廖 黎，魯 蘭，楊 晨，劉 昆，趙玉婷

(成都大學(xué) 四川抗菌素工業(yè)研究所/藥學(xué)院 抗生素研究與再評價四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610106)

0 引 言

肺癌是起源于支氣管黏膜、腺體或肺泡上皮的惡性腫瘤性疾病，據(jù)2018年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，肺癌是全球第一大癌癥，是癌癥發(fā)病和死亡主要原因之一[1].肺癌包括小細(xì)胞肺癌(SCLC)與非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，其中非小細(xì)胞肺癌占比約80%，具有不良預(yù)后及惡性轉(zhuǎn)移潛能.目前，肺癌治療主要依賴于放療、化療等，但這些治療存在毒副作用大、降低患者生活質(zhì)量等問題；另外，靶向治療、免疫治療作為新型療法，也存在藥物耐受性、治療周期長、費(fèi)用高等問題[2].中藥治療作為輔助療法，對肺癌患者機(jī)體作用溫和，毒副作用小，還可提高化療療效、降低不良反應(yīng)及毒性，提高機(jī)體免疫力，延長患者生存期[3].如四味金銀花湯聯(lián)合化療治療中心型NSCLC，與單純化療方案相比，治療有效率、生存率顯著提高，毒副反應(yīng)降低[4].因此中藥作為潛在的抗肺癌治療藥物，其物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制受到更多關(guān)注.

金銀花為忍冬科植物忍冬(lonicera japonica thunb)的干燥花蕾或帶初開的花，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱[5]，用于治療癰腫疔瘡、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒等疾病.現(xiàn)代藥理研究表明，金銀花具有抗菌、抗病毒、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用[6]；抗腫瘤方面，金銀花對肺癌、肝癌、前列腺癌等癌癥有較好的治療作用[7-8]，但治療癌癥物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機(jī)制尚不明確.本研究為進(jìn)一步了解金銀花治療肺癌作用機(jī)制，通過生物信息學(xué)技術(shù)，篩選與肺癌發(fā)生轉(zhuǎn)化等生物信息有關(guān)功能基因，并與正常肺組織比較獲得表達(dá)差異顯著基因(DEGs)[9]；另外，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，包括評估金銀花吸收、分布、代謝和排泄(ADME)特性，篩選其有效成分及治療肺癌相關(guān)靶點(diǎn)[10]，分析靶點(diǎn)富集功能及通路，再通過對肺癌預(yù)后價值分析得到金銀花治療肺癌關(guān)鍵靶點(diǎn)，并與對應(yīng)成分進(jìn)行分子對接，從而探究金銀花治療肺癌有效成分、靶點(diǎn)及作用機(jī)制.為金銀花在治療肺癌的開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)和新的契機(jī).

1 材料與方法

1.1 公共數(shù)據(jù)收集

美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫GEO(http://www.ncbi.nlm.gov/geo/)，是高通量基因表達(dá)、芯片和微陣列數(shù)據(jù)的功能基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫[11].從該數(shù)據(jù)庫中下載人源肺癌數(shù)據(jù)芯片GSE118370微陣列數(shù)據(jù)(芯片信息：Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array，GPL570平臺).該芯片以6例侵襲性肺腺癌組織及6例正常肺組織為研究對象.

1.2 差異表達(dá)基因的篩選處理

用GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)在線工具篩選肺腺癌組織和正常組織中的差異表達(dá)基因(DEGs)，篩選標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05，|log2FC|>1.GEO2R是一個交互式的網(wǎng)頁工具，它可以比較GEO系列中的兩個或多個數(shù)據(jù)集，以確定實(shí)驗(yàn)條件下的差異表達(dá)基因.利用Bioconductor注釋數(shù)據(jù)軟件包將微陣列數(shù)據(jù)探針名稱轉(zhuǎn)換為標(biāo)準(zhǔn)基因名稱[12].

