郭正東，卞陽陽，劉曉遷，王 棟，張思遠(yuǎn)，楊 健，彭 磊

（1. 海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院創(chuàng)傷醫(yī)學(xué)中心，海南 ?？?570216；2. 海南醫(yī)學(xué)院急救與創(chuàng)傷研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571199；3.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院創(chuàng)傷與災(zāi)難救援研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?570102）

創(chuàng)傷性骨髓炎是繼發(fā)于骨及其周邊軟組織的炎癥，在臨床上比較常見，也是臨床骨科醫(yī)師面對(duì)的比較棘手的難題，常被人們稱為“不死的癌癥”［1］。近年來，隨著我們國家國民經(jīng)濟(jì)水平的飛速提高，國家的第一、二產(chǎn)業(yè)的機(jī)械化水平也大幅度提升，致使意外事故發(fā)生率在不斷地增加，故創(chuàng)傷患者的人數(shù)也不斷增加［2］。隨著廣譜抗菌藥、糖皮質(zhì)激素等藥物的不合理使用，甚至濫用，導(dǎo)致臨床上耐藥菌株感染的患者病例數(shù)呈增高趨勢，使用抗生素對(duì)臨床耐藥菌株的抗菌療效顯著降低，目前耐藥菌株的感染是臨床上比較棘手的難題［3］。金黃色葡萄球菌是創(chuàng)傷性骨髓炎的常見菌之一，由于未能及時(shí)清創(chuàng)、抗菌藥不規(guī)范的使用等各種原因，導(dǎo)致了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA）的產(chǎn)生［4，5］。目前臨床上針對(duì)創(chuàng)傷性骨髓炎的主要致病菌耐藥性的問題，如MRSA 的治療，可使用的抗生素選擇比較狹窄，所以探索一種對(duì)MRSA 起到高效抑菌且無耐藥性的藥物是十分必要的，對(duì)創(chuàng)傷性骨髓炎的治愈也是非常有意義的。

氫氧化鈣（calcium hydroxide）是一種白色粉末狀無機(jī)化合物，在臨床牙科領(lǐng)域，氫氧化鈣［6，7］已經(jīng)成為治療牙髓炎的常見藥物，在水中可以緩慢釋放出鈣離子和具有堿性性質(zhì)的氫氧根離子，形成堿性的環(huán)境，其pH 可高達(dá)12，羥基離子可以有效殺滅牙髓腔中的細(xì)菌，具有無耐藥性、抗菌譜廣等特點(diǎn)，能夠?qū)Σ⊙栏懿课黄鸬胶芎玫囊志饔茫?，9］。目前關(guān)于氫氧化鈣對(duì)MRSA 的抑菌機(jī)制研究相對(duì)較少，本課題組利用氫氧化鈣的強(qiáng)堿性來殺滅MRSA，以期為開發(fā)新型安全、高效、無耐藥性的抗菌藥用于治療創(chuàng)傷性骨髓炎提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

MRSA、氫氧化鈣（溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院提供）；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基11B01、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基11A10（北京三藥科技開發(fā)公司）；麥?zhǔn)媳葷峁埽刂菔锌堤┥锟萍加邢薰荆?/p>

菌液的制備：將菌液接種在固態(tài)瓊脂肉湯培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h 后，挑取一個(gè)菌落接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h，使用前根據(jù)麥?zhǔn)媳葷岱?，利?.9%的生理鹽水將菌液稀釋成0.5 McFarland（細(xì)菌量相當(dāng)于1.5×108cfu/mL），再取適量稀釋后的菌液用無菌的肉湯培養(yǎng)基稀釋至106cfu/mL 備用［10］。

1.2 最小抑菌濃度［11］的測定

利用微孔板稀釋法確定MRSA 的最小抑菌濃度。取一塊96 孔板，1～8 孔每孔加100 μL 氫氧化鈣溶液和100 μL 濃度為106cfu/mL 的MRSA 菌液，使得每孔氫氧化鈣最終的濃度依次為100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5、0.781 25 mg/mL。第9 孔加營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基100 μL 和100 μL 濃度為106cfu/mL 的MRSA 菌液，觀察是否有利于細(xì)菌生長。第10 孔只加200 μL 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，作為空白試驗(yàn)對(duì)照組。將每個(gè)孔充分混合后在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出孔板觀察各組細(xì)菌的上清液渾濁情況，以上清液無渾濁確定為最小抑菌濃度。

1.3 細(xì)菌生長曲線的測定［12］

稱取氫氧化鈣溶于濃度為106cfu/mL MRSA的菌液中，使得混合菌液中的氫氧化鈣的終濃度為8×MIC、MIC、1/4×MIC，未加氫氧化鈣的作為對(duì)照組，在1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h時(shí)分別用酶標(biāo)儀測取各組OD600的數(shù)值。

