楊苗，孫潔，沈富軍，凌珊珊，吳虹林，張亮，侯蓉，黃炎，岳碧松，張修月*

(1.四川大學生命科學學院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，成都610065；2.成都大熊貓繁育研究基地，四川省瀕危動物保護生物學重點實驗室，成都610081；3.中國大熊貓保護研究中心，大熊貓國家公園珍稀動物保護生物學國家林業(yè)和草原局重點實驗室，四川都江堰623006)

大熊貓屬于食肉目Carnivora，是我國珍稀瀕危野生動物，幼年早期主要以母乳為食，成年卻專性以竹子為食。大熊貓母乳營養(yǎng)豐富，含有大量的蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂肪(Nakamura.，2003)，而竹子屬于低營養(yǎng)高纖維食物。不僅如此，大熊貓消化道短且無盲腸，食物通過時間短，依然保留著肉食性消化系統(tǒng)結(jié)構和遺傳系統(tǒng)特征(鄒興淮等，1998)。因此，大熊貓生長過程中，營養(yǎng)利用與食物代謝及其變化可能與一般的草食動物和肉食動物均不同，具有其獨特性。研究大熊貓生長過程中的營養(yǎng)利用及調(diào)控特征對其保護具有重要意義。

胰腺是動物重要的消化代謝器官，作為第二大消化腺，兼具內(nèi)分泌和外分泌的雙重功能。胰腺分泌胰液經(jīng)胰導管輸送至十二指腸的過程即為外分泌，胰液中含有的堿性碳酸氫鹽及各種消化酶可中和胃酸，消化糖類、蛋白質(zhì)及脂肪。胰腺的內(nèi)分泌主要依靠內(nèi)部的胰島細胞產(chǎn)生胰島素、胰高血糖素及生長激素釋放抑制激素和胃泌素等(Leung，2010；Lorberbaum.，2020)。

轉(zhuǎn)錄組水平研究表明，大熊貓在幼年早期的膽固醇代謝、蛋白質(zhì)消化吸收相關基因高表達，以滿足其對營養(yǎng)的高需求，有利于出生后的快速生長。碳水化合物代謝、能量產(chǎn)生、氨基酸和蛋白質(zhì)代謝等相關基因表達上調(diào)，表明成年大熊貓具有高的代謝水平(Ma.，2020)。但其具體代謝調(diào)控的分子機制有待進一步研究。microRNA(miRNA)作為一種非編碼的短序列RNA，已被證實能夠參與多種形式的生命活動，如疾病、免疫、細胞凋亡、代謝、生殖和發(fā)育等(Ambros，2004；Wienholds & Plasterk，2005)。胰腺組織相關miRNA的研究表明，一些miRNA可能參與胰腺的發(fā)生，包括miR-124(Baroukh.，2007)，miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-195(Joglekar.，2007)，miR-376、miR-375(Kloosterman.，2007；Joglekar.，2009)和miR-7(Correa-Medina.，2009；Joglekar.，2009)等，這些miRNA的異常表達會影響胰腺的正常發(fā)育和生理功能(Dumortier & Obberghen，2012)。此外，miRNA可以調(diào)控營養(yǎng)物質(zhì)的代謝過程，包括脂類代謝(Esau.，2006)、氨基酸代謝(Dang，2009；Sengupta.，2020)、糖代謝(Eichner.，2010；Kefas.，2010)等。因此，通過對大熊貓不同年齡階段胰腺組織中差異miRNA的分析，可以了解在大熊貓從幼年到成年的食性轉(zhuǎn)變過程中，miRNA對營養(yǎng)代謝的調(diào)控作用。

本研究探討幼年早期與成年大熊貓胰腺組織中miRNA表達譜的差異，以了解miRNA對幼年早期和成年大熊貓營養(yǎng)代謝的調(diào)控差異。

1 實驗材料和方法

1.1 樣本采集

大熊貓胰腺組織樣本由成都大熊貓繁育研究基地和中國大熊貓保護研究中心提供。從4只死亡個體中采集到了4份胰腺樣本，其中，樣本YR和LT為1日齡和6日齡，死亡原因為意外窒息；樣本DN和CC為成年個體，為野外嚴重受傷，搶救無效死亡。所有樣本的胰腺組織均未見病理改變。采樣工作由專業(yè)獸醫(yī)進行，項目研究經(jīng)四川大學生命科學學院倫理委員會批準(批準號：20190506001)。

