張輝 邸紅芹 吳海峰 孫紅梅 孟自立 劉戰(zhàn)地

流行性感冒病毒(influenza virus，IFV)是正黏病毒科(Orthomyxoviridae)的代表種，簡稱流感病毒，為分節(jié)段(8個(gè)節(jié)段)的負(fù)鏈RNA病毒，基于流感病毒核殼蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白(M)抗原決定簇的差異，分為三種不同型：A型、B型和C型，是引起流行性感冒的病原體。流感病毒會(huì)造成急性上呼吸道感染，并借由空氣迅速的傳播，在世界各地常有周期性的流行，特別是對(duì)老人和兒童等人群的生命健康造成了重大威脅[1,2]。其中A型流感病毒(influenza virus A，IFA)和B型流感病毒(influenza virus B，IFB)是引起人感染的主要病毒，甲型流感病毒易發(fā)生變異，流感大流行就是就是甲型流感病毒出現(xiàn)新亞型或舊亞型重現(xiàn)引起的[3,4]；乙型流感病毒根據(jù)抗原特異性和血凝素(HA1)基因的核苷酸序列，可以分為Yamagata和Victoria兩大譜系[5]，其感染特點(diǎn)是起病急驟、畏寒發(fā)熱，體溫在數(shù)小時(shí)至24 h內(nèi)升達(dá)高峰，39～40℃甚至更高，伴頭疼，全身酸疼，呼吸道癥狀較輕，咽干喉痛。流感病毒是國際上第一個(gè)全球監(jiān)測(cè)的傳染病毒[6]，國家流感中心每周都會(huì)報(bào)告新發(fā)病例及感染病毒類型，但至今尚未完全控制。流感病毒快速、精確及敏感的診斷，可為臨床醫(yī)師早期有效地抗病毒治療提供依據(jù)，同時(shí)高危人群可盡早的采取防護(hù)措施，減少病毒在人群中流行。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，如雞胚組織培養(yǎng)接種以及血清學(xué)診斷，由于其操作過程繁瑣、靈敏度低以及檢測(cè)時(shí)間較長，無法滿足快速診斷的要求，并且病毒抗原的變異頻率很高、傳播快速為流感病毒的精準(zhǔn)診斷和有效防控帶來極大的困難。病毒簡便、精確及敏感的診斷手段就表現(xiàn)得極其重要。近年來，隨著分子生物學(xué)檢測(cè)方法的介入，給臨床流感病毒診斷和治療提供很大的幫助，尤其是多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(MRT-PCR)以其高通量、高靈敏性、高特異性及操作快速簡便等優(yōu)勢(shì)，在流感病毒診斷中有巨大的應(yīng)用空間[7,8]。多重PCR體系中存在多對(duì)引物和探針，在反應(yīng)過程中容易造成引物探針交叉干擾，導(dǎo)致擴(kuò)增效率降低，因此，本文基于同源加尾系統(tǒng)(Homo-Taq Assidted Non-Dimer，HAND)建立改良的Taqmam-分子燈標(biāo)(Taqman-MB)多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)IFA和IFB，以甲/乙型流感病毒核酸檢測(cè)試劑盒(中山達(dá)安基因)為參照，評(píng)估已構(gòu)建的改良多重?zé)晒舛縋CR體系在臨床檢測(cè)中的效能[9]。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年11月至2019年2月于河北省胸科醫(yī)院就診患者261例，其中男161例，女100例；年齡7～89歲，平均(53.22±5.51)歲，為此次研究對(duì)象，患者均采集咽拭子標(biāo)本，置于3 ml病毒保存管中，4℃冰箱保存，24 h內(nèi)檢測(cè)。所有入選患者符合體溫>37.5℃，并伴有以下癥狀之一：頭痛、關(guān)節(jié)疼痛、肌肉痛、咳嗽、喉嚨痛及流涕乏力等流感樣全身癥狀，此次研究獲得了倫理委員會(huì)的同意與支持。

