對紅 白銳

細(xì)胞自噬 ( autophagy ) 是指通過溶酶體分解細(xì)胞內(nèi)成分的過程。而且細(xì)胞自噬通過降解胞內(nèi)成分和向細(xì)胞提供降解產(chǎn)物，在維持和調(diào)節(jié)細(xì)胞動態(tài)平衡方面起著重要作用。自噬廣泛存在于真核細(xì)胞的病理生理過程中，隨著對自噬研究的不斷深入，其在腫瘤中的作用日漸引起廣泛關(guān)注。骨和軟組織肉瘤是一種間充質(zhì)來源的腫瘤，雖然僅占所有人類癌癥的不到 1%，但惡性程度較高，易致殘。盡管晚期化療和手術(shù)對其有一定改善，但大多數(shù)惡性骨腫瘤的治療方式在過去數(shù)十年間仍然停滯不前，導(dǎo)致患者飽受疾病的折磨，精神壓力、經(jīng)濟(jì)壓力、甚至是摧毀一個個家庭，因此探索惡性骨腫瘤的發(fā)病機制是迫在眉睫的。已知常見的惡性骨腫瘤包括骨肉瘤 ( osteosarcoma，OS )、尤文氏肉瘤 ( ewing sarcoma，ES )、未分化高級別多形性肉瘤 ( undifferentiated high-grade pleomorphic sarcoma，UHPS )、脊索瘤 ( Chordoma )、惡性骨巨細(xì)胞瘤、漿細(xì)胞性骨髓瘤等，確診時往往多伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移且 5年生存率較低。目前用于其早期檢測的腫瘤標(biāo)志物和治療手段十分有限，為突破這一瓶頸，近年來醫(yī)學(xué)研究人員正努力探索細(xì)胞自噬在惡性骨腫瘤中發(fā)揮的作用。

現(xiàn)從信號傳導(dǎo)通路、腫瘤治療中的應(yīng)用等方面簡要探討各類常見惡性骨腫瘤中細(xì)胞發(fā)生自噬的相關(guān)機制，為其臨床診斷和治療靶點提供參考文獻(xiàn)。

一、細(xì)胞自噬

細(xì)胞自噬最早于 1962年用電子顯微鏡在人肝細(xì)胞中觀察到的一種溶酶體降解途徑，是細(xì)胞通過雙層膜包裹待降解物形成自噬體 ( autophagosome )，然后運送到溶酶體形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物，以實現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和細(xì)胞器的更新，因為所有過程均在同一細(xì)胞中完成，所以被稱為自噬。它將受損或過剩的細(xì)胞成分降解為基本的生物分子，然后再循環(huán)回胞質(zhì)，通常被認(rèn)為是在應(yīng)激或營養(yǎng)缺乏等應(yīng)激條件下保護(hù)細(xì)胞的一種促生存機制。

細(xì)胞自噬發(fā)生的過程大致分為四個階段：( 1 ) 起始：胞質(zhì)中首先形成雙層分隔膜，隨后向兩邊延伸成自噬泡；( 2 ) 延伸：自噬泡將需降解的胞質(zhì)物質(zhì)收入泡中，然后封口，稱為自噬體；( 3 ) 成熟：自噬體與內(nèi)涵體融合，形成自噬內(nèi)涵體，或與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體；( 4 ) 降解：自噬溶酶體內(nèi)有許多酶，實現(xiàn)底物的降解。

