楊苗，孫潔，沈富軍，凌珊珊，吳虹林，張亮，侯蓉，黃炎，岳碧松，張修月*

(1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，成都610065；2.成都大熊貓繁育研究基地，四川省瀕危動物保護(hù)生物學(xué)重點實驗室，成都610081；3.中國大熊貓保護(hù)研究中心，大熊貓國家公園珍稀動物保護(hù)生物學(xué)國家林業(yè)和草原局重點實驗室，四川都江堰623006)

大熊貓屬于食肉目Carnivora，是我國珍稀瀕危野生動物，幼年早期主要以母乳為食，成年卻專性以竹子為食。大熊貓母乳營養(yǎng)豐富，含有大量的蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂肪(Nakamura.，2003)，而竹子屬于低營養(yǎng)高纖維食物。不僅如此，大熊貓消化道短且無盲腸，食物通過時間短，依然保留著肉食性消化系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和遺傳系統(tǒng)特征(鄒興淮等，1998)。因此，大熊貓生長過程中，營養(yǎng)利用與食物代謝及其變化可能與一般的草食動物和肉食動物均不同，具有其獨特性。研究大熊貓生長過程中的營養(yǎng)利用及調(diào)控特征對其保護(hù)具有重要意義。

胰腺是動物重要的消化代謝器官，作為第二大消化腺，兼具內(nèi)分泌和外分泌的雙重功能。胰腺分泌胰液經(jīng)胰導(dǎo)管輸送至十二指腸的過程即為外分泌，胰液中含有的堿性碳酸氫鹽及各種消化酶可中和胃酸，消化糖類、蛋白質(zhì)及脂肪。胰腺的內(nèi)分泌主要依靠內(nèi)部的胰島細(xì)胞產(chǎn)生胰島素、胰高血糖素及生長激素釋放抑制激素和胃泌素等(Leung，2010；Lorberbaum.，2020)。

轉(zhuǎn)錄組水平研究表明，大熊貓在幼年早期的膽固醇代謝、蛋白質(zhì)消化吸收相關(guān)基因高表達(dá)，以滿足其對營養(yǎng)的高需求，有利于出生后的快速生長。碳水化合物代謝、能量產(chǎn)生、氨基酸和蛋白質(zhì)代謝等相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，表明成年大熊貓具有高的代謝水平(Ma.，2020)。但其具體代謝調(diào)控的分子機制有待進(jìn)一步研究。microRNA(miRNA)作為一種非編碼的短序列RNA，已被證實能夠參與多種形式的生命活動，如疾病、免疫、細(xì)胞凋亡、代謝、生殖和發(fā)育等(Ambros，2004；Wienholds & Plasterk，2005)。胰腺組織相關(guān)miRNA的研究表明，一些miRNA可能參與胰腺的發(fā)生，包括miR-124(Baroukh.，2007)，miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-195(Joglekar.，2007)，miR-376、miR-375(Kloosterman.，2007；Joglekar.，2009)和miR-7(Correa-Medina.，2009；Joglekar.，2009)等，這些miRNA的異常表達(dá)會影響胰腺的正常發(fā)育和生理功能(Dumortier & Obberghen，2012)。此外，miRNA可以調(diào)控營養(yǎng)物質(zhì)的代謝過程，包括脂類代謝(Esau.，2006)、氨基酸代謝(Dang，2009；Sengupta.，2020)、糖代謝(Eichner.，2010；Kefas.，2010)等。因此，通過對大熊貓不同年齡階段胰腺組織中差異miRNA的分析，可以了解在大熊貓從幼年到成年的食性轉(zhuǎn)變過程中，miRNA對營養(yǎng)代謝的調(diào)控作用。

本研究探討幼年早期與成年大熊貓胰腺組織中miRNA表達(dá)譜的差異，以了解miRNA對幼年早期和成年大熊貓營養(yǎng)代謝的調(diào)控差異。

1 實驗材料和方法

1.1 樣本采集

大熊貓胰腺組織樣本由成都大熊貓繁育研究基地和中國大熊貓保護(hù)研究中心提供。從4只死亡個體中采集到了4份胰腺樣本，其中，樣本YR和LT為1日齡和6日齡，死亡原因為意外窒息；樣本DN和CC為成年個體，為野外嚴(yán)重受傷，搶救無效死亡。所有樣本的胰腺組織均未見病理改變。采樣工作由專業(yè)獸醫(yī)進(jìn)行，項目研究經(jīng)四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：20190506001)。

