蘇 睿 苑 鋒 吳俊鋒 位文濤 VIJAYA Raghavan 胡建東，3*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)機(jī)電工程學(xué)院，河南省農(nóng)業(yè)激光技術(shù)國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002；2.McGill大學(xué)生物資源工程系，加拿大 蒙特利爾 H9X 3V9；3.小麥玉米作物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002)

硝態(tài)氮是土壤中重要的無機(jī)氮肥，可直接被作物吸收利用，土壤中硝態(tài)氮的含量是作物當(dāng)季氮肥施用量估算和生育期追肥診斷的主要依據(jù)，增施氮肥是農(nóng)業(yè)增產(chǎn)的重要措施之一，其含量的檢測(cè)是田間養(yǎng)分管理的重要指標(biāo)[1-3]。由于硝酸根離子的高水溶性、流動(dòng)性和生物降解性使它極易受環(huán)境溫度和農(nóng)田灌溉及降水的影響而發(fā)生變化[4-5]。農(nóng)用肥料和動(dòng)物糞便中存在大量硝態(tài)氮，隨著農(nóng)田灌溉及降水等原因，過剩的硝態(tài)氮會(huì)經(jīng)過淋溶和地表徑流流入河湖和地下水導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化[6-8]。同時(shí)，高濃度的營養(yǎng)物質(zhì)已被確定為結(jié)直腸癌和非霍奇金淋巴瘤的潛在原因[9]。因此，土壤硝態(tài)氮的實(shí)時(shí)測(cè)定是精準(zhǔn)施肥、作物養(yǎng)分管理和污染監(jiān)控的重要環(huán)節(jié)[10-11]。

為實(shí)現(xiàn)土壤硝態(tài)氮原位實(shí)時(shí)測(cè)定，已嘗試了電化學(xué)法、光譜法，目前實(shí)驗(yàn)室普遍使用光譜方法，與光譜方法相比電化學(xué)傳感器測(cè)量方法具有快速、靈敏、測(cè)量范圍廣、成本低等優(yōu)點(diǎn)[12-14]。ADAMCHUK等人開發(fā)了利用離子選擇電極(ISE)直接土壤測(cè)試系統(tǒng)(DSM)，用于土壤養(yǎng)分分析和空間變異特征監(jiān)測(cè)，與實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)相比硝酸根檢測(cè)結(jié)果相關(guān)系數(shù)(R2)僅在0.41～0.51[15]。KIM等[16]使用NPK三種離子選擇電極與一個(gè)參比電極組成傳感器陣列測(cè)定土壤提取物中的硝態(tài)氮濃度與常規(guī)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定方法相關(guān)系數(shù)(R2)為0.89。研究人員開發(fā)了一種基于離子選擇電極測(cè)定土壤養(yǎng)分測(cè)繪系統(tǒng)，該系統(tǒng)通常安裝在重型農(nóng)用車上，用于繪制穿越農(nóng)場(chǎng)地形時(shí)的土壤狀況[17]。TULLY等[18]使用ISE測(cè)量的土壤溶液硝態(tài)氮濃度與比色法進(jìn)行了比較相關(guān)系數(shù)(R2)為0.96。

為了實(shí)現(xiàn)基層科學(xué)施肥、促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展、保證農(nóng)民便捷操作，本論文結(jié)合電化學(xué)與流動(dòng)分析法設(shè)計(jì)了一個(gè)全自動(dòng)、低成本、便捷、易操作的實(shí)時(shí)土壤硝態(tài)氮測(cè)定系統(tǒng)。優(yōu)選了全固態(tài)硝酸根離子選擇電極，且與溫度電極和pH電極融合組成電極陣列，并通過微處理控制蠕動(dòng)泵完成土壤硝態(tài)氮待測(cè)溶液的連續(xù)流動(dòng)測(cè)量及測(cè)試結(jié)果的傳輸。采用微處理器對(duì)電化學(xué)傳感器信號(hào)采集、處理、存儲(chǔ)、傳輸和控制蠕動(dòng)泵流動(dòng)傳輸樣品并與上位機(jī)相互傳輸。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

硝酸根全固態(tài)離子選擇電極(ISE)、pH電極、溫度傳感器(EAInstruments Limited公司)，紫外可見分光光度計(jì)(南京菲勒儀器有限公司)。

硝酸鈉和氯化鉀購自國藥化學(xué)試劑(上海)有限公司，用于配制一系列硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液和土壤浸提液。所有試劑均為分析純(AR)等級(jí)，溶液均使用去離子水配制。

