穆彥 劉新燕 齊勝娟

(1.保定市第二中心醫(yī)院麻醉科，河北 保定 071000；2.邯鄲市中心醫(yī)院麻醉科，河北 邯鄲 056000；3.涿州市醫(yī)院麻醉科，河北 涿州 072750)

麻醉可以消除患者手術(shù)過程中疼痛和恐懼，是手術(shù)過程至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。麻醉的好壞直接影響手術(shù)的成功率及患者的生命健康。西醫(yī)麻醉具有麻醉效果快、無痛等優(yōu)勢，是臨床手術(shù)麻醉的主流方式。但是研究表明西醫(yī)麻醉會不同程度的影響患者的生理功能，導(dǎo)致麻藥不耐受患者出現(xiàn)術(shù)后并發(fā)癥如認(rèn)知功能障礙，誘發(fā)機體炎癥反應(yīng)等[1-2]。電針麻醉是針刺麻醉法之一，指針刺入穴位后接通電麻儀(電針機)，通過毫針輸入電流刺激達(dá)到鎮(zhèn)痛效果以施行手術(shù)的方法。它是在電針療法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種針麻方法，普遍應(yīng)用于各種針麻手術(shù)。電針麻醉有很好的鎮(zhèn)痛作用，電針麻醉可以改善疼痛涉及生物體多種生物活性分子，包括神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)調(diào)質(zhì)、神經(jīng)肽、細(xì)胞信號分子和炎性介質(zhì)等的分泌表達(dá)，減緩疼痛感受[3-4]。同時針刺麻醉具有對患者生理擾亂小、穩(wěn)定人體內(nèi)環(huán)境、提高機體防御能力、延長麻醉效果、操作簡便安全經(jīng)濟(jì)等優(yōu)越性，在臨床麻醉上受到廣泛重視[5]。研究表明在大鼠體外循環(huán)手術(shù)過程中使用針刺輔助麻醉能顯著改善大鼠術(shù)后機體損傷[6]。心梗冠狀動脈搭橋手術(shù)是臨床上常見的手術(shù)治療方式，手術(shù)過程采用西醫(yī)全身麻醉，由于搭橋后心臟會出現(xiàn)再灌注損傷，且手術(shù)時間相對較長，合適的麻醉方式對患者的預(yù)后是至關(guān)重要的。因此，如何從麻醉角度降低麻醉對手術(shù)的影響及改善缺血再灌注損傷是在急性心梗手術(shù)中麻醉的研究熱點。本研究在大鼠缺血再灌注損傷模型中使用針刺輔助全身麻醉，探究該種麻醉方式對手術(shù)后機體反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑 人促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(CRF)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購于生工生物工程(上海)股份有限公司，大鼠肌酸激酶MB型同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒購于Cayman公司，大鼠心肌肌鈣蛋白I(cTnI)檢測試劑盒購于Humasis公司，大鼠炎癥因子白細(xì)胞介素1b(IL-1b)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子a(TNF-α)檢測試劑盒購于R&D公司，PE-Anti-CD45抗體、BV421-Anti-Ly6G抗體、FITC-Anti-CD11b抗體、APC-Anti-F4/80抗體購于BD公司，TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于凱基生物有限公司，抗大鼠半胱氨酸天冬酸蛋白酶-3(Caspase 3)、GAPDH抗體購于Abcam公司。

1.2 實驗動物 20只9周齡SPF雄性SD大鼠購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)環(huán)境溫度(22±2)℃，相對濕度40%～60%。實驗動物處理符合動物倫理要求，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核同意。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及模型建立 隨機將大鼠分成對照組和干預(yù)組，每組10只。兩組大鼠手術(shù)過程均使用吸入七氟烷進(jìn)行誘導(dǎo)維持麻醉，使用脫毛膏去除胸部前外側(cè)毛發(fā)；常規(guī)消毒，切開皮膚、肌層，在左側(cè)第4肋間隙開胸，以環(huán)形鉤拉出心臟。在左心耳下方3～4 mm處冠脈前降支位置，以6/0無損傷絲線穿線，并置直徑1.6 mm 尼龍線，連同冠狀動脈前降支一起結(jié)扎，另一端留于體外備用；將心臟放回胸腔，排空胸腔內(nèi)空氣，關(guān)閉胸腔；結(jié)扎30 min后小心移除尼龍線進(jìn)行再灌注[7]。除七氟烷麻醉外，干預(yù)組大鼠在手術(shù)前30 min開始，使用電針對大鼠穴位百會、合谷、內(nèi)關(guān)、足三里進(jìn)行電刺激并維持至手術(shù)結(jié)束。