1.2 Small RNA提取和測序

對胰腺組織勻漿后，使用Trizol試劑按照說明提取RNA。使用Agilent 2100 Bioanalyzer檢測樣本的完整性和質(zhì)量，RNA完整值(RIN)≥7.5，說明樣本具有較好完整性，可用于后續(xù)small RNA建庫測序。使用Small RNA Sample Pre Kit構(gòu)建文庫，將提取的總RNA過濾后得到 15～40個核苷酸的small RNA。用T4連接酶將small RNA的3’和5’端加上接頭，PCR反轉(zhuǎn)錄擴增得到small RNA文庫。擴增產(chǎn)物純化檢測合格后，由北京諾禾致源科技股份有限公司測序，測序平臺為Illumina HiSeq2000。

1.3 Small RNA數(shù)據(jù)處理

測序得到的原始數(shù)據(jù)需經(jīng)質(zhì)控后才可用于后續(xù)分析，因此對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行以下處理：首先，刪除質(zhì)量值≤5的reads占總讀段>50%的低質(zhì)量序列，去除N(無法確定堿基信息)比例>10%的序列。其次，刪除5’接頭污染的序列和沒有3’接頭和插入片段的序列。修剪3’接頭序列后，去除有poly A、poly T、poly C和poly G的序列。最后，去除過長或過短的序列，保留18～30 nt的序列用于后續(xù)分析。為避免非miRNA序列對結(jié)果的影響，使用BLASTN對非miRNA進(jìn)行注釋。為確保每個small RNA僅分配 1個注釋，使用以下規(guī)則：rRNA>tRNA>snRNA>snoRNA>repeat sequences。刪除非miRNA后，使用miRDeep2將剩余序列比對到大熊貓參考基因組，鑒定保守miRNA及預(yù)測新miRNA。

1.4 保守miRNA差異表達(dá)分析

使用miRDeep2中的quantifier.pl腳本計算每個樣本miRNA的表達(dá)量，得到原始表達(dá)矩陣，導(dǎo)入 R軟件的DEseq2程序包進(jìn)行差異表達(dá)分析。DESeq2的estimateSizeFactors函數(shù)可對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，以消除測序文庫的影響。使用標(biāo)準(zhǔn)化計數(shù)計算每個miRNA的表達(dá)量并采用Benjamini-Hochberg修正方法對值進(jìn)行調(diào)整。以|log(fold change)|≥1且<0.05作為差異表達(dá)miRNA(differentially expressed miRNA，DE miRNA)篩選的閾值。

1.5 預(yù)測靶基因

使用miRTarBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測miRNA的靶基因，該數(shù)據(jù)庫中的miRNA靶基因已通過實驗驗證(Huang.，2020)，可提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.6 miRNA與mRNA的相互作用關(guān)系

為探究miRNA與mRNA之間的靶向調(diào)控關(guān)系，對已有mRNA樣本的表達(dá)量進(jìn)行差異表達(dá)分析。mRNA數(shù)據(jù)來自Ma等(2020)的研究，獲得了該論文中與本研究一致的YR、LT與DN、CC 4只個體胰腺組織的原始表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)分析。將YR、LT與DN、CC的表達(dá)量數(shù)據(jù)同樣采用DEseq2程序包進(jìn)行差異表達(dá)分析，并認(rèn)為符合|log(fold change)|≥1且<0.05篩選條件的基因是顯著差異表達(dá)基因(differentially expressed gene，DEG)。miRNA主要通過使其靶基因沉默表達(dá)來起調(diào)控作用(Huntzinger & Izaurralde，2011)，因此，本研究主要討論與其靶向基因表達(dá)有負(fù)相關(guān)的DE miRNA。

1.7 miRNA靶基因的富集分析

為了解miRNA的功能，分別對鑒定出的DE miRNA的靶向DEG進(jìn)行富集分析。使用g:Profiler將其映射到基因本體論(GO)(http://www.geneontology.org/)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)(http://www.genome.jp/kegg/)數(shù)據(jù)庫，其中，<0.05的條目和通路被認(rèn)為是顯著富集的。

2 結(jié)果

2.1 Small RNA序列特征

測序獲得4只大熊貓胰腺組織的small RNA數(shù)據(jù)，質(zhì)控保留長度18～30 nt的序列后，共獲得 46 357 895 條small RNA序列(圖1)。

