陳大為， 周天琦， 張培怡， 庹順羽， 賈凌云， 候勤正， 孫 坤

(西北師范大學 生命科學學院，甘肅 蘭州 730070)

黨參 (Codonopsispilosula(Franch) Nannf.) 為桔?？贫嗄晟荼局参?。以根入藥，用于脾肺虛弱、氣血兩虧、體倦無力等病癥治療[1]。甘肅省是我國黨參主產區(qū)之一，其產量占全國總量的70%以上，居全國第一[2]。近年來，隨著市場需求增大，黨參種植面積也隨之擴增。由于長期連作、農藥化肥過量使用，病蟲害發(fā)生日益嚴重，特別是灰霉病的危害已經成為制約甘肅黨參種植產業(yè)發(fā)展的主要障礙之一[3]。黨參灰霉病是由灰葡萄孢 (Botrytiscinerea) 引起的一類真菌性病害，其寄主范圍廣，傳播能力強，侵染速度快，可引起1 400多種植物發(fā)生灰霉病[2,4]。目前，黨參灰霉病的防治主要以化學藥劑和抗病品種并結合一些粗放的農業(yè)措施為主，但是隨著化學藥劑長時間的大量使用，灰霉菌對很多藥劑均產生了不同程度的抗藥性，防治效果日益降低，同時，化學藥劑長期大量使用所引起的環(huán)境污染，危害人畜健康等問題日益加重。鑒于目前防治方法的不足，促使人們尋求黨參灰霉病新的防治措施。因此，具有高效、安全、無污染等特性的生物防治途徑成為當下國內外黨參灰霉病防治研究的新趨勢[5]。芽胞桿菌(Bacillusspp.)具有抗逆能力強、繁殖速率快、無污染等特點，被廣泛用于植物病害防治[6]。黃大野等[7]報道枯草芽胞桿菌 (Bacillussubtilis) NBF809對番茄葉斑病的盆栽防治效果高達73.26%；許麗婷等[8]報道枯草芽胞桿菌XC-1對馬鈴薯黑痣病大田防效為54.51%；王鐵霖等[9]從人參根部分離篩選出一株內生解淀粉芽胞桿菌(Bacillusmyloliquefaciens) RS-3，其對灰霉菌抑菌率達到54.4%。但是，由于受環(huán)境條件的多變性和土壤系統(tǒng)復雜性的影響，生防菌對植物病害的田間防治效果往往低下。而生防菌經過制劑化后，避免了外界因素的影響，成為當下植物病害防治的首選方法[10]。目前，國內外已研制出了大量芽胞桿菌制劑。美國現(xiàn)已登記并投入實際推廣應用的芽胞桿菌制劑有枯草芽胞桿菌 (Bacillussubtilis) 制劑 6 種、解淀粉芽胞桿菌 (Bacillusamyloliquefaciens) 制劑 6 種、地衣芽胞桿菌 (Bacilluslicheniformis) 制劑 2 種、短小芽胞桿菌 (Bacilluspumilus) 制劑 3 種、堅強芽胞桿菌 (Bacillusfirmus) 制劑 2 種、蠟質芽胞桿菌 (Bacilluscereus) 制劑 1 種、巨大芽胞桿菌 (Bacillusmegaterium) 制劑 1 種、蕈狀芽胞桿菌 (Bacillusmycoides) 制劑 1 種[11-12]。而國內在芽胞桿菌制劑研發(fā)中，枯草芽胞桿菌制劑有72 種、多粘類芽胞桿菌 (Bacillusmarinus) 2 種、甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 (Bacillusmethylotrophicus) 4 種[12]?？梢?，芽胞桿菌屬細菌在制劑開發(fā)方面有著巨大的潛力。可濕性粉劑是我國微生物源農藥主要的劑型之一，因其具有有效成分含量高、對環(huán)境友好、生產所需成本低等特點，被廣泛用于葉部病害的防治[13]。因此，可濕性粉劑是灰霉病等葉部病害防治的最佳劑型。本研究以前期從黨參組織中分離的一株對灰霉病有較好抑制作用的內生萎縮芽胞桿菌 (Bacillusatrophaeus) GJW2-1為試驗材料，對其進行制劑工藝優(yōu)化，并對所研制的可濕性粉劑的穩(wěn)定性及盆栽防治效果進行評價，為該菌株商品化開發(fā)及黨參灰霉病的生物防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 萎縮芽胞桿菌 (Bacillusatrophaeus) GJW2-1 和黨參種子 (渭黨 1 號) 均由西北師范大學生命科學學院逆境植物進化與發(fā)育實驗室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)；②營養(yǎng)液體培養(yǎng)基(NB)；③馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (PDA)。