1.2 儀器與試劑 本次研究中所用的儀器試劑：Ⅱ級(jí)生物安全柜(新加坡esco公司，設(shè)備型號(hào)LB2-4B1)；低溫高速離心機(jī)(德國艾本德公司，設(shè)備型號(hào)5424R)；全自動(dòng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國伯樂公司，設(shè)備型號(hào)CFX96 Deep Well)；全自動(dòng)核酸提取儀(德國凱杰公司，設(shè)備型號(hào)QIAcube connect)；醫(yī)用冷藏冷凍冰箱(日本松下公司，設(shè)備型號(hào)MPR-440F)；微量移液器(德國艾本德公司)；核酸提取試劑盒(德國凱杰公司，試劑盒型號(hào)RNeasy Mini Kit)；甲型/乙型流感病毒核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針法，購自中山達(dá)安基因有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 核酸提取:根據(jù)RNA提取試劑盒說明書(凱杰)，提取病毒總核酸，步驟如下：吸取200 μl樣本置于核酸提取管內(nèi)并加入4 μl甲型流感毒/乙型流感病毒內(nèi)標(biāo)溶液，放置與核酸提取儀樣本盤內(nèi)，設(shè)定好提取程序，進(jìn)行核酸提取。所提取的核酸應(yīng)立即檢測(cè)，若24 h內(nèi)能檢測(cè)可置于-20℃冰箱保存，若長期保存需置于-70℃冰箱。

1.3.2 核酸檢測(cè):改良多重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)體系為25 μl，依次為：預(yù)混的PCR反應(yīng)buffer 17 μl、酶混合液3 μl以及提取的核酸5 μl。PCR反應(yīng)程序?yàn)?0℃，15 min(逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng))；95℃，10 min(熱啟動(dòng))；95℃，15 s(變性)，62℃，25 s(退火)，72℃ 20 s(延伸)，5個(gè)循環(huán)(富集)；95℃，15 s(變性)，62℃，30 s(退火，收集熒光)，72℃ 20 s(延伸)，45個(gè)循環(huán)(擴(kuò)增)，檢測(cè)通道為FAM和HEX。中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)的甲型和乙型流感病毒核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針法)根據(jù)說明書，簡要步驟如下：反應(yīng)體系為25 μl，其中包括甲流或乙流反應(yīng)預(yù)混液17 μl、酶混合液3 μl以及提取的核酸5 μl。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃，15 min(逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng))；95℃，10 min(熱啟動(dòng))；94℃，15 s(變性)，58℃，45 s(退火，收集熒光)，45個(gè)循環(huán)(擴(kuò)增)，檢測(cè)通道為FAM，HEX(內(nèi)標(biāo)檢測(cè)通道)。

1.3.3 結(jié)果判讀:PCR擴(kuò)增結(jié)束后，改良多重PCR結(jié)果使用熒光定量PCR儀自帶軟件進(jìn)行分析，所有陰性樣本的信號(hào)值都應(yīng)低于閾值；若擴(kuò)增Ct值>35，樣本低于檢測(cè)閾值線，結(jié)果判定為甲型或乙型流感病毒核酸陰性；若擴(kuò)增Ct值≤35，結(jié)果判定為甲型或乙型流感病毒核酸陽性。中山達(dá)安基因檢測(cè)試劑盒根據(jù)說明書進(jìn)行結(jié)果判讀，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)基線的開始和結(jié)束值(一般開始值設(shè)定為3～15，結(jié)束值可設(shè)5～20，調(diào)整陰性對(duì)照的擴(kuò)增曲線水平或低于閾值限)，分析結(jié)果。如果檢測(cè)反應(yīng)體系在FAM通道無擴(kuò)增或者有擴(kuò)增曲線且Ct值>39.7，HEX通道Ct值≤44.5，判定為甲型流感病毒陰性，樣本未檢測(cè)到甲型流感病毒核酸，濃度低于檢測(cè)靈敏度，反之檢測(cè)Ct值≤39.7，HEX通道有或無擴(kuò)增曲線，判定為甲型流感病毒陽性，樣本檢測(cè)到甲型流感病毒核酸；如果檢測(cè)反應(yīng)體系在FAM通道無擴(kuò)增或者有擴(kuò)增曲線且Ct值>38.0，HEX通道Ct值≤44.5，判定為乙型流感病毒陰性，樣本未檢測(cè)到乙型流感病毒核酸，濃度低于檢測(cè)靈敏度反之，檢測(cè)Ct值≤38.0判定為乙型流感病毒陽性，樣本到乙型流感病毒核酸。