1.3 金銀花有效成分和靶點(diǎn)的收集整理

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cdu.cn/tcmsp.php/)中輸入“金銀花”，以ADME系統(tǒng)評估模型，口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18篩選金銀花有效成分[13].用有效成分篩選金銀花潛在靶點(diǎn)，去除重復(fù)和無靶點(diǎn)成分.在通用蛋白數(shù)據(jù)庫(Uniprot，http://www.uniprot.org/)將得到的靶點(diǎn)轉(zhuǎn)化為基因名，設(shè)置種屬為人.金銀花有效成分-靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytosacpe3.7.1軟件中構(gòu)建金銀花有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，節(jié)點(diǎn)表示數(shù)據(jù)類型，之間連線表示其相互作用.用Network Analysis工具對該網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析，根據(jù)Degree值，篩選出金銀花的核心成分和靶點(diǎn).

1.4 獲得肺癌相關(guān)靶點(diǎn)

在Gene數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)中輸入“l(fā)ung cancer”，設(shè)置種屬為人，用Relevance score對基因從大到小排序(依據(jù)zscore值)，得到人類肺癌基因.

1.5 蛋白交互PPI網(wǎng)絡(luò)圖建立

通過Venn分析工具，將金銀花有效成分靶點(diǎn)、肺癌相關(guān)靶點(diǎn)與差異表達(dá)基因疊加，取交集，將上述交集靶點(diǎn)導(dǎo)入string數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org/)，設(shè)置種屬為人，去除無連接靶點(diǎn)，minimum required interaction score設(shè)置為0.4，預(yù)測蛋白相互作用.再將分析結(jié)果導(dǎo)入Cytosacpe3.7.1軟件構(gòu)建蛋白交互網(wǎng)絡(luò)圖(Protein-Protein Interaction，PPI).使用CytoHubba插件對其網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行關(guān)聯(lián)度分析[14]，根據(jù)節(jié)點(diǎn)度大小篩選關(guān)鍵靶點(diǎn).

1.6 基因本體與通路富集分析

在DAVID數(shù)據(jù)庫(http://david.ncifcrf.gov/)中，將上述篩選靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(Gene Ontology，GO)生物富集分析，以P<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，用生物學(xué)過程(Biological Process，BP)、細(xì)胞組分(Cell Component，CC)、分子功能(Molecular Function，MF)結(jié)果繪制GO注釋圖.在KOBAS數(shù)據(jù)庫(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/)對靶點(diǎn)進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路注釋分析，以P<0.05作為標(biāo)準(zhǔn)篩選.此外，通過Cytosacpe3.7.1軟件構(gòu)建通路-靶點(diǎn)-有效成分網(wǎng)絡(luò)圖.

1.7 肺癌相關(guān)表達(dá)基因的預(yù)后價值分析和基因表達(dá)譜交互分析

GEPIA(http://GEPIA.cancer-pku.cn)可用于分析腫瘤和健康樣本的 RNA 序列數(shù)據(jù)，提供差異表達(dá)分析、輪廓繪制、相關(guān)性分析、患者生存分析、相似基因檢測和降維分析[15].分析篩選靶點(diǎn)對肺癌患者的總生存期(Overall Survival，OS)，根據(jù)肺癌患者這些靶點(diǎn)表達(dá)情況及中位值分為高表達(dá)和低表達(dá)2組，并計算危險比(HR)及其95%置信區(qū)間和對應(yīng)的P值，繪制生存曲線.通過Student’s t檢驗(yàn)分析肺癌組織與正常肺組織基因的表達(dá).篩選在肺癌生存率中差異較大的基因進(jìn)行基因表達(dá)譜分析，采用F檢驗(yàn)分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

1.8 免疫組織化學(xué)分析

免疫組織化學(xué)是組織細(xì)胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織呈色反應(yīng)，借助標(biāo)志物對相應(yīng)抗原或抗體進(jìn)行定位、定性以及定量檢測.利用Human Protein Atlas(HPA)數(shù)據(jù)庫(http://www.proteinatlas.org)分析交集靶點(diǎn)在正常及肺癌組織中蛋白質(zhì)表達(dá)情況.根據(jù)蛋白質(zhì)在組織中染色強(qiáng)度及染色細(xì)胞百分比，比較正常組織與腫瘤組織中蛋白質(zhì)表達(dá)差異.