1.1.3 主要試劑與儀器設備 載體：硅藻土、高嶺土、碳酸鈣、凹凸棒土；助劑：分散劑 (木質素磺酸鈉、羧甲基纖維素鈉、聚乙烯醇)，濕潤劑 (十二烷基硫酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉、丁基萘磺酸鈉)，紫外保護劑 (抗壞血酸、β-環(huán)糊精、腐殖酸)。所有載體與助劑購自上海邁瑞爾化學技術有限公司。臺式干燥箱 (DHG-9070A，上海東麓儀器設備有限公司)；超微粉碎機 (WZJ-6B，濟南天方機械有限公司)；超凈工作臺 (SW-CJ-3F，上海滬凈醫(yī)療器械有限公司)；恒溫培養(yǎng)箱 (HPX-II-80，上海新諾儀器集團有限公司)；恒溫培養(yǎng)搖床 (SLSK-2018R，上海世平實驗設備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 載體與助劑篩選 將菌株GJW2-1劃線接種于NA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落接種于裝有50 mL的NB培養(yǎng)基的150 mL三角瓶中，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)3 d，得活菌發(fā)酵液。將載體按5%(質量分數(shù))比例與滅菌的NA培養(yǎng)基混合均勻，制成平板。取1 mL菌株GJW2-1發(fā)酵液 (1.14×109cfu/mL)用無菌水稀釋106倍后，取100 μL稀釋液，均勻涂布于含不同載體的平板上，以不含載體的平板為空白對照，每個處理3次重復，28 ℃培養(yǎng)3 d后統(tǒng)計平板菌落數(shù)，篩選出對該菌沒有影響的載體。將濕潤劑以250 μg/mL[12-13]，分散劑以1 500 μg/mL[14-15]，保護劑以50 μg/mL[14-15]質量濃度的比例與滅菌的NA培養(yǎng)基混合均勻，制成平板。取1 mL菌株GJW2-1發(fā)酵液 (1.14×109cfu/mL)用無菌水稀釋106倍后，取100 μL稀釋液，均勻涂布于含不同助劑的平板上，以不含助劑的平板為空白對照，每個處理3次重復，28 ℃培養(yǎng)3 d后統(tǒng)計平板菌落數(shù)，篩選出對該菌沒有影響的助劑。

1.2.2 載體與助劑最佳配比正交優(yōu)化 利用篩選出的載體和助劑進行4因素3水平正交試驗設計(L9(34))，檢測不同配比對活菌數(shù)的影響[16]，以確定載體和助劑的最佳配比。試驗設計如表1所示。

表1 載體和助劑配比優(yōu)化的正交試驗設計Table 1 Orthogonal experimental design table for optimization of the ratio of carrier and auxiliary agent

1.2.3 可濕性粉劑的加工及指標檢測 將菌株GJW2-1發(fā)酵液 (1.14×109cfu/mL) 按正交優(yōu)化試驗結果與載體和助劑混合均勻，40 ℃干燥箱中烘干，經超微粉碎制成可濕性粉劑。稱取1 g，無菌水稀釋106倍，取100 μL涂布于NA培養(yǎng)基上，重復3次，28 ℃培養(yǎng)3 d后測其活菌數(shù)。

1.2.4 可濕性粉劑質量標準檢測 ①懸浮率、濕潤時間：分別參照國家標準農藥可濕性粉劑懸浮率測定方法GB/T14825-2006[17]和國家標準農藥可濕性粉劑濕潤性測定方法GB/T5451-2001[18]檢測可濕性粉劑懸浮率、濕潤時間。②含水率：稱取10 g樣品放在已經精準測量的培養(yǎng)皿中，105 ℃烘干，測量樣品及培養(yǎng)皿的總重量，根據公式計算含水率：含水率 (%)=((樣品重量+培養(yǎng)皿重量-烘干后總重量)/(烘干后總重量-培養(yǎng)皿重量))×100%。細度檢測參照李姝江等[14]方法進行。③熱穩(wěn)定性：分別稱取1 g可濕性粉劑于20、30、40、50、60、70 ℃條件下水浴30 min，冷卻至室溫，用無菌水稀釋106倍，取100 μL涂布于NA培養(yǎng)基上，重復3次，以未經處理的制劑為對照，28 ℃培養(yǎng)3 d后測定其活菌數(shù)。④酸堿穩(wěn)定性：分別稱取1 g可濕性粉劑用0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L HCl溶液調節(jié)pH值為4、5、6、7、8、9、10，用無菌水稀釋106倍，取100 μL涂布于NA培養(yǎng)基上，重復3次，以未經處理的制劑為對照，28 ℃培養(yǎng)3 d后測定其活菌數(shù)。⑤紫外穩(wěn)定性：分別稱取1 g可濕性粉劑置于紫外燈 (28 W) 下10 cm處，分別照射20、40、60、80、100、120 min后，用無菌水稀釋106倍，取100 μL涂布于NA培養(yǎng)基上，重復3次，以未經處理的制劑為對照，28 ℃培養(yǎng)3 d后測定其活菌數(shù)。⑥儲藏期：將10 g可濕性粉劑在室溫 (25 ℃) 下貯存，每20 d取 1 g，用無菌水稀釋106倍，取100 μL涂布于NA培養(yǎng)基上，重復3次，28 ℃培養(yǎng)3 d后測定其活菌數(shù)。