1.2 Small RNA提取和測序

對胰腺組織勻漿后，使用Trizol試劑按照說明提取RNA。使用Agilent 2100 Bioanalyzer檢測樣本的完整性和質(zhì)量，RNA完整值(RIN)≥7.5，說明樣本具有較好完整性，可用于后續(xù)small RNA建庫測序。使用Small RNA Sample Pre Kit構建文庫，將提取的總RNA過濾后得到 15～40個核苷酸的small RNA。用T4連接酶將small RNA的3’和5’端加上接頭，PCR反轉(zhuǎn)錄擴增得到small RNA文庫。擴增產(chǎn)物純化檢測合格后，由北京諾禾致源科技股份有限公司測序，測序平臺為Illumina HiSeq2000。

1.3 Small RNA數(shù)據(jù)處理

測序得到的原始數(shù)據(jù)需經(jīng)質(zhì)控后才可用于后續(xù)分析，因此對原始數(shù)據(jù)進行以下處理：首先，刪除質(zhì)量值≤5的reads占總讀段>50%的低質(zhì)量序列，去除N(無法確定堿基信息)比例>10%的序列。其次，刪除5’接頭污染的序列和沒有3’接頭和插入片段的序列。修剪3’接頭序列后，去除有poly A、poly T、poly C和poly G的序列。最后，去除過長或過短的序列，保留18～30 nt的序列用于后續(xù)分析。為避免非miRNA序列對結(jié)果的影響，使用BLASTN對非miRNA進行注釋。為確保每個small RNA僅分配 1個注釋，使用以下規(guī)則：rRNA>tRNA>snRNA>snoRNA>repeat sequences。刪除非miRNA后，使用miRDeep2將剩余序列比對到大熊貓參考基因組，鑒定保守miRNA及預測新miRNA。

1.4 保守miRNA差異表達分析

使用miRDeep2中的quantifier.pl腳本計算每個樣本miRNA的表達量，得到原始表達矩陣，導入 R軟件的DEseq2程序包進行差異表達分析。DESeq2的estimateSizeFactors函數(shù)可對數(shù)據(jù)進行標準化處理，以消除測序文庫的影響。使用標準化計數(shù)計算每個miRNA的表達量并采用Benjamini-Hochberg修正方法對值進行調(diào)整。以|log(fold change)|≥1且<0.05作為差異表達miRNA(differentially expressed miRNA，DE miRNA)篩選的閾值。

1.5 預測靶基因

使用miRTarBase數(shù)據(jù)庫預測miRNA的靶基因，該數(shù)據(jù)庫中的miRNA靶基因已通過實驗驗證(Huang.，2020)，可提高分析結(jié)果的準確性。

1.6 miRNA與mRNA的相互作用關系

為探究miRNA與mRNA之間的靶向調(diào)控關系，對已有mRNA樣本的表達量進行差異表達分析。mRNA數(shù)據(jù)來自Ma等(2020)的研究，獲得了該論文中與本研究一致的YR、LT與DN、CC 4只個體胰腺組織的原始表達量數(shù)據(jù)進行后續(xù)分析。將YR、LT與DN、CC的表達量數(shù)據(jù)同樣采用DEseq2程序包進行差異表達分析，并認為符合|log(fold change)|≥1且<0.05篩選條件的基因是顯著差異表達基因(differentially expressed gene，DEG)。miRNA主要通過使其靶基因沉默表達來起調(diào)控作用(Huntzinger & Izaurralde，2011)，因此，本研究主要討論與其靶向基因表達有負相關的DE miRNA。

1.7 miRNA靶基因的富集分析

為了解miRNA的功能，分別對鑒定出的DE miRNA的靶向DEG進行富集分析。使用g:Profiler將其映射到基因本體論(GO)(http://www.geneontology.org/)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)(http://www.genome.jp/kegg/)數(shù)據(jù)庫，其中，<0.05的條目和通路被認為是顯著富集的。