1.9 分子對接

篩選肺癌生存率中差異較大靶點(diǎn)，在PDB數(shù)據(jù)(https://www.rcsb.org/)中輸入，設(shè)置種屬人，選擇X-射線晶體結(jié)構(gòu)，下載相關(guān)蛋白3D結(jié)構(gòu)，通過PyMOL軟件去除蛋白中的配體和水分子，AutodockTools軟件對蛋白進(jìn)行加氫、加電荷.根據(jù)靶點(diǎn)對應(yīng)的金銀花核心成分，在PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載化合物3D結(jié)構(gòu)，用AutodockTools對化合物進(jìn)行移除非極性氫.根據(jù)蛋白質(zhì)自帶的配體設(shè)置Grid Box坐標(biāo)，用Autodock Vina進(jìn)行分子對接，取化合物與蛋白結(jié)合能最小構(gòu)象繪圖，分析驗(yàn)證金銀花關(guān)鍵活性成分與靶點(diǎn)相互作用[16].

2 結(jié) 果

2.1 肺癌組織中基因表達(dá)差異分析

將GSE118370芯片中的6例正常肺組織設(shè)為normal組，6例侵襲性肺腺癌組織設(shè)為tumor組，用GEO2R分析，篩選出 3 687 個差異表達(dá)基因，其中 1 464 個為上調(diào)基因，2 223 個為下調(diào)基因，見圖1.紅色代表上調(diào)基因，綠色代表下調(diào)基因，灰色代表無顯著差異基因.

圖1 GSE118370基因表達(dá)及分布火山圖 圖2 金銀花、肺癌及GSE118370交集靶點(diǎn)篩選

2.2 金銀花有效成分和靶點(diǎn)篩選結(jié)果

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中，篩選得到金銀花有效成分23個.這23個成分中，有6個成分沒有對應(yīng)靶點(diǎn)，去除重復(fù)靶點(diǎn)，將得到靶點(diǎn)在Uniprot數(shù)據(jù)庫中轉(zhuǎn)化為基因名，得到170個靶點(diǎn)基因.

2.3 肺癌靶點(diǎn)基因篩選結(jié)果及蛋白交互PPI網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

在Gene數(shù)據(jù)庫中篩選出 23 107 個基因組與人類肺癌相關(guān).用Venn將其與金銀花成分靶點(diǎn)及GEO中肺癌差異表達(dá)基因進(jìn)行交集，得到51個金銀花-肺癌靶點(diǎn)，見圖2.通過String數(shù)據(jù)庫預(yù)測這些靶點(diǎn)相互作用，根據(jù)degree排名，節(jié)點(diǎn)degree值越大，其在網(wǎng)絡(luò)圖中越重要，選出degree排名前20核心靶點(diǎn)，見表1.將51個交集靶點(diǎn)及degree排名前20靶點(diǎn)用Cytosacpe3.7.1軟件構(gòu)建蛋白交互網(wǎng)絡(luò)圖(PPI)，見圖3和圖4.根據(jù)每個靶點(diǎn)degree值大小確定每個靶點(diǎn)大小.由圖4得到20個靶點(diǎn)交互關(guān)系圖，邊線數(shù)102條，聚類系數(shù)為0.794，平均節(jié)點(diǎn)degree值為12.1.這些靶點(diǎn)連通性好，是金銀花發(fā)揮治療肺癌作用的核心靶點(diǎn).