1.2.5 菌株 GJW2-1可濕性粉劑對黨參灰霉病的盆栽防治效果 ①黨參灰霉菌孢子懸浮液的制備：向活化7 d后的黨參灰霉病菌中加入5 mL無菌水，震蕩30 min即得分生孢子懸浮液原液，用無菌水稀釋至1×106個/mL，備用。②黨參種子發(fā)芽：挑選籽粒飽滿的黨參種子，用2% NaClO溶液表面消毒10 min后，用無菌水漂洗 3～4 次，25 ℃浸種24 h，置于鋪有無菌濕紗布的培養(yǎng)皿中催芽。待黨參種子發(fā)芽后，播種于裝有滅菌蛭石土的花盆 (規(guī)格：高150 mm×直徑200 mm) 中，28 ℃，相對濕度70%，16 h光照/8 h黑暗條件下培養(yǎng)。待幼苗長至六到八葉期時進行后續(xù)防效試驗。③預防試驗：分別取1 g可濕性粉劑，無菌水稀釋100、500、1 000 倍 (20 mL)，噴施黨參植株，以藥液完全布滿葉片而不滴水為度。待葉片上的液體晾干后，接種灰霉菌孢子懸浮液 (20 mL)于各處理植株，以噴施無菌水后接種灰霉菌孢子懸浮液為對照，每個處理3盆，每盆5株，25 ℃保濕48 h， 14 d后記錄發(fā)病情況，并按下述公式計算病情指數(shù)和防治效果。④治療試驗：先將黨參灰霉菌孢子懸浮液 (20 mL) 噴施到黨參幼苗上，25 ℃保濕48 h，分別取1 g可濕性粉劑用無菌水稀釋100、500、1 000倍 (20 mL) 噴施于處理的黨參植株，以先接種灰霉菌孢子懸浮液后噴施無菌水為對照，每個處理3盆，每盆5株， 14 d后記錄發(fā)病情況，并按下述公式計算病情指數(shù)和防治效果。按病斑面積占葉片總面積進行分級。0級:無病癥；1級：10%以下；2級： 10%～20%；3 級：20%～30%；4 級：30%～60%；5 級： 60%以上[19]。病情指數(shù)=∑(各級病葉數(shù)×相對級數(shù)值) /(調查總數(shù)×最高值代表值)×100，防治效果(%)=((對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)) /(對照病情指數(shù)))×100%。

1.2.6 數(shù)據統(tǒng)計與分析 數(shù)據輸入Excel 2007軟件進行統(tǒng)計分析和作圖，并用SPSS 19.0軟件和Duncan氏新復極差法進行多重比較(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 不同載體對菌株 GJW2-1 活性影響

由圖1可知，不同載體均對菌株 GJW2-1活菌數(shù)有一定的影響。其中，硅藻土對菌株GJW2-1 活菌數(shù)影響最小，與對照無顯著性差異 (P>0.05)。因此選用高嶺土用作可濕性粉劑載體。

圖1 不同載體對菌株 GJW2-1活性的影響Fig.1 Effect of different carriers on activity of strain GJW2-1A：硅藻土；B：高嶺土；C：碳酸鈣：D：凹凸棒土；E：無菌水 (對照)。不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著，下同A: Diatomite; B: Kaolin; C: Calcium carbonate; D: Palygorskite; E: Sterile water (CK).The different lowercase letters represent significant differences at 0.05 level，the same as below

