劉 欣 劉天豪 羅 琳 譚鑫源 彭宇晴 王 強(qiáng) 杜實(shí)之 周耀渝* 楊 遠(yuǎn)*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，長沙 410128； 2.中南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，水環(huán)境與農(nóng)產(chǎn)品安全湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 410083)

納米技術(shù)作為21世紀(jì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的主要驅(qū)動力之一，開拓了廣闊的市場空間，巨大的市場需求驅(qū)動著各種新型納米材料研發(fā)、投入、生產(chǎn)及使用。據(jù)報道，當(dāng)前已有超過1 800多種納米材料應(yīng)用在人們?nèi)粘Ｉ詈蜕a(chǎn)中，其中應(yīng)用最多的是金屬納米顆粒(Metallic nanoparticle，MNPs)，所占比例約為37%[1]。在眾多種類的MNPs中，PtNPs是一種商業(yè)化應(yīng)用較為廣泛的納米材料。目前已廣泛應(yīng)用于汽車尾氣催化劑、硝酸生產(chǎn)、腫瘤醫(yī)藥和生化傳感器等領(lǐng)域，各種新興的納米材料在環(huán)境中的積累可能會給人類生活健康帶來影響[2]。研究已證實(shí)PtNPs釋放進(jìn)入到環(huán)境中。汽車尾氣催化劑的鉑排放量主要以顆粒形式排放，顆粒大小從25 nm到300 nm不等[3]。研究人員在城市公路塵土、路邊土壤、植被及沉積物等環(huán)境介質(zhì)中均已檢測到高含量Pt元素。以PtNPs為主的MNPs正通過污泥回用、污水灌溉、化肥和農(nóng)藥施用、大氣沉降、工廠排放、固體廢棄物填埋等途徑進(jìn)入到農(nóng)用灌溉水中農(nóng)田土壤中。水土環(huán)境中PtNPs被農(nóng)作物吸收、累積，并通過食物鏈放大傳遞給人類，對人體健康造成潛在威脅。

闡釋PtNPs等MNPs在農(nóng)作物體內(nèi)的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和生物累積規(guī)律和特征，對于客觀評價農(nóng)產(chǎn)品金屬納米毒性效應(yīng)至關(guān)重要[4]。因此，開發(fā)可靠的農(nóng)產(chǎn)品中高靈敏度MNPs快速分析技術(shù)是非常有必要的。由于PtNPs具有超細(xì)尺寸的特性，其在植物體內(nèi)中定量分析及顆粒分布不能應(yīng)用傳統(tǒng)無機(jī)元素分析方法(如ICP-MS、ICP-OES或AAS等)[5-6]。與常規(guī)污染物相比，PtNPs的表征應(yīng)是多參數(shù)的表征，不僅需表征PtNPs的成分和濃度，還應(yīng)考慮對PtNPs的特性進(jìn)行表征(如粒度分布、顆粒組成和納米顆粒濃度等)。傳統(tǒng)表征納米顆粒的技術(shù)如動態(tài)光散射(DLS)、納米追蹤技術(shù)(NTA)和電子顯微鏡(EM)由于其靈敏度較低(檢出限一般為mg/L級別)，難以應(yīng)用于實(shí)際環(huán)境樣品中MNPs的表征。目前流場分離(FFF)、毛細(xì)管電泳(CE)、流動色譜(HDC)和反相色譜(RP-HPLC)等分離手段通常與ICP-MS聯(lián)用，均可用于MNPs的表征[7]。另一方面，單顆粒-電感耦合等離子體質(zhì)譜法(Single particle ICP-MS，SP-ICP-MS)是近年來發(fā)展起來的一種表征環(huán)境樣品中低濃度金屬基納米顆粒的高靈敏度分析方法[8-11]。該方法能夠同時提供MNPs 粒徑分布、納米顆粒濃度和納米顆粒質(zhì)量濃度等信息，該方法的檢出限可達(dá)到亞ng/L級別，為農(nóng)產(chǎn)品中MNPs的準(zhǔn)確測定提供了可行性。