1.4 熒光顯微鏡分析細(xì)胞膜損傷情況

取對(duì)數(shù)生長期的MRSA 菌液，利用麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)節(jié)菌液的濃度至107cfu/mL，加入氫氧化鈣調(diào)節(jié)濃度至4×MIC，未加氫氧化鈣作為對(duì)照組。在37 ℃的恒溫?fù)u床中共培養(yǎng)1 h 后，分別收集菌液，離心后收集細(xì)菌菌體，PBS 離心洗滌3 次，再用PBS 溶液重懸。使用Calcein-AM/PI 雙染試劑盒進(jìn)行染色，室溫避光孵育15 min，吸取10 μL 樣品固定于載玻片上，用熒光顯微鏡進(jìn)行拍照觀察。

1.5 掃描電鏡觀察MRSA 的形態(tài)［13，14］

分別取兩支10 mL EP 管，第一支EP 管將氫氧化鈣用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基配制成最小抑菌濃度MIC的溶液，第二支EP 管用不加氫氧化鈣的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組，分別與MRSA 在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)1 h，用離心機(jī)（5 000 r/min）離心5 min，棄上清，沉淀物分別用pH 值為7.2 的PBS 洗2 次，用2.5%的戊二醛4 ℃固定過夜。后用梯度乙醇進(jìn)行脫水處理，干燥后噴金，用掃描電鏡拍攝MRSA 的形態(tài)［15］。

1.6 SDS-PAGE 分析菌體蛋白質(zhì)［16-18］

取生長對(duì)數(shù)期的MRSA 進(jìn)行離心，制備OD600＝1.9 的菌液，在菌液中加入氫氧化鈣，使其最終濃度分別為0、MIC、4×MIC，在恒溫培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)1.5 h，離心后收集細(xì)菌，用PBS 緩沖液沖洗3 次，并用超聲破碎儀將細(xì)菌菌體破碎，將破碎液用冷凍離心機(jī)4 ℃，高速離心10 min，取上清液與5×的上樣緩沖液混合煮沸5 min，隨后上樣進(jìn)行SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)，并用凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism 8.0 數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及差異顯著性分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（文中標(biāo)注*：P＜0.05；**：P＜0.01；***：P＜0.001；****：P＜0.000 1）。

2 結(jié)果

2.1 MIC 的測定

96 孔板第6 孔（氫氧化鈣濃度為3.125 mg/mL）上清液為澄清樣，由此確定此濃度為MRSA 的MIC。

2.2 細(xì)菌生長曲線的測定

MRSA 對(duì)不同濃度的氫氧化鈣溶液的生長變化趨勢如圖1 所示，未加氫氧化鈣的空白對(duì)照組在2 h 后，隨著時(shí)間的推移，細(xì)菌的數(shù)量也不斷的增多；而實(shí)驗(yàn)組隨著氫氧化鈣量的增加，細(xì)菌的對(duì)數(shù)生長期也往后延遲。當(dāng)菌液中含有8MIC 的氫氧化鈣時(shí)，細(xì)菌的OD 值并未升高，保持平緩的趨勢，說明氫氧化鈣對(duì)MRSA 有著明顯的抑制作用（圖1）。

圖1 氫氧化鈣對(duì)MRSA 增殖的影響Fig 1 Effect of calcium hydroxide on proliferation of MRSA

2.3 熒光顯微鏡分析細(xì)胞膜的破損情況

對(duì)照組中的圖大部分顯示綠色熒光，紅色熒光相對(duì)較少，說明MRSA 未發(fā)生明顯的細(xì)胞膜損傷；而與氫氧化鈣共培養(yǎng)的細(xì)菌組大部分顯示紅色熒光，幾乎看不到綠色熒光，說明MRSA 的菌體細(xì)胞膜完全破壞，幾乎全部死亡。根據(jù)熒光圖像的分析，氫氧化鈣作用后紅色熒光接近100%。該數(shù)據(jù)表明，氫氧化鈣對(duì)MRSA 菌體具有較強(qiáng)的破壞作用（圖2）。

圖2 MRSA 的熒光顯微照片F(xiàn)ig 2 Fluorescence micrograph of MRSA

2.4 掃描電鏡觀察MRSA 的形態(tài)