表1 20個核心靶點(diǎn)信息

圖3 51個交集靶點(diǎn)PPI圖 圖4 degree排列前20關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI圖

2.4 GO生物富集和KEGG通路分析結(jié)果

在DAVID數(shù)據(jù)庫中，對金銀花治療肺癌20個核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO生物富集分析，并用P<0.05篩選，最后得到96個GO條目，按照P值由小到大排列，篩選生物學(xué)過程(BP)、細(xì)胞組分(CC)、分子功能(MF)前20個條目，見圖5.分析結(jié)果顯示BP類別中，靶點(diǎn)在RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的調(diào)控、DNA模板化、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、藥物的反應(yīng)、基因表達(dá)的調(diào)控、白細(xì)胞遷移、NF-kB轉(zhuǎn)錄因子活性的正調(diào)控、ERK1和ERK2級聯(lián)的正調(diào)節(jié)、MAPK級聯(lián)的正調(diào)節(jié)、凋亡過程的調(diào)控等.在CC類別中，靶點(diǎn)主要富集于細(xì)胞外間隙、胞外體、質(zhì)膜外側(cè)、核染色質(zhì)、核質(zhì)等.在MF類中，靶點(diǎn)主要集中在酶結(jié)合、染色質(zhì)結(jié)合、類固醇激素受體、ATP酶結(jié)合、類固醇結(jié)合、RNA聚合酶II核心啟動子近端序列特異性DNA結(jié)合，配體激活序列特異性DNA結(jié)合，細(xì)胞因子活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)DNA結(jié)合等.

圖5 金銀花治療肺癌核心靶點(diǎn)GO富集分析

在KOBAS數(shù)據(jù)庫中，對20個核心靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路分析，用P<0.05及與癌癥相關(guān)性分析篩選，得到49條通路，進(jìn)行可視化處理，結(jié)果見圖6.其中，排列靠前與肺癌相關(guān)通路包括癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、癌癥的途徑、IL-17信號通路、癌癥中的蛋白多糖、腫瘤壞死因子信號通路，與癌癥相關(guān)富集通路包括乳腺癌、膀胱癌、癌癥中的MicroRNAs、腎細(xì)胞癌、癌癥的中心碳代謝、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥、鉑類耐藥、前列腺癌、胃癌、甲狀腺癌、子宮內(nèi)膜癌、非小細(xì)胞肺癌，與癌癥相關(guān)信號通路包括MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路、雌激素信號通路、T細(xì)胞受體信號通路、C型凝集素受體信號通路、NOD樣受體信號通路、p53信號通路、PPAR信號通路、NF-κB信號通路、FoxO信號通路、Jak-STAT信號通路，與其他疾病及免疫等相關(guān)的通路，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、瘧疾、乙型肝炎、內(nèi)分泌抵抗、焦點(diǎn)粘著、造血細(xì)胞系、細(xì)胞衰老、細(xì)胞凋亡、Toll樣受體信號通路、Th17細(xì)胞分化、Th1和Th2細(xì)胞分化等.

圖6 金銀花治療肺癌核心靶點(diǎn)KEGG通路分析

2.5 構(gòu)建金銀花成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

在Cytosacpe3.7.1軟件中，將金銀花有效成分與51個交集靶點(diǎn)構(gòu)建金銀花成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見圖7.網(wǎng)絡(luò)總共包括63個節(jié)點(diǎn)(1個藥材節(jié)點(diǎn)、11個化合物節(jié)點(diǎn)、51個靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn))和110條邊.其中degree值排列前8的金銀花成分分別是槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、5-羥基-7-甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)色酮、豆甾醇、β-胡蘿卜素、金圣草素.它們是金銀花發(fā)揮治療肺癌的核心成分.另外,根據(jù)篩選的20個核心靶點(diǎn)，構(gòu)建金銀花成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖，見圖8，展示多成分、多靶點(diǎn)、多通路金銀花治療肺癌關(guān)系，構(gòu)建藥物-靶點(diǎn)-疾病的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖.