1.3.2 外周血因子檢測 外周血花生四烯酸乙醇胺(AEA)和CRF檢測：取兩組模型大鼠手術(shù)前和手術(shù)后12 h外周血，置于肝素抗凝管中。采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對大鼠血漿中AEA水平進(jìn)行測定：取3 mL血漿，加入0.5 mL甲苯，混勻后10000 rpm離心10 min。微孔過濾后，取1 mL濾過液，使用氮氣揮干，然后加入衍生化試劑DBD-COCl衍生化，然后使用HPLC檢測樣品中AEA衍生化合物水平，根據(jù)外標(biāo)定量，確定血漿中AEA水平。使用人CRF酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，大鼠CK-MB、LDH檢測試劑盒，大鼠cTnI檢測試劑盒、大鼠IL-1b、IL-6、TNF-α檢測試劑盒檢測大鼠外周血中CRF、CK-MB、LDH、cTnI、IL-1b、IL-6、TNF-α水平，具體檢測方法參照試劑盒使用說明書。

1.3.3 大鼠心臟組織IL-1b、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)水平檢測 手術(shù)后12 h麻醉處死大鼠，取大鼠心臟再灌注區(qū)組織。取部分再灌注區(qū)組織，采用Trizol法提取組織中RNA，然后反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，采用Realtime PCR法檢測大鼠心臟再灌注區(qū)組織IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)水平。IL-1b qPCR引物：上游，5′-CGA GAGGATGTTCCAATGCA-3′，下游5′-GTTCTGC AAACTGGCAGGAA-3′；IL-6 qPCR引物：上游，5′-GACGAGAGCCAGTTTAGCAT-3′，下游5′-TGGA GCTTCACTGGAAGACA-3′；TNF-α qPCR引物：上游5′-GGAGGCGCTAATTCGTTAGC-3′，下游5′-C CTTGGGGATGATACACATG-3′。

1.3.4 大鼠心臟組織炎癥細(xì)胞浸潤水平檢測 手術(shù)后12 h麻醉處死大鼠，剖開胸腹，暴露心臟，使用10 mL肝素生理鹽水，從左心室緩慢注入心臟，直至心臟變白無血色，然后取下心臟，剪取20 mg再灌注區(qū)心臟組織，放入EP管中，加入酶消化液，使用剪刀剪碎，然后置于37℃溫箱中震蕩消化，10 min后取出，使用200目金屬網(wǎng)過濾，濾過液即為制備好的單細(xì)胞懸液。取100 mL單細(xì)胞懸液，分別于PE-Anti-CD45抗體、BV421-Anti-Ly6G抗體、FITC-Anti-CD11b抗體、APC-Anti-F4/80抗體避光冰上孵育30 min，然后使用流式細(xì)胞儀檢測分析單細(xì)胞懸液中炎癥細(xì)胞數(shù)量。在CD45和CD11b雙陽性細(xì)胞群中，分別找到Ly6G單陽性(中性粒細(xì)胞)及Ly6G和F4/80雙陽性細(xì)胞(巨噬細(xì)胞)。

1.3.5 大鼠心肌細(xì)胞凋亡檢測 使用TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(綠色FITC標(biāo)記熒光檢測法)對大鼠心臟再灌注損傷區(qū)心肌細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行分析，具體方法參照試劑盒說明書；使用熒光顯微鏡對染色后的心臟組織進(jìn)行拍照，選取心臟缺血區(qū)上、下、左、右、中5個區(qū)域，每個區(qū)域分別拍2張照片，然后使用Image pro plus對組織中凋亡細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行計數(shù)。