將水體中MNPs定量分析技術(shù)應(yīng)用在植物介質(zhì)仍具有挑戰(zhàn)性。植物組織中MNPs分析的難點(diǎn)在于需保證植物組織中提取出 MNPs的自有性質(zhì)(如粒徑、形貌等)不發(fā)生變化，而且需要高靈敏度的技術(shù)對MNPs進(jìn)行表征。酶消解技術(shù)能夠在適宜的穩(wěn)定及溫和的pH值下將復(fù)雜基體中MNPs進(jìn)行分離。研究人員通過優(yōu)化不同植物介質(zhì)中 MNPs 的提取條件，采用 Macerozyme R-10 酶已成功提取植物樣品中MNPs(如AgNPs、AuNPs 和TiO2NPs等)[12-15]。

因此，本研究通過優(yōu)化酶消解參數(shù)，采用酶消解技術(shù)將農(nóng)產(chǎn)品中PtNPs釋放出來，結(jié)合SP-ICP-MS技術(shù)，建立了農(nóng)產(chǎn)品中PtNPs定量分析方法，為研究農(nóng)產(chǎn)品中PtNPs的納米風(fēng)險評估提供可靠的分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)試劑：尺寸為30 nm和50 nm的PtNPs懸浮液(以濃度為2 mol/L的檸檬酸溶液為介質(zhì)，由美國NanoComposix公司提供)，通過TEM及DLS表征證明了PtNPs懸浮液的多分散性，PtNPs通過TEM方法檢測到的尺寸分別為：(30.6±3.1) nm和(46±5) nm，PtNPs的質(zhì)量濃度均為0.05 mg/mL，其納米顆粒數(shù)量濃度分別為1.8×1011個/mL(30 nm PtNPs)和4.7×1010個/mL(50 nm PtNPs)；Pt(Ⅳ)標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度為1 000 mg/L)，Pt(Ⅳ)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制濃度分別為0、0.1、0.2、0.5、2 μg/L(1%HNO3介質(zhì)，使用時現(xiàn)配現(xiàn)用)；60 nm AuNPs(0.05 mg/mL，2 mmol/L檸檬酸介質(zhì)，美國NanoComposix公司)用于測定單顆粒模式下該方法傳輸效率；為了獲得高靈敏度和低雙電荷數(shù)(<2%)，1 μg/L ICP-MS調(diào)諧液(Be、Ce、Fe、In、Li、Mg、Pb、U，PE公司，1% HNO3介質(zhì))用于調(diào)諧儀器的最佳狀態(tài)。

1.2 儀器

NexION 300 X ICP-MS(PerkinElmer公司，美國)，同心霧化器(PerkinElmer，美國)，液氬(純度>99.99%)，高純水(Ultrapure water，UP水，成都優(yōu)普，電阻率>18.2 MΩ·cm)；NexION 300 X ICP-MS儀器操作見表1。

數(shù)據(jù)采集及處理軟件：SyngistixTMNano Application Software Module (PerkinElmer公司，美國)。

表1 SP-ICP-MS儀器參數(shù)

1.3 樣品制備及測定

1)農(nóng)產(chǎn)品中PtNPs的提取

準(zhǔn)確稱量0.025 0 g農(nóng)產(chǎn)品于15 mL離心管中，移取 8 mL檸檬酸緩沖液(5 mmol/L，pH=4.5)，搖勻，冰水浴中超聲5 min，加入0.01 g Macerozyme R-10酶，然后再加入2 mL的超純水，在37 ℃下恒溫振蕩24 h。水浴好的樣品取出靜置，用移液槍取20 μL上清液注入15 mL離心管中并加入超純水定容至15 mL，搖勻，將樣品稀釋至一定倍數(shù)后，上ICP-MS測定(SP-ICP-MS模式)。

2)樣品制備及測定

為避免兩個或多個納米顆粒進(jìn)入等離子體，納米顆粒信號個數(shù)小于總信號個數(shù)的10%。為減少樣品受進(jìn)樣系統(tǒng)影響，測量的每個樣品之間采用1%HNO3溶液沖洗，以保證進(jìn)樣系統(tǒng)中無樣品殘留。在測樣過程中，每測完10個樣品，以100 ng/L 50 nm PtNPs標(biāo)準(zhǔn)品溶液來監(jiān)控儀器信號是否有明顯漂移。