圖7 金銀花“有效成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖 圖8 金銀花“有效成分-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 肺癌生存率及相關(guān)基因表達(dá)分析結(jié)果

通過GEPIA在線數(shù)據(jù)庫，使用Kaplan-Meier曲線對20個核心靶點(diǎn)基因進(jìn)行生存率分析.基因CCNB1、ICAM1、IGFBP3、MET、MMP9不同表達(dá)使肺癌生存率有顯著差異，見圖9，這5個基因低表達(dá)組肺癌生存率高于高表達(dá)組.采用GEPIA在線分析這5個基因mRNA相對表達(dá)量，見圖10，左邊紅色組為肺癌組織，右邊灰色組為正常肺組織，其中CCNB1、IGFBP3、MMP9在肺癌組織中相對表達(dá)量明顯升高(P<0.05).

圖9 CCNB1、ICAM1、IGFBP3、MET、MMP9在肺癌中生存分析

圖10 CCNB1、ICAM1、IGFBP3、MET、MMP9在肺癌組織和正常組織中表達(dá)情況

2.7 免疫組化分析結(jié)果

通過Proteinatlas數(shù)據(jù)庫對2.6中篩選的5個基因進(jìn)行搜索，發(fā)現(xiàn)這些基因在肺癌組織中呈現(xiàn)不同程度陽性反應(yīng)，見圖11.通過抗體 CAB003804 在正常肺組織未檢測到CCNB1，在肺癌組織呈現(xiàn)中等強(qiáng)度染色，染色細(xì)胞比例為25%～75%.通過抗體 CAB002142 在正常肺組織未檢測到ICAM1，在肺癌組織呈現(xiàn)中等強(qiáng)度染色，染色細(xì)胞比例25%～75%.通過抗體 CAB005282 在正常肺組織低強(qiáng)度檢測到MET，在肺癌組織呈現(xiàn)中等強(qiáng)度染色，染色細(xì)胞比例>75%.通過抗體 CAB068201在正常肺組織及肺癌組織中均未檢測到MMP9.數(shù)據(jù)庫中未找到表達(dá)IGFBP3的正常肺組織和肺癌組織.

圖11 CCNB1、ICAM1、MET、MMP9在肺癌中免疫組織化代表圖

2.8 分子對接驗(yàn)證結(jié)果

根據(jù)2.6篩選的5個基因，結(jié)合其degree值排名，選擇CCNB1、ICAM1、MMP9與金銀花成分槲皮素、木犀草素分別進(jìn)行分子對接，對接參數(shù)設(shè)置及計算結(jié)果見表2，對接相互作用見圖12.一般配體與受體結(jié)合能越低，構(gòu)象越穩(wěn)定，發(fā)生結(jié)合可能性越大，當(dāng)結(jié)合能小于-5.0 kcal/mol表示有好的結(jié)合活性[17].對接結(jié)果顯示，槲皮素、木犀草素與CCNB1結(jié)合能分別為-6.9、-7.0kcal/mol，與CCNB1均有強(qiáng)結(jié)合性；槲皮素、木犀草素、山奈酚與ICAM1結(jié)合能分別為-5.9、-5.8、-5.8 kcal/mol，均小于原配體NAG結(jié)合能-4.5 kcal/mol，表明這3個化合物與ICAM1均有強(qiáng)結(jié)合性，且比原配體NAG結(jié)合性更好；槲皮素、木犀草素與MMP9結(jié)合能分別為-8.7、-8.8kcal/mol，均小于原配體NFH結(jié)合能-6.9 kcal/mol，表明這2個化合物與MMP9均有強(qiáng)結(jié)合性，且比原配體NFH結(jié)合性更好.圖12是槲皮素、木犀草素、山奈酚與CCNB1、ICAM1、MMP9三維分子對接圖，其中藍(lán)線、灰色虛線、綠色虛線分別代表各配體與靶點(diǎn)氨基酸殘基形成氫鍵、疏水作用、芳香共軛體系.

