蔡蕭君，江柏華，陸振華，王 濤，張碧海，王旭玲

（黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍 江哈爾濱 150036）

目前肺纖維化的基礎(chǔ)病理生理學(xué)尚不清楚。據(jù)估計(jì)，每10 萬(wàn)人中有2.9～42.7 人感染此?。?］。從確診開始患者的平均生存期為2～3 年，目前還沒有有效的治療方法［2］。因此，研究該病的發(fā)病機(jī)制對(duì)于控制疾病的發(fā)展和有效藥物研制具有至關(guān)重要的作用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是今年來新興的高通量技術(shù)，基于網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)數(shù)據(jù)共享的飛速發(fā)展和計(jì)算機(jī)應(yīng)用的快速普及，使得本技術(shù)在研究復(fù)雜疾病和復(fù)雜藥物方面得到廣泛應(yīng)用。在疫情期間更是得到廣泛的使用，并得到一系列良好的應(yīng)用結(jié)果［3-10］。

幾千年來，中醫(yī)藥為慢性肺疾病提供了有效的治療方法，包括減輕臨床癥狀、改善肺功能和鍛煉能力。目前對(duì)中藥配方和中藥單體的研究已被證明是治療肺纖維化的有效方法。丹貝益肺方出自黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，由江柏華教授自擬經(jīng)驗(yàn)而成。此方為丹參30 g、黃芪30 g、平貝20 g、黨參20 g、麥冬20 g、桔梗20 g，川芎15 g、桃仁15 g、五味子15 g、補(bǔ)骨脂15 g、地龍各15 g 組成。其對(duì)肺纖維化療效確切［11-26］。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)研究丹貝益肺方對(duì)肺纖維化大鼠的干預(yù)作用，為臨床肺纖維化發(fā)病機(jī)制和丹貝益肺方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 丹貝益肺方成分收集

檢索CNKI 及TCMSP（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）關(guān)于丹貝益肺方的成分信息，以丹貝益肺方構(gòu)成為檢索條目進(jìn)行檢索，并繪制數(shù)據(jù)集，收錄整理相關(guān)丹貝益肺方所含成分的信息。

1.2 活性成分篩選

根據(jù)藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)的常規(guī)理論認(rèn)識(shí)，藥物分子發(fā)揮藥效的前提是可以被吸收進(jìn)入血液，并在體內(nèi)累積達(dá)到一定濃度后隨血液循環(huán)到達(dá)靶器官進(jìn)而發(fā)揮藥效。因此能否被吸收入血是藥物分子發(fā)揮藥效的前提。本研究采用國(guó)際通用的類藥五原則對(duì)中藥所含上千種成分進(jìn)行靶向篩查，以口服利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18 的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)藥物所含化學(xué)成分進(jìn)行篩選。獲得符合標(biāo)準(zhǔn)的潛在藥效成分。

1.3 預(yù)測(cè)靶標(biāo)及靶基因的確定

本部分采用數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和分子對(duì)接驗(yàn)證形式對(duì)丹貝益肺方所含符合標(biāo)準(zhǔn)的成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)。TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//db.idrblab.org/ttd/）與CTD數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//ctdbase.org/）收錄了NCBI 基因數(shù)據(jù)和與疾病相關(guān)的現(xiàn)存已知的靶點(diǎn)信息數(shù)據(jù)，同時(shí)上述數(shù)據(jù)庫(kù)與OMIM 人類在線孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.omim.org/）收錄的全面數(shù)據(jù)基因相關(guān)聯(lián)。本研究基于上述數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)篩選后的活性成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)分析。同時(shí)將靶蛋白引入U(xiǎn)niProt（https：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)追溯上游對(duì)應(yīng)靶蛋白的唯一靶基因名稱，并匯總和整理。

1.4 構(gòu)建基于丹貝益肺方活性成分、靶標(biāo)、疾病的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

將丹貝益肺方活性成分與關(guān)鍵疾病靶點(diǎn)、疾病的數(shù)據(jù)信息帶入Cytoscape3.2.1 軟件，構(gòu)建丹貝益肺方對(duì)肺纖維化干預(yù)作用的活性成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。同時(shí)，為針對(duì)性確定丹貝益肺方的主要活性成分和與肺纖維化相關(guān)的疾病靶標(biāo)，將丹貝益肺方體內(nèi)作用靶蛋白帶入Omicshare（https：//www.omicshare.com/）在線分析平臺(tái)進(jìn)行GO 富集分析，分別進(jìn)行Gene Ontology 的分子功能分析，生物過程分析和細(xì)胞組成分析。聚焦于肺部疾病特別是肺纖維化相關(guān)的關(guān)鍵代謝或生物學(xué)過程。