2 結(jié)果

2.1 Small RNA序列特征

測序獲得4只大熊貓胰腺組織的small RNA數(shù)據(jù)，質(zhì)控保留長度18～30 nt的序列后，共獲得 46 357 895 條small RNA序列(圖1)。

圖1 幼年早期(YR、LT)和成年大熊貓(CC、DN)胰腺組織中small RNA分類注釋及其所占比例統(tǒng)計

2.2 保守miRNA的識別和新miRNA的預測

將miRNA與miRBase數(shù)據(jù)庫進行比對，共獲得202個保守miRNA和8個新miRNA。其中，保守miRNA在幼年早期大熊貓胰腺組織中較為豐富，在成年大熊貓胰腺組織中較少。202個保守miRNA中，有36個在幼年早期大熊貓胰腺中特有表達，成年大熊貓胰腺組織未見表達(圖2)。

圖2 幼年早期(YR、LT)和成年大熊貓(CC、DN)胰腺組織中保守miRNA數(shù)目維恩圖

2.3 幼年早期與成年大熊貓胰腺組織中miRNA的差異表達

miRNA的差異表達分析顯示，幼年早期與成年大熊貓胰腺組織中miRNA表達存在較大差異。共獲得77個DE miRNA，其中，在成年大熊貓胰腺組織中，39個上調(diào)，38個下調(diào)(圖3)。

圖3 DE miRNA的聚類熱圖

2.4 miRNA靶基因預測

通過miRTarBase數(shù)據(jù)庫的預測，幼年早期個體中特有的36個miRNA共預測到3 488個有實驗驗證的靶基因。DE miRNA中，成年大熊貓胰腺組織中39個上調(diào)的miRNA預測到 5 836個有實驗驗證的靶基因，38個下調(diào)的預測到4 193個有實驗驗證的靶基因。

2.5 miRNA靶基因功能富集分析

幼年早期個體中特有的36個miRNA的靶基因GO富集分析顯示，幼年早期個體特有的miRNA主要參與了物質(zhì)代謝及合成等生物過程的調(diào)控，如，細胞代謝過程的調(diào)控(GO:0031323)、生物合成過程的調(diào)控(GO:0009889)和大分子代謝過程的調(diào)控(GO:0060255)等。

DE miRNA的靶基因富集分析顯示，上調(diào)DE miRNA靶基因GO富集結(jié)果多與細胞、大分子、含氮化合物等代謝的正調(diào)控有關，KEGG富集結(jié)果多與信號通路和疾病通路等有關。下調(diào)DE miRNA靶基因GO富集結(jié)果與上調(diào)DE miRNA功能相反，主要參與細胞、大分子及含氮化合物等代謝的負調(diào)控，KEGG富集結(jié)果也多與信號通路和疾病通路相關。

2.6 miRNA與mRNA的相互作用關系的構建

mRNA差異表達分析顯示，成年大熊貓胰腺組織中獲得661個上調(diào)DEG和691個下調(diào)DEG。將39個上調(diào)DE miRNA對應的靶基因與691個下調(diào)DEG取交集處理，得到240個由上調(diào)DE miRNA調(diào)控的下調(diào)DEG(圖4)。將38個下調(diào)DE miRNA對應的靶基因與661個上調(diào)DEG取交集處理，得到 138個由下調(diào)DE miRNA調(diào)控的上調(diào)DEG(圖5)。

圖4 上調(diào)DE miRNA調(diào)控的下調(diào)DEG

圖5 下調(diào)DE miRNA調(diào)控的上調(diào)DEG

2.7 DE miRNA-DEG富集分析

為探究交集基因的生物學功能，對由DE miRNA調(diào)控的DEG進行了富集分析。KEGG富集結(jié)果顯示，成年組中上調(diào)DE miRNA調(diào)控的下調(diào)DEG主要富集到蛋白質(zhì)消化吸收等通路(圖6：A)。成年組中下調(diào)DE miRNA調(diào)控的上調(diào)DEG主要富集到疾病、信號通路及氨基酸代謝等相關通路(圖6：B)。