2 結(jié)果

2.1 改良多重PCR檢測(cè)結(jié)果判讀 PCR擴(kuò)增結(jié)束后，改良多重PCR結(jié)果使用熒光定量PCR儀自帶軟件進(jìn)行分析，所有陰性樣本的信號(hào)值都應(yīng)低于閾值。見表1。

表1 改良多重PCR檢測(cè)結(jié)果判讀

2.2 流感核酸檢測(cè)結(jié)果 在261例發(fā)熱伴流感樣癥狀患者咽拭子標(biāo)本中，改良多重PCR法檢出流感核酸陽性163例，陽性率62.5%，其中甲型流感病毒陽性156例，陽性率 59.8%，乙型流感病毒陽性7例，陽性率2.7%。達(dá)安基因試劑盒檢出流感核酸陽性169例，陽性率64.8%，其中甲型流感病毒陽性161例，陽性率61.7%，乙型流感病毒陽性8例，陽性率3.1%。改良多重PCR法與達(dá)安基因試劑盒檢出甲型流感陽性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.20，P=0.65)，改良多重PCR法與達(dá)安基因試劑盒檢出乙型流感陽性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.07，P=0.80)。見表2。

表2 達(dá)安基因和改良多重PCR法檢測(cè)陽性結(jié)果比較 例(%)

2.3 改良多重?zé)晒舛縋CR性能分析 與達(dá)安基因檢測(cè)試劑盒相比，改良多重PCR檢測(cè)甲型流感和乙型流感敏感性分別為97.5%和87.5%，特異性均為100%，兩種檢測(cè)方法檢測(cè)甲型流感病毒(Kappa=0.97，P=0.02)和乙型流感病毒(Kappa=0.93，P=0.07)均具有很高的一致性。見表3。

表3 改良多重PCR法與達(dá)安基因試劑盒檢測(cè)結(jié)果比較 例

3 討論

流行性感冒是由流感病毒引起的常見呼吸系統(tǒng)疾病，其具有爆發(fā)突然、高傳染性及流行性廣等特點(diǎn)[10-12]。流感病毒的快速檢測(cè)，一方面在早期鑒別診斷中起重要作用，可輔助臨床醫(yī)生盡早的制定合適的治療方案，控制患者病情發(fā)展同時(shí)也避免陰性患者的過度治療，另一方面，可作為流感病毒爆發(fā)期高通量、快速篩查地手段，為臨床提供依據(jù)，及時(shí)鑒別流感病毒感染，采取措施阻斷流感病毒傳播，避免疫情擴(kuò)大。

常規(guī)的檢測(cè)血清學(xué)檢測(cè)和細(xì)胞培養(yǎng)無法早期快速檢出流感病毒，多種新的診斷手段被流感用于病毒的診斷，如實(shí)時(shí)熒光定量PCR[13]、恒溫?cái)U(kuò)增[14-16]以及芯片技術(shù)[17-19]等。史志坤[20]討論了實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀在流感病毒檢測(cè)中的效果，210例流感樣患者標(biāo)本檢測(cè)顯示熒光定量PCR法檢出率要顯著高于細(xì)胞培養(yǎng)法，可快速有效的檢出流感病毒核酸，成為高效簡便地診斷方式。熒光定量PCR由于其快速、靈敏、簡便及特異等優(yōu)勢(shì)，越來越多的研究表明，其可以作為一種檢測(cè)“金標(biāo)準(zhǔn)”用于流感病毒的鑒定，同時(shí)雙重、三重甚至多重?zé)晒釶CR檢測(cè)技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用，大大提高了病原體的檢測(cè)效率和檢測(cè)準(zhǔn)確度[21-24]。