到目前為止在哺乳動物中有三種不同類型的自噬：巨自噬、微自噬和伴侶介導(dǎo)的自噬。巨自噬是最主要的自噬途徑。有文獻(xiàn)報道，巨自噬發(fā)生機制如下：在細(xì)胞應(yīng)激時，mTOR 被滅活，這使 ULK 復(fù)合體進(jìn)一步被激活。ULK復(fù)合體的激活包括 ULK1 依賴的 Atg13、FIP200 和 ULK1本身的磷酸化。這些磷酸化過程是自噬啟動所必須的。ULK1 進(jìn)一步磷酸化 Ambra1，后者與微管上的 PIK3C3 復(fù)合物相互作用，形成的 Ambra1-PIK3C3 復(fù)合物從微管中釋放并轉(zhuǎn)運到自噬小體形成的主要部位 —— 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，在自噬小體成核過程中，PIK3C3 復(fù)合物產(chǎn)生 PI3P，與DFCP1、Atg2 和 WIPI1 相互作用，并招募其它參與膜伸長的 Atg 蛋白。Atg7 和 Atg10 介導(dǎo) Atg5-Atg12 復(fù)合物的形成，Atg5-Atg12 復(fù)合物隨后與 Atg16L1 結(jié)合，生成 Atg16L1復(fù)合物。LC3 被半胱氨酸蛋白酶 Atg4 裂解成 LC3-Ⅰ。LC3-Ⅰ 由 Atg7、Atg10 和 Atg16L1 復(fù)合物介導(dǎo)，與磷脂酰乙醇胺 ( PE ) 結(jié)合生成 LC3-Ⅱ。自噬體形成后，自噬體外膜與溶酶體膜融合，將自噬體內(nèi)容物釋放到溶酶體腔內(nèi)，自噬體內(nèi)膜被降解，產(chǎn)生的氨基酸 ( AA )、游離脂肪酸( FFA ) 等被釋放回胞質(zhì)中( 圖 1 )。還有一種參與自噬調(diào)節(jié)的相關(guān)因子是 Beclin-1。Beclin-1 是 Beclin-1 VPS34 Ⅲ類磷脂酰肌醇 3 激酶復(fù)合物活性的重要決定因素，在自噬成核過程中 ULK1 復(fù)合物磷酸化并激活 Beclin-1-Vps34 復(fù)合物。Beclin-1 / Vps34 復(fù)合體是一個動態(tài)的多蛋白組裝，在巨自噬過程中是必不可少的。Beclin-1 / Vps34 核心復(fù)合物的活性受 Beclin-1 結(jié)合蛋白的調(diào)節(jié)。而 Bellin-1 通過進(jìn)化保守結(jié)構(gòu)域 ( ECD ) 與 Vps34 相互作用，促進(jìn)自噬。Beclin-1 和 Vps34 的結(jié)合受 Beclin-1 和 Vps34 翻譯后修飾的調(diào)節(jié)。

圖1 巨自噬機制圖 ( 注：實線代表信號傳導(dǎo)過程 虛線代表細(xì)胞器或復(fù)合體 )Fig.1 Mechanisms of macrophage autophagy ( Notice: The solid line represented the signal transduction process and the dotted line represented the organelle or complex )

二、細(xì)胞自噬與惡性骨腫瘤

根據(jù) WHO 骨軟組織腫瘤分類指南以及生物學(xué)潛能的不同將骨腫瘤分為良性、中間型 ( 局部侵襲性或偶見轉(zhuǎn)移型 ) 和惡性三個級別，其中屬于惡性級別的骨肉瘤、ES、UHPS 及脊索瘤等惡性骨腫瘤存在患者確診時已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、5年生存率較低、復(fù)發(fā)率高、預(yù)后較差等一系列治療難題，故本綜述重點討論上述四種常見惡性骨腫瘤中自噬機制，從而探索治療惡性骨腫瘤的新方向。骨肉瘤、ES、UHPS 及脊索瘤的自噬相關(guān)機制研究相對較多，其余惡性骨腫瘤中發(fā)生自噬機制的文獻(xiàn)極少。對上述幾種惡性骨腫瘤中自噬發(fā)生的相關(guān)機制逐一闡述如下。