圖6 DE miRNA調(diào)控的DEG的KEGG富集結(jié)果

2.8 消化代謝相關基因及調(diào)控基因表達的miRNA分析

胰腺是重要的消化代謝器官，為探究miRNA對不同年齡大熊貓消化代謝的調(diào)控作用，對參與糖代謝、脂質(zhì)代謝以及蛋白質(zhì)代謝等生物過程的相關基因及其調(diào)控miRNA進行分析。其中，編碼電子傳遞鏈主要蛋白，在成年組中顯著上調(diào)，是miR-1307的靶基因之一。與膽固醇代謝有關，在成年組中顯著下調(diào)，是miR-1的靶基因之一。蛋白質(zhì)消化代謝相關基因中，在成年組中顯著下調(diào)，是miR-1的靶基因之一，這些miRNA與它們的靶基因表達均呈反向負調(diào)控趨勢。

3 討論

大熊貓的營養(yǎng)代謝一直是遺傳學家和進化生物學家最感興趣的問題。胰腺是動物重要的消化器官，在消化和營養(yǎng)代謝中起著至關重要的作用。分析幼年早期和成年大熊貓胰腺組織中miRNA的差異表達，有助于了解不同年齡階段miRNA對大熊貓食物代謝的調(diào)控作用及其變化規(guī)律。

本文鑒別到幼年早期大熊貓胰腺組織中特有表達的36個保守miRNA，主要參與合成及代謝的調(diào)控，包括含氮化合物、大分子化合物、核酸代謝過程的調(diào)控，暗示幼年早期大熊貓大分子合成較弱；而在成年大熊貓體內(nèi)，這些miRNA的沉默表達可能促進了蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物大分子的合成過程。對DE miRNA的靶基因進行功能分析，發(fā)現(xiàn)成年組中上調(diào)DE miRNA的靶基因?qū)Υ蠓肿雍秃衔锎x過程的調(diào)控是正調(diào)控作用，而成年組下調(diào)DE miRNA的靶基因?qū)@些物質(zhì)合成的生物學過程主要是負調(diào)控。這與mRNA分析結(jié)果相吻合，即成年大熊貓胰腺組織中參與這些大分子合成的相關基因表達上調(diào)(Ma.，2020)。

生物體在正常營養(yǎng)代謝過程中，會產(chǎn)生活性氧物質(zhì)(Poyton.，2009)。幼年早期大熊貓胰腺組織中上調(diào)DE miRNA調(diào)控的下調(diào)DEG富集到了活性氧代謝過程的正調(diào)控通路上，說明相較于成年大熊貓，幼年大熊貓活性氧代謝的能力較弱。研究表明，當需求能量增加但攝入能量較少時，會激活體內(nèi)脂肪的分解代謝，而造成細胞的活性氧代謝產(chǎn)物大量增加(張帆等，2020)。這一方面可能由于成年大熊貓代謝水平高(Ma.，2020)，產(chǎn)生的活性氧物質(zhì)多，另一方面可能由于幼年早期大熊貓從母體乳汁中攝入的能量較多，因此體內(nèi)活性氧化物質(zhì)較少，而成年大熊貓以竹子為食，竹子中所含能量物質(zhì)少，體內(nèi)脂肪代謝途徑可能被激活從而產(chǎn)生了較多的活性氧物質(zhì)，提高活性氧物質(zhì)的代謝反應以維持機體內(nèi)正常的活性氧化物水平。本研究結(jié)果表明，miRNA參與了成年大熊貓活性氧代謝的調(diào)控作用。

幼年早期組中下調(diào)DE miRNA調(diào)控的上調(diào)DEG富集到了蛋白質(zhì)消化吸收的通路上，而成年組中下調(diào)DE miRNA調(diào)控的上調(diào)DEG富集到了氨基酸代謝的相關通路上。mRNA分析結(jié)果也顯示，成年大熊貓胰腺組織內(nèi)上調(diào)DEG富集到了與氨基酸和蛋白質(zhì)代謝有關的通路上，而在幼體大熊貓胰腺組織中的上調(diào)DEG富集到了與蛋白質(zhì)消化吸收有關的通路上(Ma.，2020)，miRNA結(jié)果與mRNA分析結(jié)果一致。蛋白質(zhì)是幼體生長發(fā)育期間所必需的重要營養(yǎng)物質(zhì)(Wiedmeier.，2011)，蛋白質(zhì)利用率下降會導致哺乳期幼崽生長受限(Aguinaga.，2011)。負調(diào)控蛋白質(zhì)消化吸收相關基因的miRNA在幼年早期大熊貓胰腺組織中低表達，而在成年后高表達，可能由于乳汁中蛋白質(zhì)含量高，幼年大熊貓對乳汁中蛋白質(zhì)吸收充分，以保證出生后的快速生長。成年大熊貓調(diào)控氨基酸和蛋白質(zhì)代謝相關基因的miRNA下調(diào)，可能是因為成年大熊貓代謝水平的全面提高(Ma.，2020)。