圖1 幼年早期(YR、LT)和成年大熊貓(CC、DN)胰腺組織中small RNA分類注釋及其所占比例統(tǒng)計

2.2 保守miRNA的識別和新miRNA的預(yù)測

將miRNA與miRBase數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，共獲得202個保守miRNA和8個新miRNA。其中，保守miRNA在幼年早期大熊貓胰腺組織中較為豐富，在成年大熊貓胰腺組織中較少。202個保守miRNA中，有36個在幼年早期大熊貓胰腺中特有表達(dá)，成年大熊貓胰腺組織未見表達(dá)(圖2)。

圖2 幼年早期(YR、LT)和成年大熊貓(CC、DN)胰腺組織中保守miRNA數(shù)目維恩圖

2.3 幼年早期與成年大熊貓胰腺組織中miRNA的差異表達(dá)

miRNA的差異表達(dá)分析顯示，幼年早期與成年大熊貓胰腺組織中miRNA表達(dá)存在較大差異。共獲得77個DE miRNA，其中，在成年大熊貓胰腺組織中，39個上調(diào)，38個下調(diào)(圖3)。

圖3 DE miRNA的聚類熱圖

2.4 miRNA靶基因預(yù)測

通過miRTarBase數(shù)據(jù)庫的預(yù)測，幼年早期個體中特有的36個miRNA共預(yù)測到3 488個有實驗驗證的靶基因。DE miRNA中，成年大熊貓胰腺組織中39個上調(diào)的miRNA預(yù)測到 5 836個有實驗驗證的靶基因，38個下調(diào)的預(yù)測到4 193個有實驗驗證的靶基因。

2.5 miRNA靶基因功能富集分析

幼年早期個體中特有的36個miRNA的靶基因GO富集分析顯示，幼年早期個體特有的miRNA主要參與了物質(zhì)代謝及合成等生物過程的調(diào)控，如，細(xì)胞代謝過程的調(diào)控(GO:0031323)、生物合成過程的調(diào)控(GO:0009889)和大分子代謝過程的調(diào)控(GO:0060255)等。

DE miRNA的靶基因富集分析顯示，上調(diào)DE miRNA靶基因GO富集結(jié)果多與細(xì)胞、大分子、含氮化合物等代謝的正調(diào)控有關(guān)，KEGG富集結(jié)果多與信號通路和疾病通路等有關(guān)。下調(diào)DE miRNA靶基因GO富集結(jié)果與上調(diào)DE miRNA功能相反，主要參與細(xì)胞、大分子及含氮化合物等代謝的負(fù)調(diào)控，KEGG富集結(jié)果也多與信號通路和疾病通路相關(guān)。

2.6 miRNA與mRNA的相互作用關(guān)系的構(gòu)建

mRNA差異表達(dá)分析顯示，成年大熊貓胰腺組織中獲得661個上調(diào)DEG和691個下調(diào)DEG。將39個上調(diào)DE miRNA對應(yīng)的靶基因與691個下調(diào)DEG取交集處理，得到240個由上調(diào)DE miRNA調(diào)控的下調(diào)DEG(圖4)。將38個下調(diào)DE miRNA對應(yīng)的靶基因與661個上調(diào)DEG取交集處理，得到 138個由下調(diào)DE miRNA調(diào)控的上調(diào)DEG(圖5)。

圖4 上調(diào)DE miRNA調(diào)控的下調(diào)DEG

圖5 下調(diào)DE miRNA調(diào)控的上調(diào)DEG

2.7 DE miRNA-DEG富集分析

為探究交集基因的生物學(xué)功能，對由DE miRNA調(diào)控的DEG進(jìn)行了富集分析。KEGG富集結(jié)果顯示，成年組中上調(diào)DE miRNA調(diào)控的下調(diào)DEG主要富集到蛋白質(zhì)消化吸收等通路(圖6：A)。成年組中下調(diào)DE miRNA調(diào)控的上調(diào)DEG主要富集到疾病、信號通路及氨基酸代謝等相關(guān)通路(圖6：B)。