1.2 實(shí)際樣品的處理

采集許昌市(113°47′08″E，34°09′35″N)和潛江市(112°39′07″E，30°18′23″N)麥田土壤。采用五點(diǎn)取樣法采集土壤樣品，取樣位置為0～20 cm表層土。

1.3 電化學(xué)土壤硝態(tài)氮測(cè)試原理

固態(tài)離子選擇電極具有體積小、響應(yīng)快等特點(diǎn)，便于在田間實(shí)時(shí)測(cè)定土壤硝態(tài)氮。離子選擇電極是一種利用膜電位測(cè)定溶液中離子活度或濃度的電化學(xué)傳感器，當(dāng)將電極浸入待測(cè)溶液時(shí)，溶液中的游離待測(cè)離子將會(huì)擴(kuò)散于電極膜外側(cè)直至內(nèi)外濃度達(dá)到平衡，這樣在膜內(nèi)側(cè)就形成一個(gè)電層，稱為膜界電位差，它與外部溶液中的待測(cè)離子數(shù)量成比例。離子濃度(活度)與電極電位之間的關(guān)系用Nernst方程表示

(1)

式中，E為電極檢測(cè)電勢(shì)，mV；E0為電極標(biāo)準(zhǔn)電勢(shì)，mV；R為氣體常數(shù)，取8.314 J/(mol·K)；T為絕對(duì)溫度，K；F為法拉第常數(shù)，取96487 C/mol；z為待測(cè)離子所帶電荷數(shù)；α為待測(cè)離子活度。

1.4 土壤硝態(tài)氮實(shí)時(shí)測(cè)定系統(tǒng)設(shè)計(jì)方案

圖1 離子選擇電極陣列硝態(tài)氮快速測(cè)定系統(tǒng)組成 (a)放大電路和阻抗匹配電路；(b)電路設(shè)計(jì)流程圖； (c)土壤硝態(tài)氮實(shí)時(shí)測(cè)定系統(tǒng)：①組合電極陣列；②過濾器；③攪拌器；④土壤含水率傳感器；⑤步進(jìn)電機(jī)； ⑥蠕動(dòng)泵；⑦樣品池；⑧電子秤；⑨液晶觸摸屏和控制電路Figure 1 The system components of nitrate nitrogen measurement using ions selective electrode.(a) Amplification circuit and impedance matching circuit；(b) Diagram of the Electric Control Circuit Design；(c) Real-time determination system of soil nitrate nitrogen：①Combination electrode array；②Filter；③Stirrer；④Soil water content sensor； ⑤Stepper motor；⑥Peristaltic pump；⑦Sample cell；⑧Electronic scale；⑨LCD touch screen and control circuit

2 結(jié)果與分析

2.1 離子選擇電極系統(tǒng)的響應(yīng)時(shí)間

當(dāng)將電極浸入有硝酸根離子的待測(cè)溶液時(shí)，溶液中的游離硝酸根離子將會(huì)擴(kuò)散于電極固態(tài)PVC膜外側(cè)，直至內(nèi)外濃度達(dá)到平衡。這樣在膜內(nèi)側(cè)就形成一個(gè)電層，稱為膜界電位差，它與外部溶液中的硝酸根離子濃度的對(duì)數(shù)成比例。

根據(jù)國際純化學(xué)與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUPAC)的建議，達(dá)到平衡電位值將電勢(shì)變化達(dá)到總變化量的95%所需要的時(shí)間定義為響應(yīng)時(shí)間。隨著硝酸根離子濃度的提高，實(shí)時(shí)測(cè)定系統(tǒng)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品的響應(yīng)時(shí)間越快，如圖2所示，平衡電勢(shì)可在15 s內(nèi)完成響應(yīng)。

圖2 土壤硝態(tài)氮實(shí)時(shí)測(cè)定系統(tǒng)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品響應(yīng)時(shí)間Figure 2 Response time of soil nitrate nitrogen real-time measurement system to standard sample.