通過SEM 觀察氫氧化鈣對(duì)MRSA 的影響，如圖所示，對(duì)照組中未經(jīng)氫氧化鈣處理的細(xì)菌具有清晰而光滑的表面；實(shí)驗(yàn)組用氫氧化鈣處理的細(xì)菌，細(xì)菌表面吸附了氫氧化鈣，并出現(xiàn)了皺縮、變形，甚至發(fā)生表面溶解，細(xì)菌的完整性遭到嚴(yán)重破壞。由此可見，氫氧化鈣可以有效地破壞MRSA 的菌體結(jié)構(gòu)（圖3）。

圖3 MRSA 的掃描電鏡照片F(xiàn)ig 3 Scanning electron micrograph of MRSA

2.5 SDS-PAGE 分析菌體蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，干擾蛋白質(zhì)的合成可以達(dá)到抑菌的目的。因此，可以通過SDSPAGE 研究氫氧化鈣對(duì)MRSA 菌體內(nèi)部蛋白質(zhì)的影響，結(jié)果如圖所示，與0×MIC 組相比，MIC 組、4×MIC 組的蛋白條帶的顏色變得相對(duì)較淺。結(jié)合掃描電鏡的結(jié)果，推測氫氧化鈣嚴(yán)重破壞了MRSA的菌體結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)部的蛋白質(zhì)外漏（圖4）。

圖4 氫氧化鈣對(duì)MRSA 蛋白的影響Fig 4 Effect of calcium hydroxide on MRSA protein

3 討論

創(chuàng)傷性骨髓炎存在骨骼及其軟組織的感染，導(dǎo)致其病原菌難以清除，一直是臨床骨科醫(yī)師難以攻克的難題。金黃色葡萄球菌是創(chuàng)傷性骨髓炎的常見菌之一，由于未能及時(shí)清創(chuàng)、抗菌藥不規(guī)范的使用等各種原因，導(dǎo)致了耐藥菌株（如MRSA）的產(chǎn)生，使得創(chuàng)傷性骨髓炎的治療更加困難［19］。氫氧化鈣具有廣譜抗菌的作用，且來源方便、價(jià)格低廉，因此相關(guān)深入的研究抗菌劑具有較高的社會(huì)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

細(xì)菌主要由細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)等構(gòu)成［20］。大多數(shù)抗生素的抗菌機(jī)理都是破壞菌體的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜、抑制核糖體合成蛋白質(zhì)。β-內(nèi)酰胺類抗生素的作用機(jī)制是抑制細(xì)胞壁黏肽合成酶，從而讓細(xì)菌不能合成細(xì)胞壁粘肽，破壞了細(xì)菌的細(xì)胞壁完整性，菌體失去細(xì)胞壁的保護(hù)作用從而裂解死亡［21］。四環(huán)素作用機(jī)制主要是限制了氨基酸與細(xì)菌內(nèi)核糖核蛋白體的結(jié)合，阻止了蛋白質(zhì)的合成，從而達(dá)到抑菌的效果［22］。在臨床診治過程中，抗菌藥的長期不合理使用，致使細(xì)菌的耐藥性也相應(yīng)地變強(qiáng)［23，24］。而氫氧化鈣是治療牙髓炎的的常見藥物，臨床效果非常顯著［25，26］。根據(jù)掃描電鏡可以看出，氫氧化鈣溶液與MRSA 共培養(yǎng)1 h 后，大部分的菌體出現(xiàn)皺縮、裂解等現(xiàn)象，細(xì)胞膜的完整性遭到了嚴(yán)重破壞。細(xì)菌的熒光染色結(jié)果表明氫氧化鈣對(duì)MRSA 細(xì)胞膜產(chǎn)生破壞作用，從而起到抑制作用，這與掃描電鏡的觀察結(jié)果相符。

綜上所述，氫氧化鈣可以抑制MRSA 的增殖，其最小的抑菌濃度為3.125 mg/mL。抑菌機(jī)制研究結(jié)果表明，氫氧化鈣可以破壞MRSA 的菌體形態(tài)，致使其表面發(fā)生皺縮，甚至破裂，從而達(dá)到抑菌的效果。然而氫氧化鈣對(duì)細(xì)菌作用是否還有其他機(jī)制參與破壞細(xì)菌的DNA 等還需進(jìn)一步驗(yàn)證。此實(shí)驗(yàn)可以為后期開發(fā)新型安全、高效、無耐藥性的抗菌藥用于治療創(chuàng)傷性骨髓炎提供基礎(chǔ)。

作者貢獻(xiàn)度說明：

郭正東：參與實(shí)驗(yàn)，收集整理數(shù)據(jù)及撰寫論文；彭磊：課題設(shè)計(jì)和論文校審；卞陽陽、劉曉遷、張思遠(yuǎn)、王棟、楊?。簠⑴c實(shí)驗(yàn)及管理報(bào)賬。