圖6 DE miRNA調(diào)控的DEG的KEGG富集結(jié)果

2.8 消化代謝相關(guān)基因及調(diào)控基因表達(dá)的miRNA分析

胰腺是重要的消化代謝器官，為探究miRNA對不同年齡大熊貓消化代謝的調(diào)控作用，對參與糖代謝、脂質(zhì)代謝以及蛋白質(zhì)代謝等生物過程的相關(guān)基因及其調(diào)控miRNA進(jìn)行分析。其中，編碼電子傳遞鏈主要蛋白，在成年組中顯著上調(diào)，是miR-1307的靶基因之一。與膽固醇代謝有關(guān)，在成年組中顯著下調(diào)，是miR-1的靶基因之一。蛋白質(zhì)消化代謝相關(guān)基因中，在成年組中顯著下調(diào)，是miR-1的靶基因之一，這些miRNA與它們的靶基因表達(dá)均呈反向負(fù)調(diào)控趨勢。

3 討論

大熊貓的營養(yǎng)代謝一直是遺傳學(xué)家和進(jìn)化生物學(xué)家最感興趣的問題。胰腺是動物重要的消化器官，在消化和營養(yǎng)代謝中起著至關(guān)重要的作用。分析幼年早期和成年大熊貓胰腺組織中miRNA的差異表達(dá)，有助于了解不同年齡階段miRNA對大熊貓食物代謝的調(diào)控作用及其變化規(guī)律。

本文鑒別到幼年早期大熊貓胰腺組織中特有表達(dá)的36個保守miRNA，主要參與合成及代謝的調(diào)控，包括含氮化合物、大分子化合物、核酸代謝過程的調(diào)控，暗示幼年早期大熊貓大分子合成較弱；而在成年大熊貓體內(nèi)，這些miRNA的沉默表達(dá)可能促進(jìn)了蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物大分子的合成過程。對DE miRNA的靶基因進(jìn)行功能分析，發(fā)現(xiàn)成年組中上調(diào)DE miRNA的靶基因?qū)Υ蠓肿雍秃衔锎x過程的調(diào)控是正調(diào)控作用，而成年組下調(diào)DE miRNA的靶基因?qū)@些物質(zhì)合成的生物學(xué)過程主要是負(fù)調(diào)控。這與mRNA分析結(jié)果相吻合，即成年大熊貓胰腺組織中參與這些大分子合成的相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)(Ma.，2020)。

生物體在正常營養(yǎng)代謝過程中，會產(chǎn)生活性氧物質(zhì)(Poyton.，2009)。幼年早期大熊貓胰腺組織中上調(diào)DE miRNA調(diào)控的下調(diào)DEG富集到了活性氧代謝過程的正調(diào)控通路上，說明相較于成年大熊貓，幼年大熊貓活性氧代謝的能力較弱。研究表明，當(dāng)需求能量增加但攝入能量較少時，會激活體內(nèi)脂肪的分解代謝，而造成細(xì)胞的活性氧代謝產(chǎn)物大量增加(張帆等，2020)。這一方面可能由于成年大熊貓代謝水平高(Ma.，2020)，產(chǎn)生的活性氧物質(zhì)多，另一方面可能由于幼年早期大熊貓從母體乳汁中攝入的能量較多，因此體內(nèi)活性氧化物質(zhì)較少，而成年大熊貓以竹子為食，竹子中所含能量物質(zhì)少，體內(nèi)脂肪代謝途徑可能被激活從而產(chǎn)生了較多的活性氧物質(zhì)，提高活性氧物質(zhì)的代謝反應(yīng)以維持機體內(nèi)正常的活性氧化物水平。本研究結(jié)果表明，miRNA參與了成年大熊貓活性氧代謝的調(diào)控作用。

幼年早期組中下調(diào)DE miRNA調(diào)控的上調(diào)DEG富集到了蛋白質(zhì)消化吸收的通路上，而成年組中下調(diào)DE miRNA調(diào)控的上調(diào)DEG富集到了氨基酸代謝的相關(guān)通路上。mRNA分析結(jié)果也顯示，成年大熊貓胰腺組織內(nèi)上調(diào)DEG富集到了與氨基酸和蛋白質(zhì)代謝有關(guān)的通路上，而在幼體大熊貓胰腺組織中的上調(diào)DEG富集到了與蛋白質(zhì)消化吸收有關(guān)的通路上(Ma.，2020)，miRNA結(jié)果與mRNA分析結(jié)果一致。蛋白質(zhì)是幼體生長發(fā)育期間所必需的重要營養(yǎng)物質(zhì)(Wiedmeier.，2011)，蛋白質(zhì)利用率下降會導(dǎo)致哺乳期幼崽生長受限(Aguinaga.，2011)。負(fù)調(diào)控蛋白質(zhì)消化吸收相關(guān)基因的miRNA在幼年早期大熊貓胰腺組織中低表達(dá)，而在成年后高表達(dá)，可能由于乳汁中蛋白質(zhì)含量高，幼年大熊貓對乳汁中蛋白質(zhì)吸收充分，以保證出生后的快速生長。成年大熊貓調(diào)控氨基酸和蛋白質(zhì)代謝相關(guān)基因的miRNA下調(diào)，可能是因為成年大熊貓代謝水平的全面提高(Ma.，2020)。