1. 骨肉瘤的自噬發(fā)生機制：骨肉瘤是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，主要發(fā)生在兒童和青少年，好發(fā)部位包括股骨遠(yuǎn)端 ( 43% )、脛骨近端 ( 23% ) 和肱骨 ( 10% )，對于確診時已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的患者，5年生存率低于 30%。近幾年來對于骨肉瘤由多種藥物強化治療和手術(shù)切除聯(lián)合治療的方案已被證明具有顯著的藥物毒性以及高復(fù)發(fā)率，人們對新治療策略極為迫切。骨肉瘤的細(xì)胞自噬的發(fā)生機制大致如下。

( 1 ) 由上游介質(zhì)激活 Beclin-1 復(fù)合體誘導(dǎo)細(xì)胞自噬：Beclin-1 相關(guān)的自噬相關(guān)關(guān)鍵調(diào)控因子 ( Barkor ) 是一種特異性自噬蛋白，在人骨肉瘤細(xì)胞自噬誘導(dǎo)中起關(guān)鍵作用。在饑餓條件下，敲除 Barkor 基因的人骨肉瘤細(xì)胞自噬能力下降，表現(xiàn)為 LC3-Ⅱ 和自噬小體形成減少。Barkor 的重新表達(dá)增加了自噬。在此證明 Barkor 直接與 Beclin-1 相互作用，并與抗紫外線輻射基因產(chǎn)物 ( UVRAG ) 競爭，UVRAG 是一個與 Vps34 復(fù)合體結(jié)合的額外基因，是自噬的啟動子進(jìn)而可以誘導(dǎo)自噬。

( 2 ) 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤 ( Rb ) 基因誘導(dǎo)細(xì)胞自噬：Rb基因通過抑制 E2 轉(zhuǎn)錄因子 1 ( E2F1 ) 激活骨肉瘤中的自噬，而 E2F1 又下調(diào) Bcl-2，從而激活 Beclin-1 / Vps34 復(fù)合體。有研究表明，Rb 導(dǎo)入 SAOS-2 細(xì)胞后，通過上調(diào)Beclin-1 的表達(dá)誘導(dǎo)自噬。過程中也沒有觀察到 mTOR 磷酸化的變化這也間接說明 Rb 誘導(dǎo)的自噬和 E2F1 介導(dǎo)的Bcl-2 表達(dá)比起 mTOR 途徑與發(fā)生自噬更相關(guān)。

( 3 ) 高遷移率族蛋白 1 ( HMGB1 ) 誘導(dǎo)細(xì)胞自噬：HMGB1 是一種染色質(zhì)結(jié)合核蛋白，通過控制 Beclin-1 /Vps34 復(fù)合物的形成和降低骨肉瘤對化療的敏感性來誘導(dǎo)自噬。

( 4 ) STAT3 誘導(dǎo)細(xì)胞自噬：STAT3 通過抑制蛋白激酶R ( PKR ) 來抑制人骨肉瘤細(xì)胞的自噬，PKR 進(jìn)而抑制真核細(xì)胞起始因子 2α ( eIF2α ) 的磷酸化，這也正是激活自噬所需的重要步驟之一，從而進(jìn)一步影響自噬的發(fā)生。

2. ES 的自噬發(fā)生機制：1921年，詹姆斯·尤文首次描述了 ES，它主要發(fā)生在骨盆、下肢長骨骨干和胸骨。ES 是在兒童和成年人中僅次于骨肉瘤，主要累及的人群是兒童和成人，發(fā)病高峰為 15 歲。約有 25% 的患者有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，最常見的轉(zhuǎn)移部位是肺，其次是骨和骨髓。最近的研究表明 ES 中可能發(fā)生以下幾種自噬機制。

