朱棟良 黎尉浩 嚴(yán)海東 尹小平 田曉玲

目前,針對(duì)結(jié)腸癌的主要治療方案仍是以手術(shù)切除為主的綜合治療，晚期結(jié)腸癌、伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或術(shù)后復(fù)發(fā)的結(jié)腸癌預(yù)后較差。以氟尿嘧啶及奧沙利鉑為主的化療藥物能夠一定程度上抑制腫瘤的生長(zhǎng)，但效果有限，伊立替康及靶向藥物西妥昔單抗等藥物對(duì)于高轉(zhuǎn)移性的結(jié)腸癌可以緩解疾病的進(jìn)展，但較大的不良反應(yīng)及靶向藥物的耐藥限制了其臨床應(yīng)用。目前，亟待開(kāi)發(fā)新的更有效的靶向藥物[1-2]。阿帕替尼(apatinib)是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR2)特異性小分子抑制劑，后者作為腫瘤內(nèi)血管生成的關(guān)鍵調(diào)控因子，在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[3-4]。我們以人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480作為研究對(duì)象，研究阿帕替尼對(duì)于結(jié)腸癌侵襲能力的影響。

材料和方法

一、細(xì)胞及試劑

SW480人結(jié)腸癌細(xì)胞購(gòu)自上海中科院生物研究所。實(shí)驗(yàn)用阿帕替尼由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司贈(zèng)予。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自武漢啟動(dòng)子生物有限公司?？笶-cadherin抗體(CST,No.3195)，抗Vimentin抗體(CST,No.5741),抗Snail抗體(CST,No.3879)，抗Slug抗體(CST,No.9585)及抗內(nèi)參GAPDH抗體(CST,No.5174)，預(yù)鋪好Matrigel的Transwell(8um孔徑)等其他耗材均購(gòu)自美國(guó)康寧公司。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：SW480細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2溫箱內(nèi)培養(yǎng)，以0.25%胰蛋白酶消化傳代。

2.細(xì)胞存活能力實(shí)驗(yàn)：不同濃度阿帕替尼處理后的SW480細(xì)胞，分別于0小時(shí)、48小時(shí)按照CCK-8試劑盒說(shuō)明書(shū)，每孔加入10%的CCK8溶液，繼續(xù)孵育4小時(shí)后，利用酶標(biāo)儀在492 nM測(cè)定吸光度并繪制曲線，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.細(xì)胞侵襲能力實(shí)驗(yàn)：將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的SW480細(xì)胞，用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基重懸，以每孔5×104的密度加入到預(yù)鋪好Matrigel的Transwell小室上室內(nèi)，下室加入600 ml完全培養(yǎng)液，分別加入阿帕替尼使其終濃度為60 nM、120 nM或陰性對(duì)照，培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)48小時(shí)取出上室，用4%多聚甲醛后0.01%結(jié)晶紫染色，200倍光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，隨即取5個(gè)視野，取平均值，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

4.免疫印跡(Western blot)：檢測(cè)120 nM阿帕替尼處理后SW480細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin、Snail及Slug等MET相關(guān)蛋白水平的變化。收集細(xì)胞，加入適量NP-40裂解獲取細(xì)胞總蛋白液，加入適量SDS上樣緩沖液100 ℃水浴解交聯(lián)。蛋白樣品行聚丙烯酰胺凝膠電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)膜并用脫脂奶粉封閉非特異性結(jié)合，然后依次孵育一抗及二抗后ECL顯色液顯影，以GAPDH作為內(nèi)參。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)果

1.阿帕替尼對(duì)SW480細(xì)胞存活能力的影響：在SW480細(xì)胞中加入不同濃度的阿帕替尼，觀察其對(duì)細(xì)胞活性的影響，通過(guò)CCK8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞在492 nm波長(zhǎng)下的吸光度。結(jié)果提示，當(dāng)阿帕替尼的濃度≤120 nM時(shí)對(duì)SW480細(xì)胞的存活沒(méi)有顯著影響，而當(dāng)阿帕替尼濃度≥180 nM時(shí)，對(duì)SW480細(xì)胞的存活有明顯的抑制作用。本研究觀察阿帕替尼對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲能力的影響，因此后文中主要選擇60 nM及120 nM的阿帕替尼作為工具，以排除阿帕替尼對(duì)細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)的影響(圖1)。

aP<0.05 vs Blank,bP<0.05 vs Vector,n=5

2.阿帕替尼對(duì)SW480侵襲能力的影響：觀察60 nM及120 nM的阿帕替尼及陰性對(duì)照(Vector)處理48小時(shí)后的SW480細(xì)胞，計(jì)數(shù)穿過(guò)Matrigel的細(xì)胞數(shù)目以代表細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)果提示，120 nM阿帕替尼處理后的穿膜細(xì)胞數(shù)為(34±7)個(gè)/視野，60 nM阿帕替尼處理后的穿膜細(xì)胞數(shù)為(46±6)個(gè)/視野，相比于陰性對(duì)照組(Vector)的(109±6)個(gè)/視野及空白對(duì)照組(Blank)的(112±4)個(gè)/視野顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