表2 金銀花核心化合物與核心靶點(diǎn)結(jié)合能

圖12 金銀花核心成分與關(guān)鍵核心靶點(diǎn)三維分子對接模式

3 討 論

金銀花在我國使用歷史悠久，《神農(nóng)本草經(jīng)》、《本草綱目》等古籍中都有記載，并有大量臨床和人體應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)[6].臨床案例也發(fā)現(xiàn)金銀花在治療肺癌和其他癌癥上有療效，有研究發(fā)現(xiàn)金銀花中槲皮素、綠原酸等成分對肺癌作用，可通過調(diào)節(jié)如CDK1、CCNB1、Bcl-2等蛋白表達(dá)及影響MAPK、PI3K-Akt信號通路等，阻滯細(xì)胞周期抑制癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18].但這些研究僅基于“一個藥物，一個靶點(diǎn)”的傳統(tǒng)研究思路設(shè)計.中藥成分復(fù)雜，可通過多靶點(diǎn)、多途徑、多層次整合調(diào)控產(chǎn)生協(xié)同功效[19].因此，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，將藥物多成分、多靶點(diǎn)、多通路關(guān)系展示出來，構(gòu)建藥物-靶點(diǎn)-疾病的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，系統(tǒng)多角度揭示金銀花治療肺癌的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制，并利用生物信息學(xué)分析方法，對肺癌基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘，提供臨床檢測和治療肺癌的潛在靶點(diǎn)，從而建立基礎(chǔ)研究與臨床研究間的聯(lián)系，最后通過分子對接展現(xiàn)藥物成分與靶點(diǎn)間的相互作用，驗(yàn)證金銀花治療肺癌的藥效物質(zhì)基礎(chǔ).

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)TCMSP數(shù)據(jù)庫，OB、DL預(yù)測經(jīng)口給藥具有一定生物活性的金銀花有效成分，并得到金銀花“有效成分-靶點(diǎn)”，同時篩選Gene數(shù)據(jù)庫中肺癌疾病基因，并分析GEO數(shù)據(jù)庫中人源肺癌數(shù)據(jù)芯片GSE118370微陣列數(shù)據(jù)，并鑒定出在肺癌患者和正常人之間有顯著差異的基因.將三個數(shù)據(jù)庫進(jìn)行交集，得到金銀花治療肺癌“核心成分-靶點(diǎn)”，通過拓?fù)浞治?，篩選degree排前20核心靶點(diǎn)，用GO和KEGG研究這些靶點(diǎn)基因富集功能及通路.GO分析表明，這些基因通過細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、基因表達(dá)調(diào)控、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡等參與金銀花治療肺癌作用.KEGG分析表明，這些基因富集于與肺癌直接相關(guān)通路，如癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、癌癥的途徑、癌癥中蛋白多糖、腫瘤壞死因子信號通路、癌癥中的MicroRNAs、非小細(xì)胞肺癌、鉑類耐藥、細(xì)胞衰老、細(xì)胞凋亡等；多條信號通路與抗腫瘤、影響腫瘤細(xì)胞周期、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)等相關(guān).如腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡及新血管的生成密切相關(guān)的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路[20]；與肺癌、乳腺癌等多種癌癥發(fā)生相關(guān)的磷酯酰肌醇-3激酶-絲氨酸/蘇氨酸激酶(PI3K-Akt)信號通路[21]；目前發(fā)現(xiàn)的與人類腫瘤相關(guān)性最高的人體抑癌基因(p53)信號通路[22]；與自身免疫調(diào)節(jié)、影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展的轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族(NF-κB)信號通路；抗炎、自身免疫調(diào)節(jié)及腫瘤相關(guān)的IL-17(白介素-17)信號通路[23]；與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、活化等相關(guān)并具有免疫調(diào)節(jié)作用JAK-STAT信號通路[24].另外，T細(xì)胞受體、C型凝集素受體、Toll樣受體、NOD樣受體等信號通路也協(xié)同其他通路發(fā)揮著免疫調(diào)節(jié)及腫瘤相關(guān)的作用.此外還有富集于內(nèi)分泌抵抗、焦點(diǎn)粘著、造血細(xì)胞系及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、瘧疾多種疾病通路等.