為了提高流感病毒檢出率和特異性，多種改良優(yōu)化的檢測(cè)方法用于流感病毒的檢測(cè)領(lǐng)域，高蕾等[25]采用具有高擴(kuò)增效率的逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行PCR反應(yīng)體系優(yōu)化，進(jìn)行批間和批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)，顯示優(yōu)化的RT-PCR反應(yīng)試劑，縮短了PCR反應(yīng)時(shí)間，具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。常曉松等[26]基于熒光免疫層析法建立甲型流感病毒快速檢測(cè)技術(shù)，結(jié)果顯示熒光免疫層析試劑具有準(zhǔn)確度高、檢測(cè)范圍寬、重復(fù)性和熱穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，可用于流感病毒的快速篩查。本研究構(gòu)建的多重?zé)晒舛縋CR集合了多重PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR的優(yōu)點(diǎn)，可以在單一體系中快速、簡便地檢測(cè)多種靶序列，但是由于PCR反應(yīng)體系中存在多對(duì)引物和探針，在PCR反應(yīng)過程中會(huì)導(dǎo)致引物探針間的交叉干擾，如背景熒光值高和引物二聚體的形成，嚴(yán)重的干擾PCR擴(kuò)增。

本研究中我們采用了改良的Taqmam-MB探針(Taqman-分子燈標(biāo)探針)，探針保留了分子燈標(biāo)探針的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，使熒光和猝滅基團(tuán)盡可能的靠近，解決背景熒光高的問題，同時(shí)將探針臂也做為序列識(shí)別位點(diǎn)，使探針與靶序列結(jié)合更加緊密，提高雜交的效率[27]。

此外，我們引入了同源加尾系統(tǒng)(HAND)解決擴(kuò)增過程中引物二聚體的問題，其原理是：在PCR的初始階段由于引物較高的溶解溫度(Tm值)低濃度的加尾引物特異的與靶序列結(jié)合，擴(kuò)增并富集兩頭帶有Tag的PCR產(chǎn)物，若此時(shí)有引物二聚體形成，加尾引物兩頭的互補(bǔ)序列會(huì)構(gòu)成一個(gè)穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，致使其不能進(jìn)行擴(kuò)增，從而極大地減少了引物二聚體對(duì)熒光定量PCR的干擾[28]。蘭全學(xué)等[29]基于同源加尾體系建立快速診斷食品中沙門菌、志賀菌、金黃色葡萄球菌和溶血性鏈球菌的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)體系，臨床樣本檢測(cè)顯示該方法特異且敏感性高，該方法與國家標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)樣品的檢測(cè)結(jié)果一致。

本次研究中改良多重PCR體系對(duì)流感病毒檢出的陽性例數(shù)要低于參比試劑盒，存在假陰性的結(jié)果，可能是多重PCR體系中引物、模板的競爭性抑制導(dǎo)致體系的檢測(cè)最低限高于參比試劑盒，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示2種方法檢測(cè)甲型流感病毒和乙型流感病毒陽性檢出率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.20，P=0.65和χ2=0.07，P=0.80)。結(jié)果表明雙重、三重甚至多重?zé)晒舛縋CR體系中的干擾因素要多于單重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)體系，多重?zé)晒舛縋CR需要綜合多重?cái)U(kuò)增體系，勢(shì)必會(huì)犧牲一些檢出靈敏度。對(duì)改良多重PCR體系進(jìn)行性能評(píng)估，其檢測(cè)甲型流感和乙型流感敏感性分別為97.5%和87.5%，特異性均為100%，一致性分析顯示兩種檢測(cè)方法檢測(cè)甲型流感病毒和乙型流感病毒均具有高度的一致性(Kappa=0.97，P=0.02和Kappa=0.93，P=0.07)。后續(xù)的研究還需要對(duì)構(gòu)建的體系進(jìn)行的優(yōu)化，同時(shí)應(yīng)擴(kuò)大樣本量，選擇三種及以上相關(guān)的商業(yè)化檢測(cè)試劑盒進(jìn)一步的評(píng)估多重?zé)晒舛縋CR體系。

綜上所述，構(gòu)建的多重?zé)晒舛縋CR體系與達(dá)安流感病毒檢測(cè)試劑盒相比有較高的一致性，可用于快速、高通量篩查流感病毒感染人群，為流感的有效防控提供高效、可靠及精確的技術(shù)方法。