圖2 apatinib對(duì)SW480細(xì)胞侵襲能力的影響(龍膽紫染色×200)

3.阿帕替尼對(duì)MET相關(guān)蛋白表達(dá)的影響：將上述細(xì)胞裂解提取總蛋白后行Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，120 nM阿帕替尼處理后，SW480細(xì)胞中上皮性標(biāo)志E-cadherin的蛋白表達(dá)明顯升高，相對(duì)應(yīng)的是間質(zhì)性標(biāo)志Vimentin的表達(dá)明顯減少；同時(shí)檢測(cè)了與MET相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，其中Snail、Slug的表達(dá)明顯降低(圖3)。

圖3 apatinib對(duì)SW480中MET相關(guān)蛋白的影響

討論

VEGF是一種重要的細(xì)胞因子，可由腫瘤細(xì)胞或腫瘤間質(zhì)細(xì)胞所分泌，其作用于腫瘤細(xì)胞表面的VEGFR，可直接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)，而作用于腫瘤中的間質(zhì)細(xì)胞如血管內(nèi)皮細(xì)胞，則可促進(jìn)后者的增殖，而增強(qiáng)腫瘤的血管生成[5]。VEGF及VEGFR是目前公認(rèn)的腫瘤分子靶向治療的重要靶點(diǎn)。目前，針對(duì)于VEGF及VEGFR的靶向藥物包括VEGF的單克隆抗體如貝伐單抗、VEGFR的單克隆抗體如雷莫蘆單抗，以及本文所研究的針對(duì)VEGFR的酪氨酸激酶小分子抑制劑如阿帕替尼[5]。阿帕替尼目前已批準(zhǔn)用于二線化療藥物無(wú)效及伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的進(jìn)展期胃癌的臨床治療，而在結(jié)腸癌、乳腺癌等其他上皮來(lái)源腫瘤中的研究正處于臨床試驗(yàn)階段。阿帕替尼主要作用于VEGFR2，后者是介導(dǎo)腫瘤血管生成的關(guān)鍵受體亞型，因此阿帕替尼延長(zhǎng)晚期腫瘤病人生存期、改善生活質(zhì)量的分子機(jī)制在于抑制腫瘤的血管生成[3-4]。而EMT及與其反向的MET是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要分子機(jī)制之一[6-7]，阿帕替尼是否能夠影響腫瘤的EMT或MET過(guò)程，進(jìn)而抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移尚不清楚。本文研究低劑量阿帕替尼對(duì)于結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲能力的影響。

我們?cè)诮Y(jié)腸癌細(xì)胞株SW480中，加入不同濃度的阿帕替尼，觀察到當(dāng)阿帕替尼濃度≤120 nM時(shí)，阿帕替尼對(duì)SW480細(xì)胞的生長(zhǎng)存活能力沒(méi)有顯著影響。我們通過(guò)預(yù)鋪好Matrigel的Transwell小室模擬腫瘤轉(zhuǎn)移時(shí)需要穿透的組織細(xì)胞基底膜，觀察到阿帕替尼可減少SW480細(xì)胞的穿膜個(gè)數(shù)，即阿帕替尼抑制了SW480細(xì)胞的侵襲能力。我們發(fā)現(xiàn)，SW480細(xì)胞經(jīng)阿帕替尼作用后細(xì)胞從長(zhǎng)梭形變成橢圓形，偽足減少變短，細(xì)胞間隙也相應(yīng)變小，而這些形態(tài)學(xué)改變是MET的特征表現(xiàn)。EMT及與其反向的MET作為一種復(fù)雜而且重要的生物學(xué)效應(yīng)，廣泛參與到多種病理生理進(jìn)程，其中包括惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[5-6]。阿帕替尼使細(xì)胞從轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng)的間質(zhì)表型向轉(zhuǎn)移能力較弱的上皮表型轉(zhuǎn)化，從側(cè)面解釋阿帕替尼對(duì)SW480細(xì)胞侵襲能力的抑制作用。為了證實(shí)阿帕替尼通過(guò)使細(xì)胞發(fā)生MET從而抑制細(xì)胞的侵襲能力，我們利用Western blot檢測(cè)阿帕替尼對(duì)細(xì)胞中MET相關(guān)蛋白如E-cadherin、Vimentin等蛋白水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上皮標(biāo)志E-cadherin表達(dá)升高，間質(zhì)標(biāo)志Vimentin表達(dá)降低，而作為調(diào)控MET的重要轉(zhuǎn)錄因子的Snail及Slug的表達(dá)也下降，提示阿帕替尼可能通過(guò)調(diào)控Snail、Slug抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

綜上所述，阿帕替尼可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480發(fā)生MET，從而降低其侵襲轉(zhuǎn)移的能力，阿帕替尼處理后SW480細(xì)胞中MET相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug的表達(dá)下降，提示Snail、Slug可能參與阿帕替尼介導(dǎo)的MET變化過(guò)程中。但阿帕替尼調(diào)控Snail、Slug的具體分子學(xué)機(jī)制尚待闡明。本研究提示，阿帕替尼可能參與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。