針對一些DE miRNA的功能分析發(fā)現(xiàn)，它們可以調(diào)節(jié)許多重要的代謝過程，將這些代謝過程分為脂質(zhì)代謝、能量代謝以及蛋白質(zhì)代謝。其中，miR-27a、miR-122和miR-370與脂質(zhì)代謝有關。miR-27a可以促進脂肪分解，釋放出更多的甘油及游離脂肪酸(Wang.，2011)，它在成年大熊貓中的表達上調(diào)表明了成年大熊貓胰腺組織中的脂質(zhì)代謝較幼年早期個體有提高。miR-122可以參與脂類代謝，Esau等(2006)的研究表明，抑制 miR-122的表達對小鼠血漿的膽固醇和脂肪酸代謝均有促進作用。成年大熊貓體內(nèi)miR-122的表達相較于幼年早期下降，也說明成年大熊貓體內(nèi)的脂肪酸代謝較幼年早期旺盛。miR-370也在成年大熊貓體內(nèi)表達下調(diào)。miR-370對miR-122的表達具有正向調(diào)控作用；此外，miR-370還與miR-122的調(diào)控作用類似，可通過調(diào)控基因的表達來調(diào)控脂質(zhì)代謝過程(Iliopoulos.，2010)。這些miRNA的差異表達說明，成年大熊貓體內(nèi)的脂質(zhì)代謝水平高，與 mRNA的研究結(jié)果一致。Li等(2011)研究顯示，包括miR-363、miR-382和miR-494等27個miRNA被預測為靶向參與氧化磷酸化的基因，且蛋白質(zhì)組學實驗顯示miRNA與其靶基因呈反向表達。miR-494、miR-382和miR-363在成年大熊貓中的顯著下調(diào)可能促進其能量代謝。此外，ATP合酶是氧化磷酸化過程中一個重要因子，而miR-127可以調(diào)控ATP合酶的亞基——ATP5B，miR-127靶向β-mRNA的3’UTR區(qū)域，并抑制ATP5B翻譯(Willers.，2012)。在成年組中，miR-127的表達下調(diào)保證了ATP合酶的生成，促進了能量代謝。這一結(jié)果也與mRNA研究一致，即在成年大熊貓體內(nèi)的能量代謝較幼年早期旺盛(Ma.，2020)。目前，有關miRNA對動物體內(nèi)氨基酸代謝過程中的調(diào)控研究較少，在差異表達的miRNA中僅發(fā)現(xiàn)miR-1對氨基酸代謝有調(diào)控作用。有研究表明，僅攝取10 g必需氨基酸后3 h內(nèi)，miR-1的表達會出現(xiàn)顯著上調(diào)，從而加速氨基酸代謝與后期蛋白質(zhì)的合成(Mcgregor.，2014)，miR-1在成年大熊貓胰腺組織中的表達上調(diào)可能與其相關代謝水平的提高有關。

綜上，miRNA在大熊貓生長發(fā)育、營養(yǎng)代謝的動態(tài)變化中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，miRNA的差異表達模式與幼年早期大熊貓對高營養(yǎng)的需求和成年大熊貓胰腺組織中高水平的脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝和能量代謝相一致，這些結(jié)果與mRNA的分析一致。本研究豐富了大熊貓消化代謝的基礎研究，為進一步了解大熊貓食性轉(zhuǎn)變與營養(yǎng)利用提供了重要的參考。然而，由于研究對象及組織的特殊性，目前樣本量較小，因此后續(xù)可增加樣本量繼續(xù)開展深入研究，進一步證實本研究的結(jié)果。