( 1 ) TRIM 誘導(dǎo)細(xì)胞自噬：TRIM 蛋白的特征結(jié)構(gòu)包括一個環(huán) ( Ring ) 結(jié)構(gòu)域 R、一個或兩個盒 ( B-box ) 結(jié)構(gòu)域 B、位于 N-末端的卷曲 ( Coiled coil ) 結(jié)構(gòu)域 CC 和 C-末端具有可變結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)域。研究過程中，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)TRIM3 的一個新功能，即 TRIM3 可以作為 Beclin-1 的 E3泛素連接酶進(jìn)而影響細(xì)胞自噬的發(fā)生發(fā)展。還發(fā)現(xiàn) TRIM3在 ES 組織中的表達(dá)增加，并被 EWS-FLI1 上調(diào)。TRIM3 還能抑制 ES 細(xì)胞的自噬，并直接與 Beclin-1 相互作用，促進(jìn)Beclin-1 蛋白酶體的降解，從而抑制 ES 細(xì)胞的自噬。

( 2 ) 2-甲氧基雌二醇 ( 2-ME ) 誘導(dǎo)細(xì)胞自噬：Lorin等發(fā)現(xiàn)抗腫瘤化合物 2-ME 以 p53 依賴的方式誘導(dǎo)自噬，JNK 激活受 p53 調(diào)控，強調(diào)了 p53、自噬、JNK 激活之間的聯(lián)系，他們還發(fā)現(xiàn) 2-ME 通過激活 JNK 上調(diào) ES 細(xì)胞中損傷調(diào)節(jié)的自噬調(diào)節(jié)器 ( DRAM )。DRAM 是一種 p53靶基因，下調(diào) DRAM 的表達(dá)可以減少 2-ME 誘導(dǎo) ES 發(fā)生自噬。還有研究發(fā)現(xiàn)在饑餓條件下，JNK 的激活導(dǎo)致Bcl-2 的磷酸化，通過破壞 Bcl-2 和 Beclin-1 之間的相互作用來增強自噬。

( 3 ) ES 斷裂點區(qū) 1 ( EWSR1 ) 和 FLI1 ( Friend 白血病病毒整合位點 1 ) 通過上調(diào) ATG4B 誘導(dǎo)自噬：85% 的ES 患者是 t ( 11；22 ) ( q24；q12 ) 染色體易位，從而導(dǎo)致 EWSR1 和 FLI1 基因的融合，形成 EWS-FLI1 病理融合基因。EWS-FLI1 是 ES 中最常見的融合蛋白，它與本綜述介紹的細(xì)胞自噬相關(guān)。在哺乳動物中有四種不同的 ATG4 類似物表達(dá) ( ATG4A、ATG4B、ATG4C 和ATG4D )，其中 ATG4B 對自噬過程至關(guān)重要，對不同形式的 LC3 和同源物具有最廣泛的底物譜。最近有文獻(xiàn)報道，在 ES 細(xì)胞中過表達(dá) EWS-FLI1 可以促進(jìn)自噬，通過自噬的兩個重要標(biāo)志物 p62 ( SQSTM1 ) 的減少和 LC3B-Ⅱ的增加來表現(xiàn)。EWS-FLI1 過表達(dá)顯著上調(diào) ATG4B，ATG4B 也被證明調(diào)節(jié)自噬。EWS-FLI1 誘導(dǎo)了 ATG4B 的表達(dá)，并且觀察到 EWS-FLI1 與 ATG4B 啟動子相互作用，這表明 ATG4B 是 EWS-FLI1 的轉(zhuǎn)錄靶點。此外，ATG4B 的過表達(dá)顯著促進(jìn)了 ES 細(xì)胞的自噬，而沉默 ATG4B 則顯著抑制了自噬。

( 4 ) microRNA ( miRNA ) 誘導(dǎo)自噬：雖然前期研究已經(jīng)證明 ES 中的自噬發(fā)生機制有很多種途徑，但目前公認(rèn)的自噬機制為 microRNA ( miRNA ) 在不同類型的癌癥中調(diào)節(jié)自噬的下游生物學(xué)行為，如啟動、成核、延長和完成。有文獻(xiàn)報道，miR125a 和 miR351 靶向破壞 UVRAG mRNA。眾所周知，抗紫外線輻射相關(guān)基因 ( UVRAG )可能通過與 Beclin-1 相互作用來調(diào)節(jié)自噬，從而影響細(xì)胞自噬。