通過GEPIA在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步評估這20個基因不同表達(dá)在肺癌生存率中的顯著差異，篩選到5個基因CCNB1、ICAM1、IGFBP3、MET、MMP9低表達(dá)與肺癌生存率升高顯著相關(guān)，該結(jié)果與GEO數(shù)據(jù)庫分析肺癌GSE118370芯片差異基因表達(dá)情況上下調(diào)一致.另外免疫組化結(jié)果也證實(shí)與正常組織相比，肺癌組織中CCNB1、ICAM1、MET基因上調(diào).對這些基因進(jìn)行文獻(xiàn)發(fā)掘，也證實(shí)它們與肺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)性.CCNB1在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G2/M期進(jìn)展中期關(guān)鍵作用，抑制其表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡，相關(guān)研究證實(shí)其在NSCLC中高表達(dá)患者總生存率較短，此外，它可參與P53、FOXM1-CCNB1信號通路等，對不同腫瘤發(fā)生發(fā)展起不同作用[25].ICAM1具有促進(jìn)炎癥部位黏連性，影響腫瘤侵襲、擴(kuò)增、轉(zhuǎn)移及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫作用，其在腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)[26]，通過研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)ICAM1基因可以抑制NSCLC細(xì)胞生長[27].IGFBP3是胰島素樣生長因子家族(IGFs)成員，IGFs具有促有絲分裂、影響細(xì)胞增殖分化凋亡等作用，并與腫瘤發(fā)生發(fā)展、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡關(guān)系密切.IGFBP3 是人體含量最多并起最主要調(diào)節(jié)作用蛋白，可通過抑制 PI3K/Akt/PKB 和 MAPK通路誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞凋亡，在臨床NSCLC患者血清中，IGFBP-3水平顯著低于正常人[28]，此外NSCLC患者中發(fā)現(xiàn)IGFBP3在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中可同時表達(dá)，其中質(zhì)表達(dá)陽性者中位生存時間顯著短于陰性者，核表達(dá)陽性者中位生存時間顯著長于陰性者[29].IGFBP3在核質(zhì)中不同表達(dá)可能造成其無法在Proteinatlas數(shù)據(jù)庫中查找免疫組化結(jié)果.MET是NSCLC中重要腫瘤驅(qū)動基因，它在NSCLC中過表達(dá)，可促進(jìn)癌細(xì)胞生長、侵襲和凋亡; 通過臨床發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者中，MET高表達(dá)組5年總生存率明顯低于其低表達(dá)組，且高表達(dá)組具有不良預(yù)后[30].MMP9是金屬蛋白酶家族(MMPs)成員，腫瘤細(xì)胞和周圍基質(zhì)誘導(dǎo)的MMPs過度表達(dá)使細(xì)胞基質(zhì)降解，利于腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移；此外MMPs介導(dǎo)細(xì)胞遷移、分化、增殖、凋亡、血管生成和炎癥反應(yīng)相關(guān)的信號通路，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展.其中MMP9在肺癌發(fā)展中起重要作用，它可參與腫瘤增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等過程，特別是在新生血管形成中發(fā)揮著重要作用，研究發(fā)現(xiàn)在NSCLC患者血清中，MMP9水平顯著高于正常人[31].免疫組化中肺癌組織未能檢測到MMP9，但GEPIA數(shù)據(jù)庫分析其在肺癌組織中mRNA相對表達(dá)量顯著升高，這可能是Proteinatlas數(shù)據(jù)庫標(biāo)本數(shù)量有限，我們將在以后免疫組化分析中對其進(jìn)一步關(guān)注.

