呂凱峰 王遠(yuǎn)紅 張 偉 劉宏偉

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，黑龍江哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科，黑龍江哈爾濱 150040；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中醫(yī)兒科，黑龍江哈爾濱 150040

白癜風(fēng)是一種典型的皮膚黏膜色素脫失性疾病，祖國(guó)醫(yī)學(xué)稱此病為“白癜”“白毋奏”，亦或“白疙”[1-2]。該病易于診斷，難于治療，且極大地影響患者的身心健康[3]。目前國(guó)內(nèi)白癜風(fēng)患者發(fā)病率為0.1%～2.0%[4]。臨床上常用的治療方法包括激素、免疫抑制劑、光化學(xué)療法、手術(shù)療法等[5-8]，效果均不理想，具有易復(fù)發(fā)和副作用的缺點(diǎn)[9]。中醫(yī)治療白癜風(fēng)具有優(yōu)勢(shì)和特色，掃白靈、掃白茴風(fēng)丸是王遠(yuǎn)紅教授治療白癜風(fēng)的代表性方劑[10-11]，臨床效果令人滿意。但由于其具體藥效物質(zhì)及作用的靶標(biāo)通路尚不明確，導(dǎo)致該方的臨床推廣受到了一定的限制。因此本研究應(yīng)用中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[12]探討掃白靈、掃白茴風(fēng)丸中的重要藥對(duì)“菟絲子-淫羊藿”調(diào)治白癜風(fēng)的主要活性成分和作用機(jī)制，同時(shí)為后續(xù)掃白靈、掃白茴風(fēng)丸的實(shí)驗(yàn)研究與臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)生物學(xué)信息支撐。

1 資料與方法

1.1 “菟絲子-淫羊藿”活性成分及靶標(biāo)的收集及篩選

依托中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)、中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫(kù)、中藥癥候關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫(kù)、在線中醫(yī)藥生物信息學(xué)分析工具檢索菟絲子、淫羊藿的化學(xué)組成成分，通過數(shù)據(jù)庫(kù)初步篩選口服利用度（oral bioavail ability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 的潛在活性成分。篩選結(jié)束后，從數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索活性成分相對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)，由于檢索到的靶標(biāo)目標(biāo)存在命名不規(guī)范的問題,為標(biāo)準(zhǔn)化蛋白質(zhì)靶標(biāo)信息，統(tǒng)一在UniProt 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)將化合物作用的蛋白質(zhì)靶標(biāo)校正為基因標(biāo)準(zhǔn)化命名。

1.2 白癜風(fēng)疾病相關(guān)靶標(biāo)篩選

借助于在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)、靶向藥物數(shù)據(jù)庫(kù)、GeneCards、DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索與白癜風(fēng)相關(guān)的疾病靶標(biāo)。

1.3 “菟絲子-淫羊藿”的“藥對(duì)-化合物-潛在靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

將藥對(duì)、活性成分及靶標(biāo)應(yīng)用Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建“藥對(duì)-活性化合物-潛在靶標(biāo)”聯(lián)系的網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 “菟絲子-淫羊藿”-白癜風(fēng)交集靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用微生信在線作圖平臺(tái)（http：//www.bioinformatics.com.cn/）繪制維恩圖，取交集，進(jìn)而將交集靶標(biāo)上傳STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，得到“菟絲子-淫羊藿”治療白癜風(fēng)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)模型，并導(dǎo)入Cytoscape 中進(jìn)行可視化展示。

1.5 交集基因本體及通路富集分析

利用David 數(shù)據(jù)庫(kù)將上述交集靶標(biāo)進(jìn)行GO 功能及KEGG 通路富集分析，并借助微生信在線作圖平臺(tái)對(duì)富集結(jié)果進(jìn)行可視化展示。

2 結(jié)果

2.1 “菟絲子-淫羊藿”主要活性成分及靶標(biāo)

對(duì)“菟絲子-淫羊藿”活性成分進(jìn)行挖掘及篩選，剔除重復(fù)數(shù)據(jù)后剩余主要有效成分31 個(gè)。見圖1。同時(shí)檢索并將兩味藥物活性成分的潛在靶標(biāo)合并去重后共獲得222 個(gè)相關(guān)作用靶標(biāo)蛋白。

圖1 “菟絲子-淫羊藿”主要活性成分及靶標(biāo)

2.2 白癜風(fēng)潛在作用靶標(biāo)

共獲得與白癜風(fēng)相關(guān)的基因1198 個(gè)。設(shè)定Score大于中位數(shù)（score ＞0.63）為白癜風(fēng)的潛在靶標(biāo)，最終得到潛在靶標(biāo)457 個(gè)。

2.3 “藥對(duì)-化合物-潛在治療靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)

“藥對(duì)-化合物-潛在治療靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)見圖2。篩選出槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷固醇、脫水淫羊藿素、芝麻素等重要化合物。