1.3.6 western blot檢測 手術(shù)后12 h麻醉處死大鼠，取大鼠心臟再灌注區(qū)組織，使用RIPA裂解液對組織進(jìn)行裂解。使用western blot對裂解液中活化Caspase 3水平進(jìn)行分析檢測。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠手術(shù)前后血漿CK-MB、cTnI和LDH水平變化 ELISA檢測結(jié)果顯示，手術(shù)前，兩組血漿CK-MB、cTnI和LDH水平比較無明顯差異(P>0.05)；手術(shù)后，兩組血漿CK-MB、cTnI和LDH水平均較手術(shù)前顯著升高(P<0.05)，且干預(yù)組顯著低于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠手術(shù)前后血漿CK-MB、cTnI和LDH水平變化

2.2 各組大鼠手術(shù)前后血漿IL-1b、IL-6、TNF-α水平變化 ELISA檢測結(jié)果顯示，手術(shù)前，兩組血漿IL-1b、IL-6和TNF-α水平比較無明顯差異(P>0.05)；手術(shù)后，兩組血漿IL-1b、IL-6和TNF-α水平均較手術(shù)前顯著升高(P<0.05)；且干預(yù)組顯著低于對照組(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠手術(shù)前后血漿IL-1b、IL-6、TNF-α水平變化

2.3 各組大鼠手術(shù)前后血漿AEA和CRF水平變化 液相和免疫檢測發(fā)現(xiàn)，手術(shù)前，兩組大鼠血漿AEA、CRF水平比較均無明顯差異(P>0.05)；手術(shù)后，對照組血漿AEA、CRF水平與手術(shù)前比較無明顯差異(P>0.05)，干預(yù)組血漿AEA、CRF水平顯著高于手術(shù)前，且顯著高于對照組(均P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠手術(shù)前后血漿AEA和CRF水平變化

2.4 大鼠模型手術(shù)后心肌細(xì)胞凋亡情況 TUNEL檢測結(jié)果顯示，手術(shù)后干預(yù)組組織凋亡細(xì)胞數(shù)目相比于對照組組織顯著降低(P<0.05)，見圖1。

圖1 大鼠心臟再灌注區(qū)心肌細(xì)胞凋亡情況

2.5 大鼠模型手術(shù)后心臟組織活化Caspase 3表達(dá)水平變化 Western blot檢測結(jié)果顯示，手術(shù)后干預(yù)組組織活化caspase 3表達(dá)水平顯著低于對照組(P<0.05)，見圖2。

圖2 大鼠心臟再灌注區(qū)心臟組織活化Caspase 3表達(dá)水平

2.6 大鼠模型手術(shù)后心臟組織IL-1b、IL-6、TNF-α mRNA水平變化 Realtime PCR檢測結(jié)果顯示，手術(shù)后干預(yù)組組織IL-1b、IL-6和TNF-α mRNA水平顯著低于對照組(P<0.05)，見表4。

表4 大鼠模型手術(shù)后心臟組織IL-1b、IL-6、TNF-α mRNA水平變化

2.7 大鼠模型手術(shù)后心臟組織炎癥細(xì)胞浸潤變化 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，手術(shù)后干預(yù)組組織中性粒細(xì)胞(Ly6G陽性、F4/80陰性)和巨噬細(xì)胞(Ly6G和F4/80雙陽性)水平顯著低于對照組(P<0.05)，見圖3。

圖3 大鼠心臟再灌注區(qū)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤情況

3 討論

心臟手術(shù)引發(fā)的心臟缺血再灌注損傷能夠誘發(fā)患者術(shù)后心肌發(fā)生不可逆損傷進(jìn)而導(dǎo)致心功能衰退，嚴(yán)重影響患者預(yù)后。因此如何降低心肌缺血再灌注損傷是心臟手術(shù)的研究熱點。麻醉持續(xù)整個手術(shù)過程，圍手術(shù)期的心肌保護(hù)是臨床麻醉研究的焦點之一。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，通過穴位刺激可以達(dá)到鎮(zhèn)痛和控制生理紊亂的效果，使手術(shù)患者在鎮(zhèn)痛的同時保持生理平衡[5]。目前中醫(yī)針灸輔助麻醉在多種外科手術(shù)過程中展現(xiàn)出積極的作用。