將上述篩選到的5個基因，結(jié)合其degree值排名，與對應(yīng)篩選金銀花核心成分進(jìn)行分子對接，發(fā)現(xiàn)CCNB1與槲皮素、木犀草素；ICAM1與槲皮素、木犀草素、山奈酚；MMP9與槲皮素、木犀草素能通過形成氫鍵、疏水作用及芳香共軛體系相互作用較好結(jié)合，結(jié)合能均小于-5.0kcal/mol，其中ICAM1、MMP9與對應(yīng)成分結(jié)合性比原配體更好，更易形成穩(wěn)定化合物，說明金銀花對治療肺癌應(yīng)有較好療效，槲皮素、木犀草素、山奈酚等成分可能成為治療肺癌的潛在物質(zhì)基礎(chǔ).槲皮素、山奈酚、木犀草素都是黃酮類化合物，它們可通過阻滯細(xì)胞周期、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲、誘導(dǎo)其凋亡及抑制腫瘤血管生成等發(fā)揮抗癌作用，還可通過抗氧化、免疫調(diào)節(jié)間接發(fā)揮抗癌作用.文獻(xiàn)報道槲皮素能通過穩(wěn)定p53、抑制MMP9等從而抑制腫瘤細(xì)胞生長、侵襲、轉(zhuǎn)移等[32]，作用于PI3K-Akt、MAPK、IL-6/JAK/STAT3等信號通路抗肺癌等多種腫瘤細(xì)胞，還能作用于與P53通路相關(guān)多藥耐藥基因 MDR1(MDM2)上，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性[33].木犀草素能穩(wěn)定p53、抑制p-Akt、MMP9等，作用于PI3K-Akt、MAPK/ERKS、NF-κB等信號通路，并能作為增敏劑和順鉑聯(lián)用，抑制NSCLC細(xì)胞株[34].山奈酚能抑制CCNB1、MMP9及腫瘤中MicroRNA等，作用于MAPK、PI3K-AKT、NF-κB、JAK/STAT等信號通路，抑制NSCLC細(xì)胞株[35-36].這些與本研究中網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接結(jié)果相符，展現(xiàn)金銀花多成分、多靶點(diǎn)、多通路的協(xié)同作用治療肺癌.

4 結(jié) 論

綜上所述，本研究通過生物信息學(xué)挖掘肺癌基因芯片GSE118370數(shù)據(jù)，用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接方法研究金銀花治療肺癌物質(zhì)基礎(chǔ)、靶點(diǎn)、作用機(jī)制，得到51個金銀花-肺癌靶點(diǎn)，對應(yīng)金銀花有效成分11個；對靶點(diǎn)進(jìn)行GO生物富集和KEGG 通路分析，得到與癌癥直接相關(guān)通路、癌癥相關(guān)信號通路、免疫調(diào)節(jié)及其他疾病通路等.通過GEPIA數(shù)據(jù)庫，篩選到靶點(diǎn)CCNB1、ICAM1、IGFBP3、MET、MMP9不同表達(dá)在肺癌生存率中具有顯著差異；免疫組化結(jié)果證實(shí)，肺癌組織中CCNB1、ICAM1、MET基因上調(diào)；分子對接結(jié)果證實(shí)CCNB1、ICAM1、MMP9和對應(yīng)成分槲皮素、木犀草素、山奈酚均能很好結(jié)合，進(jìn)一步證實(shí)生信學(xué)的分析和推測.通過這些信息我們將進(jìn)一步認(rèn)識肺癌發(fā)生發(fā)展過程，并為金銀花作為臨床治療肺癌或輔助藥物提供參考.這些研究有助于了解金銀花治療肺癌潛在物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究提供指導(dǎo).