圖2 “藥對(duì)-化合物-潛在治療靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)

2.4 “菟絲子-淫羊藿”-白癜風(fēng)靶標(biāo)的PPI 網(wǎng)絡(luò)分析

共得到共同靶標(biāo)47 個(gè)，見圖3。進(jìn)一步將交集靶標(biāo)提交至STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，并排除游離的沒有聯(lián)系的2 個(gè)節(jié)點(diǎn)。得到“菟絲子-淫羊藿”-白癜風(fēng)潛在靶標(biāo)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見圖4。將STRING 平臺(tái)獲取的靶標(biāo)蛋白相互信息導(dǎo)入Cytoscape 中進(jìn)行可視化展示，見圖5。其中顏色越發(fā)鮮明、節(jié)點(diǎn)形狀越大，則度值越大，度值越大證明在網(wǎng)絡(luò)中越重要。連線越粗，相互作用關(guān)系亦越大。其中排名靠前30 位、度值大的節(jié)點(diǎn)見圖6。

圖3 “菟絲子-淫羊藿”有效成分與白癜風(fēng)疾病靶標(biāo)交集維恩圖

圖4 “菟絲子-淫羊藿”-白癜風(fēng)潛在靶標(biāo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖5 “菟絲子-淫羊藿”干預(yù)白癜風(fēng)靶標(biāo)的可視化分析

圖6 “菟絲子-淫羊藿”干預(yù)白癜風(fēng)的核心靶標(biāo)（度值前30）

2.5 GO及KEGG 通路富集分析結(jié)果

45 個(gè)共同靶標(biāo)進(jìn)行GO 分析得到條目356 個(gè)，其中分子功能44 個(gè)、生物過程284 個(gè)、細(xì)胞組分28 個(gè)，見圖7。KEGG 通路富集分析共篩選出信號(hào)通路23 條，主要涉及TNF、T 細(xì)胞受體、Toll 樣受體、PI3K-Akt、FoxO、MAPK 等信號(hào)通路，見圖8。

圖7 “菟絲子-淫羊藿”干預(yù)白癜風(fēng)潛在靶標(biāo)的GO 富集分析

圖8 “菟絲子-淫羊藿”干預(yù)白癜風(fēng)潛在靶標(biāo)的KEGG 信號(hào)通路分析

3 討論

由本研究的“藥對(duì)-化合物-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)可知槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷固醇、脫水淫羊藿素、芝麻素度值較高，提示以上可能是“菟絲子-淫羊藿”治療白癜風(fēng)的有效成分，并協(xié)同作用于多個(gè)靶標(biāo)發(fā)揮效果。

PPI 網(wǎng)絡(luò)提示TP53、IL-6、TNF、VEGFA、MAPK1、PTGS2 等這些靶標(biāo)度值較高，相關(guān)文獻(xiàn)已有對(duì)本研究預(yù)測(cè)的大部分潛在靶標(biāo)與白癜風(fēng)關(guān)系的報(bào)道[13-17]。本課題組前期通過觀察以“菟絲子-淫羊藿”藥對(duì)為主要成分的掃白靈干預(yù)白癜風(fēng)發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組血清中的IL-10、TNF 較對(duì)照組水平明顯升高，提示此藥對(duì)可能通過IL-10、TNF 等關(guān)鍵靶標(biāo)發(fā)揮治療白癜風(fēng)的作用[10-11]。

關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的KEGG 通路分析提示藥對(duì)可通過多條通路治療白癜風(fēng)，且富集到的信號(hào)通路中多數(shù)已得到證實(shí)[18-19]。此外本研究富集到了許多看似與本病不相關(guān)的一些通路，但有研究表明，這些疾病之間有一定的內(nèi)在聯(lián)系[20-25]。這些通路可以幫助臨床醫(yī)師從多角度剖析本藥對(duì)治療白癜風(fēng)患者的體內(nèi)途徑及白癜風(fēng)與其他疾病間的內(nèi)在關(guān)聯(lián)，如“菟絲子-淫羊藿”是否主要通過MAPK、PI3K-Akt、NF-κB 等潛在通路達(dá)到治療白癜風(fēng)病的目的，肺結(jié)核病與白癜風(fēng)發(fā)病是否具有一定相關(guān)性等。

綜上所述，“菟絲子-淫羊藿”治療白癜風(fēng)通過多成分、多靶標(biāo)、多通路[26]治療白癜風(fēng)。本研究所得核心成分、靶標(biāo)及通路與白癜風(fēng)治療密切相關(guān)。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)了其他潛在活性成分，如山柰酚、木犀草素、β-谷固醇等，以及靶標(biāo)，如TP53、IL-6、TNF 等，提示“菟絲子-淫羊藿”可以通過多靶標(biāo)多通路治療白癜風(fēng)，為其臨床開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。