血液中CK-MB活性、LDH活性和cTnI含量與心肌細(xì)胞損傷程度呈正相關(guān)[8-10]。本研究發(fā)現(xiàn)電針輔助麻醉大鼠模型術(shù)后外周血中CK-MB、LDH和cTnI水平顯著低于對照組，表明電針輔助麻醉能夠能夠顯著改善手術(shù)導(dǎo)致的心肌缺血再灌注損傷。在心臟缺血再灌注損傷過程中，心肌細(xì)胞凋亡水平顯著升高，導(dǎo)致收縮細(xì)胞喪失及心肌細(xì)胞代償性肥大，從而進(jìn)一步促使心臟缺血再灌注病情惡化[8]。近年研究表明刺激百會、合谷、內(nèi)關(guān)、足三里通過抑制炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激抑制疼痛及細(xì)胞損傷、凋亡[6,11-13]。本研究電針輔助麻醉能夠顯著降低大鼠心臟再灌注區(qū)心肌細(xì)胞凋亡數(shù)目，進(jìn)一步檢查發(fā)現(xiàn)電針輔助麻醉能夠顯著抑制心肌組織中活化的Caspase 3的水平。這些結(jié)果表明電針輔助麻醉能夠顯著的抑制術(shù)后心肌再灌注損傷。

炎癥反應(yīng)是心肌缺血再灌注損傷的主要分子機制，通常炎癥細(xì)胞如中性粒細(xì)胞或巨噬細(xì)胞當(dāng)收到心肌組織再灌注刺激信號時，會被募集到心臟缺血再灌注區(qū)域，然后浸潤至心肌組織中，進(jìn)一步釋放炎癥因子等，誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡等現(xiàn)象[14-15]。此外，炎癥水平與疼痛密切相關(guān)，炎癥反應(yīng)會激活神經(jīng)免疫反應(yīng)，并釋放炎性介質(zhì)，刺激并與傷害性感受器末端相應(yīng)的受體結(jié)合，持續(xù)的炎性刺激可使傷害性感受器發(fā)生痛覺敏化[16-18]。研究發(fā)現(xiàn)電針麻醉能夠具有抑制機體炎癥反應(yīng)，改善炎癥性疼痛功能。本研究發(fā)現(xiàn)電針輔助能夠降低大鼠模型外周血中炎癥因子IL-1b、IL-6、TNF-α蛋白水平以及心臟缺血區(qū)IL-1b、IL-6、TNF-α mRNA水平，顯示電針輔助麻醉可能是通過抑制心臟再灌注區(qū)組織炎癥反應(yīng)而抑制心肌損傷。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)電針輔助麻醉顯著抑制了心臟再灌注區(qū)組織中中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)目。這些結(jié)果表明電針輔助麻醉改善術(shù)后心肌損傷的分子機制與抑制心肌組織的炎癥反應(yīng)有關(guān)。

內(nèi)源性大麻素AEA和促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子CRF在疼痛調(diào)控中起著關(guān)鍵作用[19]。研究表明大麻素受體選擇性缺失能夠顯著的增強神經(jīng)疼痛。此外，研究發(fā)現(xiàn)AEA具有抗氧化、抗炎、誘導(dǎo)低溫狀態(tài)產(chǎn)生的功能，而這些功能在外科手術(shù)過程中均扮演積極的作用。CRF廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，研究表明腦內(nèi)注射CRF具有顯著的鎮(zhèn)痛效果。此外研究還顯示CRF通過下丘腦-垂體-腎上腺軸調(diào)節(jié)機體炎癥等免疫應(yīng)激[20]。AEA及CRF的表達(dá)分泌受神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控，而本研究發(fā)現(xiàn)電針刺激穴位能夠顯著增加大鼠術(shù)后外周血中AEA和CRF水平，表明電針輔助麻醉通過促進(jìn)AEA和CRF的產(chǎn)生，進(jìn)而緩解疼痛及機體炎癥反應(yīng)。

4 結(jié)論

電針輔助麻醉能抑制大鼠機體炎癥反應(yīng)，改善機體炎性疼痛及心肌再灌注損傷，其分子機制與AEA及CRF介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有關(guān)，為臨床上使用電針輔助麻醉提供了實驗依據(jù)。