2.2 不同助劑對菌株 GJW2-1 活性影響

2.2.1 不同分散劑對菌株 GJW2-1 活性影響 由圖2可知，不同分散劑均對菌株 GJW2-1 活菌數(shù)有一定的影響。其中添加羧甲基纖維素鈉后對菌株 GJW2-1 活菌數(shù)影響最小，為102.33×107cfu/mL，與對照無顯著性差異 (P>0.05)。因此選用羧甲基纖維素鈉用作可濕性粉劑分散劑。

圖2 不同分散劑對菌株 GJW2-1活性的影響Fig.2 Effect of different dispersant on activity of strain GJW2-1A：木質素磺酸鈉；B：羥甲基纖維素鈉；C：聚乙烯吡咯啉酮；D：無菌水 (對照)A: Sodium ligninsulfonate; B: Carboxymethylcellulose sodium; C: Polyvinyl pyrrolidone; D: Sterile water (CK)

2.2.2 不同紫外保護劑對菌株 GJW2-1 活性影響 由圖3可知，不同紫外保護劑對菌株 GJW2-1活菌數(shù)均有一定影響。其中， β-環(huán)糊精對菌株GJW2-1 活菌數(shù)影響最小，為102.00×107cfu/mL，與對照無顯著性差異 (P>0.05)。因此選用 β-環(huán)糊精用作可濕性粉劑紫外保護劑。

圖3 不同紫外保護劑對菌株 GJW2-1活性的影響Fig.3 Effect of different UV Protective agents on activity of strain GJW2-1A：抗壞血酸；B： β-環(huán)糊精；C：腐殖酸；D：無菌水 (對照)A: Ascorbic acid; B: β-Cyclodextrin; C: Humic acid; D: Sterile water (CK)

2.2.3 不同濕潤劑對菌株 GJW2-1 活性影響 由圖 4 可知，不同濕潤劑對菌株 GJW2-1活菌數(shù)均有一定影響。其中，十二烷基苯磺酸鈉對菌株GJW2-1 活菌數(shù)影響最小，為97.33×107cfu/mL，與對照無顯著性差異 (P>0.05)。因此選用十二烷基苯磺酸鈉用作可濕性粉劑濕潤劑。

圖4 不同濕潤劑對菌株 GJW2-1活性的影響Fig.4 Effect of different wetting agents on activity of strain GJW2-1A：十二烷基硫酸鈉；B：十二烷基苯磺酸鈉；C：丁基萘磺酸鈉；D：無菌水 (對照)A: Sodium dodecyl sulfate; B: Sodium dodecyl benzene sulfonate; C: Naphthalenesulfonic acid; D: Sterile water (CK)

2.3 載體與助劑配比的優(yōu)化

由表2可知，載體與助劑不同配比對菌株 GJW2-1活菌數(shù)均有一定影響。其中，按第4組配比后，可濕性粉劑中活菌數(shù)最多，為105.00×107cfu/g。因此，載體和助劑最佳配比為高嶺土35%、羧甲基纖維素鈉4%、十二烷基苯磺酸鈉10%、β-環(huán)糊精3%。

表2 載體和助劑正交試驗結果Table 2 Proportioning optimization result of the carriers and additives in orthogonal test

2.4 可濕性粉劑的指標檢測

參照國家標準對菌株GJW2-1 可濕性粉劑六項主要指標進行檢測，結果可知，活菌數(shù)為1×109cfu/g，懸浮率為81%，濕潤時間為57 s，pH值為7.1，細度為99%，含水量2.03%。六項指標在國家標準范圍內，說明該可濕性粉劑合格，可以用來防治植物病害(表3)。

表3 菌株 GJW2-1 可濕性粉劑性能指標Table 3 Performance index of strain GJW2-1wettable powder

2.5 菌株GJW2-1可濕性粉劑穩(wěn)定性

對菌株GJW2-1可濕性粉劑穩(wěn)定性進行測定，結果表明，菌株GJW2-1可濕性粉劑經不同溫度處理后，其活菌數(shù)隨著溫度的升高而下降，在20～40 ℃范圍內，活菌數(shù)無顯著性差異 (P>0.05)，說明該可濕性粉劑在高溫環(huán)境中能保持一定活性 (圖5A)。紫外穩(wěn)定性測定表明，菌株GJW2-1可濕性粉劑中活菌數(shù)隨著紫外輻射時長的增加而減少，但在120 min時仍能保持一定活性，說明該可濕性粉劑具有較好的紫外耐受性 (圖5B)。酸堿穩(wěn)定性測定表明，隨著pH值的增大，該可濕性粉劑中活菌數(shù)呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，pH 6～8時，其活菌數(shù)無顯著性差異 (P>0.05)，說明pH過高或者過低，均會對該菌劑活性產生一定的影響 (圖5C)。儲藏期測定表明(圖5D)，該可濕性粉劑在0～60 d內活菌數(shù)無顯著性差異 (P>0.05)，60 d 后活菌數(shù)有一定下降，但仍能保持一定活性，說明該可濕性粉劑在120 d內能保持較好的活性。