2.2 離子選擇電極系統(tǒng)的靈敏度

根據(jù)國際純化學(xué)與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUPAC)規(guī)定，由低至高濃度檢測(cè)一系列的硝態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定不同濃度(15 000、1 000、750、500、100、50、10、5、1、0.5、0.1、0.05 mg/kg)下硝態(tài)氮的響應(yīng)電壓。測(cè)定完成根據(jù)數(shù)據(jù)繪出硝酸根離子濃度對(duì)數(shù)與離子選擇電極(ISE)響應(yīng)電壓的線性關(guān)系圖。由圖3a可知，離子斜率為-51.63 mV/decade處于理論值(54±5) mV/decade合理范圍內(nèi)。線性范圍可確定為10-5～10-2.2mol/L，如圖3b所示。空白試劑重復(fù)11次測(cè)得的檢出限(LOD=3S/b。其中S為11次測(cè)定值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，b為接近LOD標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)為10-5.23mol/L。

2.3 離子選擇電極系統(tǒng)的準(zhǔn)確度和精密度

在自動(dòng)測(cè)定條件下，篩選21個(gè)土壤樣品進(jìn)行檢測(cè)，采用五點(diǎn)取樣法采集土壤樣品。首先添加標(biāo)準(zhǔn)樣品，計(jì)算加標(biāo)回收率來評(píng)價(jià)系統(tǒng)的準(zhǔn)確性，如表1 所示，加標(biāo)回收率在90.0%～110%。每個(gè)樣品測(cè)試7次，計(jì)算得各驗(yàn)證樣本的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)為0.78%～4.5%。結(jié)果表明，離子選擇電極系統(tǒng)具有的準(zhǔn)確度和精密度，可以滿足土壤硝態(tài)氮的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)需求。

圖3 土壤硝態(tài)氮實(shí)時(shí)測(cè)定系統(tǒng) (a)標(biāo)準(zhǔn)曲線；(b)檢測(cè)范圍Figure 3 Soil nitrate nitrogen real-time measurement system. (a)Standard curve；(b)Detection range

2.4 與紫外可見分光光度法測(cè)定結(jié)果比對(duì)

選擇21個(gè)土壤樣品分別使用離子選擇電極系統(tǒng)和紫外分光光度法測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如圖4a所示，兩者R2可達(dá)到0.995 2，兩個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定的結(jié)果具有較好的線性關(guān)系。將測(cè)得數(shù)據(jù)通過GraphPad Prism軟件進(jìn)行Bland-Altman一致性分析，Bland-Altman法作為新的圖形分析法，從集中趨勢(shì)、離散趨勢(shì)、同步變化程度多角度評(píng)價(jià)新舊檢驗(yàn)方法或檢驗(yàn)系統(tǒng)的一致性，彌補(bǔ)了t檢驗(yàn)、相關(guān)分析和回歸分析的不足。分析兩種檢測(cè)系統(tǒng)的相對(duì)偏移，兩種檢測(cè)系統(tǒng)的測(cè)定結(jié)果一致性較好，測(cè)定值均在95%一致性區(qū)間內(nèi)，見圖4b。綜上所述，相較于復(fù)雜的光學(xué)檢測(cè)儀器，該儀器成本低，操作便捷，適用于田間土壤硝態(tài)氮實(shí)時(shí)檢測(cè)。

表1 土壤硝態(tài)氮實(shí)時(shí)測(cè)定系統(tǒng)加標(biāo)回收率 和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

圖4 (a)土壤硝態(tài)氮實(shí)時(shí)測(cè)定系統(tǒng)與紫外分光光度計(jì) 測(cè)定結(jié)果的相關(guān)性；(b)Bland-Altman圖Figure 4 (a)Correlation between the results from ISE system and UV-Vis spectrophotometry；(b)Bland-Altman diagram.

3 結(jié)論

采用全固態(tài)硝酸根離子選擇電極，且與溫度電極和pH電極融合組成電極陣列，設(shè)計(jì)了一個(gè)土壤硝態(tài)氮實(shí)時(shí)測(cè)定系統(tǒng)，通過微處理控制蠕動(dòng)泵完成土壤硝態(tài)氮待測(cè)溶液的連續(xù)流動(dòng)測(cè)量及測(cè)試結(jié)果的傳輸。相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)樣品，系統(tǒng)響應(yīng)時(shí)間≤15 s，斜率為51.63 mV/decade。線性范圍在10-5～10-2.2mol/L內(nèi)，最低檢測(cè)限為10-5.23mol/L。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差在0.78%～4.5%，加標(biāo)回收率均在90.0%～110%。使用土壤硝態(tài)氮實(shí)時(shí)測(cè)定系統(tǒng)對(duì)許昌市和潛江市土壤樣品進(jìn)行測(cè)定，與國家標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定紫外分光光度法測(cè)定的結(jié)果相關(guān)性R2可達(dá)到0.995 2，通過Bland-Altman一致性分析，測(cè)值均在95%一致性區(qū)間內(nèi)，兩種方法測(cè)值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有較好的一致性。該系統(tǒng)在響應(yīng)時(shí)間、靈敏度、準(zhǔn)確度和精確度多方面能滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)要求。