1.5 肺纖維化相關(guān)靶蛋白互做分析及配體受體分子對(duì)接驗(yàn)證分析

對(duì)獲取到的與肺纖維化相關(guān)的靶蛋白帶入String（https：//string-db.org/）網(wǎng)站，進(jìn)行蛋白互作分析（protein-protein interaction），用以輔助闡明丹貝益肺方對(duì)靶蛋白基靶基因的調(diào)控機(jī)制。同時(shí)從PDB 蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.rcsb.org/）檢索獲取靶蛋白的3D 結(jié)構(gòu)文件，并與之配位的藥物小分子模擬藥物吸收后的體內(nèi)過程進(jìn)行對(duì)接，通過Discovery Studio 2.5 可視化軟件對(duì)上述過程進(jìn)行模擬，以標(biāo)準(zhǔn)化流程對(duì)分子對(duì)接過程的空間位點(diǎn)和結(jié)合能進(jìn)行客觀評(píng)價(jià)，并以結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol 作為對(duì)接可能的最低標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 丹貝益肺方活性成分篩選結(jié)果

通過TCMSP 及CNKI 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索確定丹貝益肺方所含化學(xué)成分，即丹參、平貝、桃仁、地龍、川芎、桔梗、黃芪、黨參、補(bǔ)骨脂、麥冬、五味子。篩選符合OB≥30%、DL≥0.18 的成分進(jìn)行整理。排除相同成分共得到成分72 個(gè)。其中丹參19 個(gè)、平貝20 個(gè)、桃仁33 個(gè)、川芎12 個(gè)、桔梗15 個(gè)、黃芪24 個(gè)、黨參19 個(gè)、補(bǔ)骨脂6 個(gè)、麥冬10 個(gè)、五味子45 個(gè)。由于成分過多，現(xiàn)將基本信息置于表1 中。

表1 丹貝益肺方活性成分信息表Tab 1 Active components of Danbei Yifei formula

2.2 丹貝益肺方活性成分、靶標(biāo)、疾病的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系分析結(jié)果

丹貝益肺方活性成分、靶標(biāo)、疾病的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中涉及133 個(gè)節(jié)點(diǎn)和899 條邊。由Cytoscape 3.2.1 軟件構(gòu)建活性成分、靶標(biāo)、疾病的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖（圖1），其中網(wǎng)絡(luò)異質(zhì)性為0.051，平均相鄰節(jié)點(diǎn)數(shù)目為4.319，路徑長(zhǎng)度2.145，平均網(wǎng)絡(luò)中心度為0.124。這表明丹貝益肺方的藥效成分可能存在一個(gè)成分同時(shí)與多個(gè)體內(nèi)靶蛋白相互作用的現(xiàn)象，也可能存在同意靶蛋白同時(shí)與多個(gè)成分相互作用的現(xiàn)象。由此看出方劑配伍的復(fù)雜性和網(wǎng)絡(luò)分析的直觀性。涉及疾病也與肺纖維化相關(guān)，如支氣管痙攣（組胺引起）、過敏性氣道炎癥、支氣管哮喘、慢性阻塞性肺病、哮喘、炎癥、肺纖維化等。

圖1 丹貝益肺方成分、靶標(biāo)、疾病的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系Fig 1 Network relationship among components of Danbei Yifei formula，target and disease

2.3 富集及靶點(diǎn)相互作用關(guān)系分析結(jié)果

將上述預(yù)測(cè)的與肺纖維化相關(guān)的靶標(biāo)帶入軟件ClueGO 2.3.5 中進(jìn)行GO 富集分析，以通路的Pvalue 小于0.05 為標(biāo)準(zhǔn)篩選出核心條目共計(jì)26 個(gè)，分別描述基因的分子功能、細(xì)胞組分、參與的生物過程。其中生物過程22 條、內(nèi)容為分別為二十醛生物合成過程、多細(xì)胞生物代謝過程、膠原代謝過程、膠原生物合成過程、吞噬功能的正調(diào)節(jié)、cAMP 生物合成過程的負(fù)調(diào)控、環(huán)化酶活性的調(diào)節(jié)、對(duì)銨離子的響應(yīng)、磷脂酶C 激活G 蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)途徑、環(huán)化酶活性的正向調(diào)節(jié)、嗎啡反應(yīng)響應(yīng)、對(duì)銨離子的響應(yīng)、平滑肌收縮、G 蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)途徑，與環(huán)核苷酸第二信使偶聯(lián)、磷脂酶C 激活G 蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)途徑、細(xì)胞對(duì)銨離子的反應(yīng)、唾液分泌、平滑肌收縮的調(diào)節(jié)、腺苷酸環(huán)化酶抑制G 蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體信號(hào)通路、磷脂酶C 激活G 蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體信號(hào)途徑、血管收縮。細(xì)胞組分1 條，內(nèi)容為軸突終端應(yīng)答。分子功能3 條，內(nèi)容分別為神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、G-蛋白偶聯(lián)胺受體活性、磷脂酰肌醇磷脂酶C 活性。上述過程分析見圖2。上述過程大概分為4 類，即G 蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)途徑與環(huán)核苷酸第二信使偶聯(lián)、二十醛生物合成過程、多細(xì)胞生物代謝過程、磷脂酶C 激活G 蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)途徑，見圖3。所有富集分析涉及代謝通路及信號(hào)通路見圖4。