2 結(jié)果與討論

2.1 SP-ICP-MS表征PtNPs標(biāo)準(zhǔn)溶液

依據(jù)SP-ICP-MS測定MNPs顆粒原理[9]，采用SP-ICP-MS技術(shù)測定了30 nm和50 nm PtNPs稀溶液中Pt顆粒平均粒徑及顆粒濃度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。SP-ICP-MS測定PtNPs(30 nm和50 nm)平均粒徑結(jié)果與TEM 值(生產(chǎn)廠商提供)接近，顆粒濃度回收率較高，這說明SP-ICP-MS法能夠定量測定稀溶液中PtNPs，這為農(nóng)產(chǎn)品中PtNPs定量分析提供可靠的分析手段。

2.2 Macerozyme R-10酶對納米鉑顆粒的影響

Macerozyme R-10是一種多組分酶[含纖維素酶(0.1單位/mg)、半纖維素酶(0.25單位/mg)和果膠酶(0.5單位/mg)]，是植物組織中重要組成部分。目前以Macerozyme R-10為主的酶消解技術(shù)能夠在保證MNPs的自有性質(zhì)(如粒徑、形貌等)在萃取過程中不發(fā)生變化的前提下將復(fù)雜組織基體中MNPs進(jìn)行釋放[13]。

表2 SP-ICP-MS法測定納米鉑標(biāo)準(zhǔn)溶液粒度分布

因此，在本研究中，為考察R-10酶對PtNPs是否存在聚集/溶解現(xiàn)象，選取納米顆粒濃度8.51×104particle/mL 50 nm PtNPs為分析對象，考察R-10酶添加前后PtNPs溶液的粒徑分布及納米顆粒數(shù)濃度的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(見圖1)，由50 nm PtNPs的粒徑分布圖可知，酶處理前后PtNPs無明顯團(tuán)聚/溶解。R-10酶處理的PtNPs的顆粒濃度為7.60×104particle/mL，與未經(jīng)酶處理的PtNPs的顆粒數(shù)濃度(8.51×104particle/mL)相近，其回收率為89.30%。這說明當(dāng)R-10酶與PtNPs相互作用時不會引起PtNPs的團(tuán)聚或溶解，R-10酶用于植物組織中提取PtNPs是可行的。

圖1 50 nm PtNPs溶液(a)及酶處理后50 nm PtNPs溶液(b)的粒徑分布圖Figure 1 The particle size distribution for PtNPs stock suspension (a) and enzyme-treated PtNPs solution (b).

2.3 R-10酶對農(nóng)產(chǎn)品中PtNPs提取條件的優(yōu)化

據(jù)報道，酶消解技術(shù)能夠在溫和的pH值下將復(fù)雜基體中MNPs進(jìn)行分離，通過優(yōu)化不同植物介質(zhì)中MNPs的提取條件，研究人員采用酶消解法(Macerozyme R-10)已成功提取了植物樣品中AgNPs、AuNPs和TiO2NPs等，并運(yùn)用SP-ICP-MS技術(shù)對一些植物中MNPs進(jìn)行定量分析。

因此，本實(shí)驗(yàn)以生菜作為一種典型的農(nóng)產(chǎn)品，考察了影響酶提取農(nóng)產(chǎn)品中PtNPs的主要因素，包括酶用量、提取液濃度、水浴時間等，以獲得較高濃度的鉑納米顆粒，同時保證在提取過程中不引起PtNPs顆粒形貌和粒徑發(fā)生變化。

2.3.1 R-10酶用量

在酶消解實(shí)驗(yàn)中，酶用量是影響提取農(nóng)產(chǎn)品中MNPs回收率的重要因素。據(jù)報道，10 mg R-10酶可有效地將25 mg農(nóng)產(chǎn)品中AgNPs、AuNPs和TiO2NPs提取出來。因此，分別稱取5、10、20 mg R-10酶加入到農(nóng)產(chǎn)品中，加入10 μL 50 nm PtNPs(濃度為50 ng/L)至農(nóng)產(chǎn)品，再進(jìn)行酶提取實(shí)驗(yàn)步驟。通過考察提取后PtNPs平均粒徑、頻數(shù)、顆粒數(shù)濃度和回收率等結(jié)果，考察不同量R-10酶對農(nóng)產(chǎn)品中PtNPs提取的影響。表3為不同量R-10酶提取農(nóng)產(chǎn)品中PtNPs結(jié)果。雖然20 mg R-10酶可獲得最好的PtNPs回收率90.8%±3.2%，但添加10 mg R-10酶的PtNPs顆粒也可獲得良好的PtNPs回收率89.4%±2.3%，接近90%。因此，本實(shí)驗(yàn)以R-10酶添加量10 mg作為樣品前處理的條件。