圖5 菌株GJW2-1可濕性粉劑的穩(wěn)定性測定Fig.5 Determination of the stability of strain GJW2-1 wettable powderA:熱穩(wěn)定性；B:紫外穩(wěn)定性；C:酸堿穩(wěn)定性；D:儲藏期A: Thermal stability; B: Ultraviolet stability; C: pH stability; D: Storage period

2.6 菌株GJW2-1可濕性粉劑對黨參灰霉病盆栽防治效果

盆栽試驗結果表明(表4)，菌株GJW2-1可濕性粉劑對黨參灰霉病有較好的預防效果和防治效果，且預防效果優(yōu)于治療效果，隨著稀釋倍數(shù)的增大，防治效果均表現(xiàn)出遞減的趨勢。稀釋100倍噴施后，菌株GJW2-1可濕性粉劑對黨參灰霉病的預防效果達81.75%，治療效果為71.56%，且各處理間差異性顯著 (P<0.05)。

表4 菌株GJW2-1可濕性粉劑對黨參霉病的盆栽防效試驗Table 4 The control efficiency of strain GJW2-1wettable powder against gray mold of C. pilosula

3 討 論

微生物源農藥在植物病蟲害防控中發(fā)揮著越來越大的作用。但是，由于發(fā)酵工藝和制劑工藝優(yōu)化技術研究薄弱，進入市場投入使用的生物藥劑仍為數(shù)不多。因此，高效生防菌的篩選和工業(yè)化生產以及實際應用等是目前需要迫切解決的問題[20]。生防菌存活力是決定其在實際應用中防效高低的重要因素之一，含有活菌的生物制劑的研發(fā)不僅能夠提高農作物的品質，還能保護自然環(huán)境[21]。因此，在載體和助劑研究中，活菌數(shù)是衡量可濕性粉劑最佳配方的重要因素。本研究采用單因素和正交試驗相結合的方法，以探究載體與助劑對萎縮芽胞桿菌活性的影響，以此來篩選出載體和助劑最佳的配比，最終研制的菌株GJW2-1可濕性粉劑活菌數(shù)高達1×109cfu/g，且各項指標均達到國家標準。載體在可濕性粉劑中占有較大比例，因此載體對制劑的濕潤性和懸浮率具有一定的影響，雖然載體是一種惰性材料，但不同種類的載體對活體微生物的影響較大。本研究通過篩選發(fā)現(xiàn)，高嶺土對菌株GJW2-1活性影響最小，這與李姝江等[14]報道以高嶺土為載體，對解淀粉芽胞桿菌BA-1活性影響最小的結論一致。助劑不僅可以提高防效，還能降低成本[21]。本研究通過單因素篩選最終確定紫外保護劑為 β-環(huán)糊精。據報道 β-環(huán)糊精被廣泛應用于醫(yī)藥、食品、環(huán)境等領域，且對微生物具有良好的紫外保護作用[22]。分散劑為羧甲基纖維素鈉，因其具有良好的分散、懸浮、成膜、持水等性能，被廣泛應用于食品、造紙、涂料等領域[23]。濕潤劑為十二烷基苯磺酸鈉，具有良好的表面活性，親水性較強[24]。菌株GJW2-1可濕性粉劑穩(wěn)定性測定表明，制劑優(yōu)化后，菌株GJW2-1在高溫、酸堿性、紫外光環(huán)境下具有較好的穩(wěn)定性，貯存期較長。因此，該可濕性粉劑可在復雜多變的環(huán)境中，保持較好的活性。在盆栽防效試驗中，該可濕性粉劑防效隨著稀釋倍數(shù)的增加而降低，但是稀釋1 000倍時，防效仍高于60%，說明該可濕性粉劑效果良好，適用于下一階段大田試驗。

本研究經過制劑工藝優(yōu)化所研制的萎縮芽胞桿菌可濕性粉劑，穩(wěn)定性強，且在盆栽試驗中對黨參灰霉病表現(xiàn)出了良好的防治效果，具有實際應用潛力。但本研究研制的可濕性粉劑在田間試驗防效及進一步制劑優(yōu)化等方面還需進一步研究。