圖2 丹貝益肺方成分、靶標(biāo)、疾病的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系Fig 2 Bar chart of GO analysis of Danbei Yifei formula

圖3 丹貝益肺方干預(yù)肺纖維化的GO 分析結(jié)果Fig 3 GO analysis results of Danbei Yifei formula in the intervention of pulmonary fibrosis

圖4 丹貝益肺方干預(yù)肺纖維化的GO 分析結(jié)果Fig 4 GO enrichment analysis of Danbei Yifei formula in the intervention of pulmonary fibrosis

采用STRING（https：//string-db.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)丹貝益肺方干預(yù)肺纖維化進(jìn)行靶蛋白互做分析。如圖5 所示，通過對(duì)蛋白互做網(wǎng)絡(luò)可視化分析可知，肺纖維化已經(jīng)證實(shí)的核心靶點(diǎn)是花生四烯酸5-脂氧合酶，其在丹貝益肺方的多味中藥的作用靶蛋白群中均有體現(xiàn)，如五味子所含原兒茶酸、丹參所含氨基琥珀酸、黨參所含辣椒素（辣椒素）和2，3-二羥丁二酸、黃芪所含蘆丁、山奈酚、香豆素和槲皮素都同時(shí)對(duì)肺纖維化的核心靶點(diǎn)花生四烯酸5-脂氧合酶有直接作用關(guān)系。除此之外，與肺纖維化相關(guān)的其他疾病如支氣管痙攣（組胺引起）、過敏性氣道炎癥、支氣管哮喘、慢性阻塞性肺病、哮喘、炎癥、肺纖維化等在丹貝益肺方中都有成分靶標(biāo)的相互作用體現(xiàn)。由此推斷丹貝益肺方配伍精當(dāng)和協(xié)同起效的作用機(jī)制。

圖5 丹貝益肺方干預(yù)肺纖維化的體內(nèi)靶蛋白互做關(guān)系圖Fig 5 In vivo target protein interaction diagram of Danbei Yifei formula in the intervention of pulmonary fibrosis

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果顯示丹貝益肺方所含活性成分涉及72 個(gè)，其中直接與肺纖維化疾病靶標(biāo)相關(guān)的成分為五味子所含原兒茶酸、丹參所含氨基琥珀酸、黨參所含辣椒素（辣椒素）和2，3-二羥丁二酸、黃芪所含蘆丁、山奈酚、香豆素和槲皮素。目前針對(duì)肺纖維化的臨床診療手段主要以西藥為主，具有見效快、效果顯著等特點(diǎn)，但同時(shí)也對(duì)患者帶來易復(fù)發(fā)、副作用明顯等弊端。因此，亟待發(fā)現(xiàn)新的對(duì)肺纖維化有效的治療藥物。丹貝益肺方是中醫(yī)臨床應(yīng)用廣泛的有效經(jīng)典方劑，本次采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)其含有的眾多成分都對(duì)肺纖維化有一定的作用療效。其具體的作用機(jī)制如下文闡述。

花生四烯酸5-脂氧合酶激活蛋白又稱5-脂氧合酶激活蛋白，是一種膜結(jié)合蛋白，5-脂氧基酶表達(dá)產(chǎn)生花生四烯酸，并以此調(diào)節(jié)合成的白三烯的量［27，28］，是炎癥和結(jié)締組織重塑的重要介質(zhì)。最近的研究表明，花生四烯酸5 脂氧合酶激活蛋白基因的一些單苷酸多態(tài)性與哮喘和動(dòng)脈粥樣硬化等炎癥疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)［29-32］。中醫(yī)理論認(rèn)為肺與皮毛相表里，因此，肺病與皮膚系統(tǒng)疾病多存在內(nèi)在聯(lián)系。為此，有研究專項(xiàng)研究花生四烯酸5 脂氧合酶激活蛋白多態(tài)性與硬皮病之間的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)假設(shè)花生四烯酸5 脂氧合酶激活蛋白的單核苷酸多態(tài)性可能與硬皮病和/或其主要器官并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。為了解決這一假設(shè)，在歐洲硬皮病試驗(yàn)和研究組的硬皮病患者隊(duì)列中研究了七個(gè)單核苷酸多態(tài)性，它們被證明與其他炎癥疾病的高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)［33］。

腫瘤壞死因子是一種促炎性細(xì)胞因子，在肺纖維化的病理生理學(xué)中被認(rèn)為是一種關(guān)鍵的介質(zhì)［34］?；谄渥鳛榧膊「牧紕┰诜卫w維化治療中的療效，有研究曾以此為靶點(diǎn)，采用英夫利昔單抗阻斷腫瘤壞死因子治療1 例血清陽(yáng)性RA 和肺纖維化患者［35］。