態(tài)的加標(biāo)回收率在76.1%～108%，RSD值均小于3.9%，結(jié)果見(jiàn)表5。

圖4 5種硒形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Figure 4 5 Selenium form standard curve.

表3 精密度考察結(jié)果

表4 穩(wěn)定性考察結(jié)果

表5 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

3 結(jié)論

1)測(cè)定富硒木耳中硒形態(tài)含量時(shí)提取劑為鏈酶蛋白酶E，方式為超聲提取，提取時(shí)間為60 min，料液比為1/60。流動(dòng)相磷酸氫二銨為40 mmol/L，碘化鉀為4 g/L。

2)測(cè)定富硒木耳中硒形態(tài)含量時(shí)5種硒形態(tài)硒代胱氨酸、硒代半胱氨酸、亞硒酸、硒蛋氨酸、硒酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.999 0、0.999 2、0.999 9、0.999 4、0.999 9，檢出限低，分別為硒代胱氨酸0.35 μg/L、甲基-硒代半胱氨酸 0.46 μg/L、亞硒酸 0.26 μg/L、硒代蛋氨酸 0.64 μg/L、硒酸3.06 μg/L，加標(biāo)回收率為 76.1%～108%，精密度高、重現(xiàn)性好，方法穩(wěn)定、準(zhǔn)確可靠。