表3 不同量R-10提取農(nóng)產(chǎn)品中PtNPs影響

2.3.2 緩沖液濃度

溫和的pH值是保證R-10酶在植物中MNPs提取的前提條件。因此，本實(shí)驗(yàn)分別采用了檸檬酸、醋酸銨和MES緩沖液考察R-10酶對植物中PtNPs影響。研究表明(數(shù)據(jù)未顯示)檸檬酸鹽體系除了能有效地保證PtNPs從植物中釋放，還能夠保證其形貌和自有屬性基本不發(fā)生變化。因此，將檸檬酸體系作為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)體系?？疾鞕幟仕?0.5～5 mmol/L)對農(nóng)產(chǎn)品中PtNPs提取的影響，如圖2所示，隨著檸檬酸濃度的增加，農(nóng)產(chǎn)品中PtNPs提取效率逐漸提高，當(dāng)檸檬酸緩沖溶液濃度為5 mmol/L時，PtNPs的提取效率最好，可達(dá)92.5%±0.8%。因此，檸檬酸濃度參數(shù)選擇為5 mmol/L。

圖2 不同檸檬酸濃度對農(nóng)產(chǎn)品 PtNPs的提取影響(n=3)Figure 2 Effect of citrate buffer concentration for the extraction of PtNPs from agricultural products (n=3).

2.3.3 水浴平衡時間

在樣品納米顆粒的提取過程中，酶處理溫度和平衡時間可能會影響目標(biāo)物質(zhì)中納米顆粒的提取效率。通過參考制造商提供的信息，R-10酶最佳的提取溫度為37 ℃。因此，實(shí)驗(yàn)直接選擇37 ℃為植物中PtNPs的最佳提取溫度。另一方面，通過改變水浴時間(5～36 h)，討論水浴時間對PtNPs的提取影響。由圖3可知，當(dāng)水浴時間為5～10 h時，PtNPs提取率較低，約為20%。隨著時間增加，PtNPs提取效率逐漸增加，當(dāng)水浴時間為36 h時，PtNPs提取效率為92.5%±0.8%。因此，選擇36 h為PtNPs提取的最佳水浴平衡時間。

2.3.4 提取參數(shù)對農(nóng)產(chǎn)品中PtNPs提取的粒徑影響

農(nóng)產(chǎn)品中PtNPs的定量分析除需考慮MNPs能否有效地從農(nóng)產(chǎn)品中釋放出，還需考慮MNPs在提取過程中尺寸粒徑是否發(fā)生變化。分別考察檸檬酸緩沖液濃度(0.5～5 mmol/L)與水浴時間(4～36 h)對農(nóng)產(chǎn)品中PtNPs平均粒徑的影響。由圖4可知，低濃度檸檬酸濃度更容易引起PtNPs團(tuán)聚，當(dāng)檸檬酸濃度為5 mmol/L、水浴時間為36 h時，PtNPs平均粒徑與標(biāo)準(zhǔn)的PtNPs(Control PtNPs)樣品更接近。圖5為優(yōu)化條件后農(nóng)產(chǎn)品PtNPs粒徑分布圖。由圖5可以看出，經(jīng)過R-10酶釋放出PtNPs粒徑分布并未發(fā)生明顯的團(tuán)聚/分解現(xiàn)象。結(jié)合之前的PtNPs提取效率研究結(jié)果，最終選定R-10酶濃度為10 mg、檸檬酸濃度5 mmol/L、提取時間36 h為最優(yōu)的農(nóng)產(chǎn)品中PtNPs參數(shù)。

圖3 水浴平衡時間對農(nóng)產(chǎn)品PtNPs的提取影響(n=3)Figure 3 Effect of equilibrium time for the extraction of PtNPs from agricultural products (n=3).