3. UHPS 的自噬發(fā)生機制：又稱惡性纖維組織細(xì)胞瘤( malignant fibrous histiocytoma，MFH )，在最新的 WHO 骨與軟組織分類中命名為 UHPS，在軟組織肉瘤僅占成人惡性腫瘤的 1%，其中 UHPS 是成人常見的軟組織肉瘤之一，1963年，Ozzello 等首次提出。UHPS 中發(fā)生細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡之間存在著錯綜復(fù)雜的關(guān)系，最近的研究表明，在接受抗腫瘤藥物治療的細(xì)胞中，自噬以一種自衛(wèi)機制發(fā)揮作用，而阻斷自噬可以觸發(fā)凋亡的激活。UHPS 發(fā)生自噬多與 mTOR 蛋白相關(guān)。mTOR 蛋白是一種重要的絲氨酸 / 蘇氨酸激酶，屬于磷脂酰肌醇-3-羥基激酶 ( PI3K ) 相關(guān)激酶家族。Nakamura 等研究中得出結(jié)論，mTOR 抑制劑替西羅莫司對 Nara-H 細(xì)胞 ( UHPS 細(xì)胞株 ) 的增殖有抑制作用，并降低了 mTOR 通路相關(guān)蛋白4E-BP1、p70S6K 的磷酸化水平，另一方面，促進(jìn) Atg12-ATG5 復(fù)合體和 LC3-Ⅱ 的表達(dá)，誘導(dǎo) Nara-H 細(xì)胞自噬。

王少云等通過在 UHPS 患者手術(shù)切除組織中進(jìn)行免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，UHPS 組織中 Beclin1、LC-3 高表達(dá)，發(fā)生機制猜測為 UHPS 細(xì)胞惡性程度高，生長迅速，腫瘤中央?yún)^(qū)發(fā)生缺血缺氧，腫瘤細(xì)胞通過自噬為其生存提供所必須的成分，進(jìn)而保證腫瘤細(xì)胞的存活及腫瘤的進(jìn)展，而抑制 UHPS 細(xì)胞自噬或許可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長，這也與上述抑制自噬的發(fā)生對 UHPS 的治療有很大的幫助相吻合。

4. 脊索瘤中與自噬相關(guān)機制：脊索瘤是一種起源于脊索殘余組織的少見原發(fā)惡性骨腫瘤，好發(fā)部位為骶骨和顱底部。多數(shù)骶骨脊索瘤患者癥狀較隱匿，就診時腫瘤往往體積較大，手術(shù)切除困難，圍術(shù)期風(fēng)險大，術(shù)后復(fù)發(fā)率高。它對化療高度不敏感，而且缺乏有效的治療方法。因此，需要研究新的治療方法。然而，脊索瘤細(xì)胞如何產(chǎn)生細(xì)胞自噬的機制尚不明確，僅有少量文獻(xiàn)報道自噬參與的其它機制，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，自噬反應(yīng)可以支持癌細(xì)胞在不利的微環(huán)境條件下 ( 如化療 ) 的存活、增殖和生長，從而發(fā)生耐藥。Wang 等研究證明化療可以促進(jìn)脊索瘤細(xì)胞的自噬活性，還發(fā)現(xiàn)通過 UPR 的PERK / eIF 2α 臂顯著加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，敲除 KRT 8 可阻斷晚期自噬，使脊索瘤化療增敏。還有研究證明，PAS 糖原染色實驗發(fā)現(xiàn)脊髓瘤細(xì)胞株 MUG-Chor1 和 U-CH2 中含有大量糖原，ELMI 分析顯示在自噬細(xì)胞、自噬小體和空泡中存在糖原，這表明脊索瘤細(xì)胞通過自噬“收獲”了細(xì)胞內(nèi)的糖原儲存。這也更加證明了細(xì)胞自噬可以為腫瘤細(xì)胞在不利環(huán)境下提供能量，從而使腫瘤細(xì)胞存活、增殖和生長。因此阻止細(xì)胞自噬的發(fā)生或許可以成為治療脊索瘤的新方向。