針對一些DE miRNA的功能分析發(fā)現(xiàn)，它們可以調(diào)節(jié)許多重要的代謝過程，將這些代謝過程分為脂質(zhì)代謝、能量代謝以及蛋白質(zhì)代謝。其中，miR-27a、miR-122和miR-370與脂質(zhì)代謝有關(guān)。miR-27a可以促進(jìn)脂肪分解，釋放出更多的甘油及游離脂肪酸(Wang.，2011)，它在成年大熊貓中的表達(dá)上調(diào)表明了成年大熊貓胰腺組織中的脂質(zhì)代謝較幼年早期個體有提高。miR-122可以參與脂類代謝，Esau等(2006)的研究表明，抑制 miR-122的表達(dá)對小鼠血漿的膽固醇和脂肪酸代謝均有促進(jìn)作用。成年大熊貓體內(nèi)miR-122的表達(dá)相較于幼年早期下降，也說明成年大熊貓體內(nèi)的脂肪酸代謝較幼年早期旺盛。miR-370也在成年大熊貓體內(nèi)表達(dá)下調(diào)。miR-370對miR-122的表達(dá)具有正向調(diào)控作用；此外，miR-370還與miR-122的調(diào)控作用類似，可通過調(diào)控基因的表達(dá)來調(diào)控脂質(zhì)代謝過程(Iliopoulos.，2010)。這些miRNA的差異表達(dá)說明，成年大熊貓體內(nèi)的脂質(zhì)代謝水平高，與 mRNA的研究結(jié)果一致。Li等(2011)研究顯示，包括miR-363、miR-382和miR-494等27個miRNA被預(yù)測為靶向參與氧化磷酸化的基因，且蛋白質(zhì)組學(xué)實驗顯示miRNA與其靶基因呈反向表達(dá)。miR-494、miR-382和miR-363在成年大熊貓中的顯著下調(diào)可能促進(jìn)其能量代謝。此外，ATP合酶是氧化磷酸化過程中一個重要因子，而miR-127可以調(diào)控ATP合酶的亞基——ATP5B，miR-127靶向β-mRNA的3’UTR區(qū)域，并抑制ATP5B翻譯(Willers.，2012)。在成年組中，miR-127的表達(dá)下調(diào)保證了ATP合酶的生成，促進(jìn)了能量代謝。這一結(jié)果也與mRNA研究一致，即在成年大熊貓體內(nèi)的能量代謝較幼年早期旺盛(Ma.，2020)。目前，有關(guān)miRNA對動物體內(nèi)氨基酸代謝過程中的調(diào)控研究較少，在差異表達(dá)的miRNA中僅發(fā)現(xiàn)miR-1對氨基酸代謝有調(diào)控作用。有研究表明，僅攝取10 g必需氨基酸后3 h內(nèi)，miR-1的表達(dá)會出現(xiàn)顯著上調(diào)，從而加速氨基酸代謝與后期蛋白質(zhì)的合成(Mcgregor.，2014)，miR-1在成年大熊貓胰腺組織中的表達(dá)上調(diào)可能與其相關(guān)代謝水平的提高有關(guān)。

綜上，miRNA在大熊貓生長發(fā)育、營養(yǎng)代謝的動態(tài)變化中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，miRNA的差異表達(dá)模式與幼年早期大熊貓對高營養(yǎng)的需求和成年大熊貓胰腺組織中高水平的脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝和能量代謝相一致，這些結(jié)果與mRNA的分析一致。本研究豐富了大熊貓消化代謝的基礎(chǔ)研究，為進(jìn)一步了解大熊貓食性轉(zhuǎn)變與營養(yǎng)利用提供了重要的參考。然而，由于研究對象及組織的特殊性，目前樣本量較小，因此后續(xù)可增加樣本量繼續(xù)開展深入研究，進(jìn)一步證實本研究的結(jié)果。