圖4 不同水浴時間與檸檬酸濃度處理后的 鉑納米平均粒徑(n=3)Figure 4 Average particle size of platinum nanoparticles treated with different concentration of citric acid and water bath time (n=3).

圖5 PtNPs粒徑分布圖 (a)參數(shù)優(yōu)化后農(nóng)產(chǎn)品中提取PtNPs (b)50 nm PtNPs標(biāo)準(zhǔn)溶液Figure 5 Size distribution of PtNPs (a) PtNPs extracted from agricultural products with optimized parameters (b) 50 nm PtNPs standard solution.

2.4 鉑納米顆粒粒度和濃度檢出限

粒度分布檢出限(LODsize)和顆粒濃度檢出限(LODd)是SP-ICP-MS模式下考察農(nóng)產(chǎn)品中PtNPs兩個重要參數(shù)。農(nóng)產(chǎn)品中PtNPs粒度分布檢出限(LODsize)可認(rèn)為是Pt納米顆粒信號與背景信號及Pt離子態(tài)信號區(qū)分可通過Pt平均背景信號值與5倍標(biāo)準(zhǔn)偏差之和的迭代運(yùn)算獲得。采用本方法，農(nóng)產(chǎn)品中PtNPs的LODsize為20 nm。而農(nóng)產(chǎn)品中PtNPs的LODNP則與三個納米粒子計數(shù)的能力相關(guān)，可表示為：

因此，SP-ICP-MS法測定農(nóng)產(chǎn)品中PtNPs顆粒濃度檢出限為5×105particle/L。一般情況下為獲取準(zhǔn)確的PtNPs顆粒濃度，測定時建議將樣品測定濃度高于檢出限的5～10倍。

2.5 酶消解-SP-ICP-MS測定農(nóng)產(chǎn)品中PtNPs

將得到最優(yōu)條件的酶消解實(shí)驗(yàn)用于生菜、水稻和白菜三種農(nóng)產(chǎn)品中PtNPs的提取并進(jìn)行SP-ICP-MS分析，表4中記錄了各項(xiàng)測定指標(biāo)結(jié)果。50 nm PtNPs標(biāo)準(zhǔn)溶液的顆粒直徑為(46±5) nm，而實(shí)測樣品PtNPs顆粒尺寸為(43±7) nm。水稻、生菜和白菜加標(biāo)后PtNPs顆粒數(shù)濃度回收率分別為(87±6)%、(81±3)%和(91±4)%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.3%、4.0%和7.0%。水稻、生菜和白菜加標(biāo)后PtNPs顆粒平均粒徑分別為(41±3)、(44±5)和(47±2) nm，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.5%、7.4%和10.5%。以上結(jié)果表明經(jīng)過條件優(yōu)化后的酶消解實(shí)驗(yàn)對農(nóng)產(chǎn)品中PtNPs的提取可獲得較高的顆粒數(shù)濃度回收率以及尺寸穩(wěn)定的納米顆粒。

表4 實(shí)際樣品中PtNPs測定及樣品回收率

3 結(jié)論

開發(fā)可靠的高靈敏度定量分析農(nóng)產(chǎn)品中金屬納米顆粒測定方法用于食品納米環(huán)境風(fēng)險評估是至關(guān)重要的。本研究采用酶消解技術(shù)將農(nóng)產(chǎn)品中PtNPs釋放出，結(jié)合SP-ICP-MS表征技術(shù)，準(zhǔn)確測定農(nóng)產(chǎn)品中PtNPs粒度分布和納米顆粒濃度。農(nóng)產(chǎn)品中PtNPs粒度檢出限25 nm，顆粒濃度檢出限為5×105particles/L。采用酶消解-SP-ICP-MS技術(shù)研究了實(shí)際農(nóng)產(chǎn)品中PtNPs，PtNPs顆粒濃度回收率在(81±3)%～(91±4)%，加標(biāo)后平均粒徑(41±3) ～(47±2) nm，與50 nm PtNPs標(biāo)準(zhǔn)溶液粒徑接近。這說明建立的酶消解-SP-ICP-MS法能夠有效地定量分析農(nóng)產(chǎn)品中PtNPs，可為后續(xù)農(nóng)產(chǎn)品中PtNPs風(fēng)險評估提供可靠的分析技術(shù)。