三、細(xì)胞自噬在惡性骨腫瘤治療中的應(yīng)用

惡性骨腫瘤不僅侵襲性高，而且易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。治療方法多為手術(shù)切除、化學(xué)治療、放射治療。雖然一些中藥可以用來減少毒副作用，增強放化療的療效，但治療效果往往達(dá)不到患者、家屬以及骨科醫(yī)師滿意。越來越多的研究表明，自噬在腫瘤細(xì)胞中的功能和作用在不同狀態(tài)下有不同的表現(xiàn)：抑制或促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。這給科研工作者們起到了良好的啟發(fā)作用，例如可以抑制或促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生自噬，提高腫瘤對藥物的敏感性來改善惡性程度較高腫瘤的治療效果，這也提示著細(xì)胞自噬可作為治療的潛在手段之一。

近幾年，已經(jīng)開發(fā)出一些具有抑制自噬藥物，從作用機制上分兩類：早期為阻斷自噬小體形成的 3-甲基腺嘌呤( 3-MA )、LY294002 等；晚期抑制自噬小體溶酶體融合和降解的氯喹 ( CQ )、羥基氯喹 ( HCQ )，CQ 和 HCQ 能夠抑制細(xì)胞保護(hù)性自噬，導(dǎo)致癌細(xì)胞對不同化療藥物的敏感性不同等。還有一些研究證明，核苷類似物吉西他濱可以通過降低 Akt 和 mTOR 的磷酸化和 Beclin-1 / Vps34 復(fù)合物的激活來誘導(dǎo)骨肉瘤的自噬。其它研究證實，一些化療藥物，如順鉑和組蛋白去乙?；?( HDAC ) 抑制劑也可以通過增加線粒體中 ROS 的產(chǎn)生來誘導(dǎo)自噬。

細(xì)胞自噬也可以與其它生物學(xué)行為共同影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，例如凋亡。Nakamura 等發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用 mTOR抑制劑替西羅莫司和自噬抑制劑用 3-MA 可抑制自噬并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。其中聯(lián)合應(yīng)用可以使 MFH 細(xì)胞減少自噬的同時發(fā)生凋亡，從而達(dá)到有效治療 MFH 的目的。

總之，目前原發(fā)性惡性骨腫瘤的治療仍然依賴于手術(shù)、化療、放療和靶向藥物治療，隨著化療及靶向治療藥物的耐藥性及不良反應(yīng)的出現(xiàn)，對于晚期惡性骨腫瘤及復(fù)發(fā)患者的治療仍然處于瓶頸期。細(xì)胞自噬在惡性骨腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用，其作用機制極其復(fù)雜。雖然有文獻(xiàn)報道了部分惡性骨腫瘤中的自噬機制，如骨肉瘤、ES、UHPS、脊索瘤等，但仍有一些惡性骨腫瘤如惡性骨巨細(xì)胞瘤、漿細(xì)胞性骨髓瘤等的自噬發(fā)生機制報道極少，具體機制仍不明確，生物學(xué)作用及意義仍需進(jìn)一步研究。所以，探索自噬相關(guān)信號傳導(dǎo)通路、解析了分子間的相互作用以及明確細(xì)胞自噬發(fā)生機制，探索細(xì)胞自噬是否具有腫瘤發(fā)生的早期監(jiān)測作用是極為重要的，這或許可為惡性骨腫瘤的臨床治療提供新的研究方向，為研發(fā)新靶點藥物提供理論依據(jù)，為人類攻克癌癥提供新的突破。